来源于海洋褐藻的植物乳杆菌YYS‑06及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种来源于海洋褐藻的植物乳杆菌YYS-06及其应用。

背景技术：

乳酸菌是与人们生活密切相关的一类菌，在人们的生活中扮演着重要角色，如北方人喜欢吃的酸菜、酸奶、奶酪等食品中就含有丰富的乳酸菌。随着对乳酸菌研究的深入，人们发现一些乳酸菌具有许多有益健康的功效。这类乳酸菌称为益生菌。植物乳杆菌是一类具有益生潜力的乳酸菌，被广泛应用于食品和饲料工业中。植物乳杆菌代谢产生的特殊功能的细菌素、有机酸能够抑制各种病原菌。从酸菜、泡菜、水果、蔬菜、腊肠等食品中能够分离到植物乳杆菌。不同植物乳杆菌菌株的性状各有不同。但是，由于盐和酸的耐受力较低等问题，目前存在的乳杆菌在人体内存活率均较低。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一株来源于海洋褐藻的植物乳杆菌YYS-06。

本发明再有一个目的是提供一种来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：一株来源于海洋褐藻的植物乳杆菌，该植物乳杆菌于2016年9月22日保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2016512。

所述的来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途。

优选的是，所述的来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途中，所述药物包括调节肠道健康及降糖功效药物。

优选的是，所述的来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途中，所述食品包括果蔬发酵食品和酸奶发酵食品。

优选的是，所述的来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途中，所述食品还包括直接利用活菌本身制备而成的益生菌粉。

一种利用所述的植物乳杆菌发酵果蔬汁的方法，包括如下步骤：

步骤一、首先取水果蔬菜灭菌后，打浆，利用纤维素酶和果胶酶酶解后过滤得到果蔬滤液，然后向其中加入占所述果蔬滤液质量2％的脱脂乳粉，再然后采用两段均质法均质，第一阶段压力为15MPa，第二阶段压力为25MPa，最后灭菌得到发酵培养基；

步骤二、将植物乳杆菌CCTCC NO.M 2016512接种于所述发酵培养基中，于温度37℃下恒温静置培养24～36h，之后于温度3～5℃下放置2-3h，得到发酵果蔬汁。

优选的是，所述的方法中，所述步骤一中，所述纤维素酶占所述水果蔬菜浆液质量的0.05％，所述果胶酶占所述水果蔬菜浆液质量的0.1％，酶解条件如下：pH5.0、温度45℃条件下，酶解8小时。

优选的是，所述的方法中，所述水果蔬菜包括猕猴桃、苹果、梨、胡萝卜、大蒜、洋葱、南瓜、海带和苦瓜中的任意一种或几种。

优选的是，所述的方法中，以重量份计，所述水果蔬菜包括猕猴桃500份、苹果500份、梨500份、胡萝卜500份、大蒜300份、洋葱200份、南瓜300份、海带100份和苦瓜100份。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明所获得的植物乳杆菌来源于海洋褐藻类植物-海带，作为益生菌对人类健康极有好处，且风味较好；

本发明的植物乳杆菌L.Plantarum YYS-06耐盐、耐酸、耐胆盐，摄入后体内存活率高；

本发明的植物乳杆菌L.Plantarum YYS-06用于发酵果蔬不但有益生作用，且发酵液具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖效果。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明中菌株YYS-06基于16S rDNA序列构建的系统发育树；

图2为本发明中菌株YYS-06发酵液对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一株来源于海洋褐藻的植物乳杆菌，该植物乳杆菌于2016年9月22日保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2016512。保藏名称为植物乳杆菌L.Plantarum YYS-06。

本发明还提供所述的来源于海洋褐藻的植物乳杆菌在药物制备或食品中的用途。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述药物包括调节肠道健康及具有降糖功效的药物。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述食品包括果蔬发酵食品和酸奶发酵食品。

一种利用所述的植物乳杆菌发酵果蔬汁的方法，包括如下步骤：

步骤一、首先取水果蔬菜灭菌后，打浆，利用纤维素酶和果胶酶酶解后过滤得到果蔬滤液，然后向其中加入占所述果蔬滤液质量2％的脱脂乳粉，再然后采用两段均质法均质，第一阶段压力为15MPa，第二阶段压力为25MPa，最后灭菌得到发酵培养基；

步骤二、将植物乳杆菌CCTCC NO.M 2016512接种于所述发酵培养基中，于温度37℃下恒温静置培养24～36h，之后于温度3～5℃下放置2-3h，得到发酵果蔬汁。

在上述方案中，作为优选，所述步骤一中，所述纤维素酶占所述水果蔬菜浆液质量的0.05％，所述果胶酶占所述水果蔬菜浆液质量的0.1％，酶解条件如下：pH5.0、温度45℃条件下，酶解8小时。

在上述方案中，作为优选，所述水果蔬菜包括猕猴桃、苹果、梨、胡萝卜、大蒜、洋葱、南瓜、海带和苦瓜中的任意一种或几种。

在上述方案中，作为优选，以重量份计，所述水果蔬菜包括猕猴桃500份、苹果500份、梨500份、胡萝卜500份、大蒜300份、洋葱200份、南瓜300份、海带100份和苦瓜100份。

实施例一

1材料与方法

1.1实验材料

市售海带

1.2培养基

1.2.1MRS液体培养基

制法

将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH 6.2，分装后121℃高压灭菌15min-20min。

MRS固体培养基：MRS液体培养基加入2％琼脂

1.2.2筛选培养基：MRS固体培养基中加入质量体积比6％的NaCl和2％碳酸钙

1.2.3种子培养基：MRS液体培养基

1.2.4发酵培养基：MRS液体培养基

1.3乳酸菌的筛选

1.3.1乳酸菌的初筛

取市售海带样本5～10g，加入50mL的无菌蒸馏水，匀浆，震荡10min。无菌条件下吸取1mL培养液并用生理盐水稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，每个梯度取0.1mL均匀涂布于筛选培养基上，37℃培养箱厌氧培养24h；选取具有明显透明圈、挑取粘稠及有拉丝的单菌落经划线纯化后分别进行革兰氏染色镜检和接触酶反应实验，共得到12株革兰氏染色呈阳性、接触酶实验呈阴性的菌株。

1.3.2产胞外多糖菌株的复筛

将初筛得到的菌株接种在MRS固体培养基上，活化培养24h后挑取一环分别接入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h；取20mL发酵液，加入1mL质量分数为80％的三氯乙酸溶液，4℃静置12h，离心(4℃、10000×g，20min)，取上清液，去离子水进行透析48h，中间换水一次，以葡萄糖为标准溶液，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。表1可以看出经过复筛对比，菌株YYS-06发酵后EPS产量较高，因此选择YYS-06作为接下来的测试菌株。

表1 菌株菌落特征及EPS产量

2.1菌株鉴定

2.1.1生理生化试验

对筛选得到的菌株YYS-06进行生理生化试验，其革兰氏染色为阳性、接触酶反应阴性，主要测试结果见表2和表3，结合其形态特征，菌株YYS-06符合植物乳杆菌的特性。

表2 菌株YYS-06的部分生理生化性质

注：“-”为阴性反应

表3 菌株YYS-06糖发酵结果

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应

2.1.2菌株YYS-06的16S rDNA序列分析

为进一步确定菌株的种属，提取菌株YYS-06的基因组DNA，经PCR扩增后回收测序，将菌株的16S rDNA核苷酸序列提交GenBank做Blast分析，16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据GenBank中提供的基因序列，基于16S rDNA序列构建系统进化树进行分析，如图1所示，同时，从表4中可以看出与菌株YYS-06同源性最高的为Lactobacillus paraplantarum strain NBRC和L.plantarum JCM 1149等菌株，同源性均为100％，由此可以推断：菌株YYS-06与L.plantarum JCM 1149属于同一个种。依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及16S rDNA部分序列分析，可以鉴定菌株YYS-06为L.Plantarum。该菌株已于2016年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO.M 2016512。

表4 菌株YYS-06 16S rDNA分析结果

3.1乳酸菌耐盐能力测试

在MRS液体培养基中分别加入质量分数为6％、8％、10％、12％、14％的NaCl，将复筛获得的菌株接入种子培养液活化培养24h后，按照体积分数3％的接种量分别接入发酵培养液37℃培养箱厌氧培养24h，无菌取出培养液0.1mL，稀释涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养箱厌氧培养48h后测定活菌数。

根据菌落计数结果研究植物乳杆菌YYS-06对不同NaCl浓度的耐受能力，下表5中可以看出，菌株YYS-06对不同NaCl浓度均有一定的耐受性，活菌数在4.4lg CFU/mL以上，说明其具有较好的耐盐能力，可能与其海带来源有较大相关性。

表5 菌株YYS-06在不同NaCl浓度下的生长情况

3.2乳酸菌耐酸能力测试

用2mol/L盐酸调MRS液体培养基到pH为2.0，3.0，将复筛菌株接入种子培养液活化培养24h后，按照体积分数3％的接种量分别接入到pH值为2.0、3.0的MRS培养液中，37℃培养箱厌氧培养，分别于0h、2h、4h无菌取出培养液0.1mL，稀释涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养箱厌氧培养48h后测定活菌数，计算其存活率。

其中，存活率(％)＝取样时的活菌数/0h的活菌数×100％.

结果见表6，在pH值为2的条件下培养4h，植物乳杆菌YYS-06的存活率为62.4％，说明该菌具有较好的耐酸性。

表6 植物乳杆菌YYS-06的耐酸能力

3.3乳酸菌耐胆盐能力测试

试验设3g/L、5g/L、9g/L共3个胆盐质量浓度，以不加胆盐的培养基为对照。菌株接种于MRS种子培养液中活化培养24h后，按照体积分数3％的接种量分别接入到胆盐浓度为3g/L、5g/L、9g/L的MRS液体培养基中，以不加胆盐的MRS液体培养基为对照，37℃培养箱厌氧培养，分别于0h、2h、4h无菌取出培养液0.1mL，稀释涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养箱厌氧培养48h后菌落计数，计算其存活率。

其中，存活率(％)＝取样时的活菌数/0h的活菌数×100％.

结果见表7，随着胆盐浓度的增加，菌株对胆盐的耐受能力下降。植物乳杆菌YYS-06表现出良好的胆盐耐受性，尤其在胆盐浓度为9g/L的培养基中培养4h，存活率仍能达到80％以上。说明该菌株在人体小肠中能够正常存活并生长繁殖，具有开发成为益生菌的潜力。

表7 植物乳杆菌YYS-06的耐胆盐能力

3.4乳酸菌抗生素敏感性试验

依据各类抗生素作用机制不同，选择了抑制细菌细胞壁合成、细菌核酸合成和蛋白质合成以及抑制细胞质膜的8种常用抗生素。参照美国临床实验室标准化协会公布的琼脂稀释法进行药敏实验。药敏平板中抗生素的终浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，以未添加抗生素的平板为对照，每个浓度测量两次。

表8可以看出YYS-06对氨苄青霉素及链霉素最为敏感，对不同种类的抗生素均表现出较好的药敏性，由于这些抗生素均为常规用药，因此药敏性试验对菌株的进一步开发应用具有实际的指导性意义。

表8 植物乳杆菌YYS-06对各抗生素的药敏性

3.5发酵上清液α-葡萄糖苷酶抑制能力测试

采用PNPG-紫外分光光度法测定发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，分别取发酵时间为16h、24h、32h、40h及48h的发酵上清液进行测试，每个样品重复三次取平均值。在0.1mL的样品中加入0.4mLpH6.8的磷酸盐缓冲液，对照组用缓冲液替代样品，再加入0.1mL葡萄糖苷酶溶液，37℃水浴保温15min，然后加入0.4mL底物PNPG溶液，37℃水浴反应15min后加入2mL0.5mmol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，在405nm波长下测定其吸光值。

其中：A_Control为空白不加样品的吸光度；A_Test为加样品的吸光度。

由图2可知，随着发酵时间的增长，发酵液上清对α-葡萄糖苷酶抑制作用逐渐增强，在发酵48h时达到29.4％，说明菌株YYS-06能够产生具有降血糖能力的活性物质，可用于开发具有降糖功效的产品。

实施例二

植物乳杆菌YYS-06在酸奶发酵中的应用

挑取一环斜面保藏的实施例一分离筛选得到的菌株接入脱脂乳培养基中，40℃恒温静置活化24h。脂脂乳培养基包含：脱脂乳120g，蒸馏水定容至1L，pH自然，115℃，20min。取5ml植物乳杆菌YYS-06菌体种子液无菌条件下接种于含100ml鲜牛奶(含8％蔗糖，于50-60℃，压力10-15MPa条件下均质后进行高温巴氏杀菌，杀菌条件为：90～95℃，5min)的发酵瓶中，置于酸奶机中40℃静置发酵8～16h,中间每间隔2h取样分析其感官、酸度及多糖的含量情况。结果显示，发酵时间8h时牛奶已经凝固，而且口味最佳，此时。得到的酸奶制品质地黏稠，口感顺滑，有明显的酸奶清香，酸味浓厚，乳清析出较少，用滴定法(国标法GB5409-85)对酸奶制品进行酸度检测，酸度检测结果为80.22±0.41(°T)，采用苯酚-硫酸比色法测定酸奶中的多糖含量为149.3mg/L，比未发酵的奶制品多糖含量(88.1mg/L)明显提高。

实施例三

植物乳杆菌YYS-06在发酵果蔬汁中的作用

1、材料

1.1主要材料

市售猕猴桃、苹果、梨、胡萝卜、大蒜、洋葱、南瓜、干海带、苦瓜

1.2菌株

实施例一分离筛选得到的植物乳杆菌YYS-06

1.3种子培养基

脱脂乳培养基：脱脂乳120g，蒸馏水定容至1L，pH自然，115℃，20min。

2、方法

2.1原料预处理

称取猕猴桃500g、苹果500g、梨500g、胡萝卜500g、大蒜300g、洋葱200g、南瓜300g、海带100g、苦瓜100g。将各种水果蔬菜在清水中洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌，无菌条件下晾干。其中，大蒜、柚子去皮，干海带洗净后放入2％的绿茶水中浸泡2h脱腥，所有果蔬均用打浆机打浆。

2.2酶解过滤

将上述步骤处理过的果蔬浆混匀，加入质量分数为0.05％的纤维素酶和0.1％的果胶酶，调节pH至5.0，45℃条件下，酶解8小时；将酶解液过滤除渣得到滤液。

2.3调配均质

以果蔬滤液的质量计，以2％的比例加入脱脂乳粉，搅拌均匀，采用两段均质法，先低压15MPa，后高压25MPa，使果蔬颗粒的粒径为2～3μm。

2.4发酵培养基的制备

将调配均质后的果蔬汁105℃条件下灭菌10min，冷却到室温。

2.5种子液制备

挑取一环斜面保藏的菌株接入脱脂乳培养基中，37℃恒温静置培养24h。

2.6果蔬发酵

将活化好的植物乳杆菌种子液以6％的接种量接入到发酵培养基中，37℃恒温静置培养24～36h，发酵结束后在3～5℃的冰箱中放置2-3h进行后熟处理。

2.7分装、冷藏

灌装到相应容器，送至冷库中冷藏。

本实施例制备的产品含糖量低，酸度适中，有果蔬发酵后的特殊芳香，长期饮用具有调节肠道消化、增加免疫力及降低血糖的功能。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的植物乳杆菌的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门元之道生物科技有限公司

<120> 来源于海洋褐藻的植物乳杆菌YYS-06及其应用

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1355

<212> DNA

<213> L. Plantarum YYS-06

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