一株荧蒽降解菌及其应用的制作方法

背景技术：

多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)是广泛存在于河道底泥沉积物中的一类典型持久性有机污染物(pops)，具有致癌、致畸变和致突变作用，是世界各国优先控制的一类污染物。其中，四环以上的pahs被称为高分子量多环芳烃(h-pahs)，h-pahs具有更强的毒性和难降解性，是治理pahs污染的重点和难点。大量研究表明，荧蒽是河道底泥中最常见的h-pahs类污染物，据有较高的检出频率和丰度。为此，实现河道底泥中荧蒽的有效去除对于治理河道底泥中h-pahs污染具有重要借鉴意义。

微生物修复技术是在人为优化的条件下，利用微生物的生命代谢活动，来分解土壤或沉积物中的污染物，以修复受污染的环境。微生物修复中可以用来接种的微生物从其来源可分为土著微生物、外来微生物和基因工程菌；从微生物种类类型可分为细菌和真菌。目前已从土壤中分离到的能降解pahs的微生物有假单胞菌属、黄杆菌属、诺卡氏菌属、弧菌属、解环菌属等，但是并没有针对河道底泥中pahs污染的高效降解菌。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种筛选自河道底泥中的荧蒽高效降解菌及其应用。

本发明提供的一种荧蒽降解菌，该真菌为青霉菌属(penicilliumpurpurogenumsp.)dtq-hk1。

本发明提高的产紫青霉菌属(penicilliumpurpurogenumsp.)dtq-hk1已于2016年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：cgmccno.13181。

本发明提供的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的形态特征如下：菌株在lb固体培养基上于28℃下恒温培养先呈淡黄色后期呈灰绿色的毛絮状菌落，背面呈淡黄色，直径约为2-3mm，显微镜下和扫面电镜可观察到菌株有菌丝，头部有1μm左右圆形孢子结构。

本发明提供的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1从受荧蒽污染的河道底泥中筛选分离而来。

本发明的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1作为菌剂应用于受荧蒽污染的河道底泥中。

本发明的有益效果在于：penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的筛选分离方法简单，分离出的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1能够有效降解荧蒽，有利于修复荧蒽污染的河道底泥。

附图说明

图1(a)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1培养基上菌落形态图；

图1(b)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1显微镜下菌种形态图；

图1(c)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1扫描电镜下菌种形态图；

图2是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的系统发育树；

图3是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生长曲线；

图4是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1在荧蒽-无机盐培养液中的对荧蒽的降解效率图；

图5是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1投加到荧蒽污染底泥中在菖蒲及麦芽糖共同作用下对荧蒽的降解效果图。

具体实施方式

实施例1荧蒽高效降解菌的筛选及鉴定

取实验待测底泥进行荧蒽降解菌的分离培养。首先，取5g底泥接种于50ml含荧蒽的msm培养基中，在120rpm摇床避光条件下室温培养两周，移取1ml土壤富集液于新的含荧蒽的无菌msm培养基中培养一周后重复稀释，进行连续四阶段的驯化富集培养过程。培养结束后，用接种环取菌液在含有荧蒽的lb固体培养基上进行划线分离，室温下恒温恒湿培养箱中培养3-5d，挑取不同形态的成型菌落分别接种到新的lb固体培养基上进行纯化，重复划线分离，直至固体培养基上形成的菌落形态一致。将生长速度较快的纯化菌种接种到含有荧蒽的msm培养基中摇瓶培养，并在显微镜和扫描电镜下对菌种形态进行观察，结果如图1(a)(b)(c)所示。

其中无机盐培养基(msm培养基)的配制方法如下：称取硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.8g，磷酸氢二钾0.2g，氯化镁0.05g，氯化钙0.05g，氯化铁0.01g，氯化钠5g溶于1l超纯水，用naoh调节ph至7.0±0.5，于121℃湿式高压灭菌20min。

菌株的鉴定：

首先取5ml纯菌培养液，经10000rpm离心，弃去上清液，加入200μl缓冲液ga混悬菌落，加入20μlproteinasek溶液混匀，完成菌株dna的提取过程。然后以提取到的菌株dna为模板，进行pcr扩增及测序。pcr仪选用的是abi272。采用通用引物itsl(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)，pcr反应体系为：2xtaqmix10μl，primerf(20pm)1μl，primerr(20pm)1μl，template1μl，灭菌蒸馏水定容至20μl。菌株icdp1进行pcr扩增16srdna序，pcr反应条件为:94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35次循环，72℃延伸10min，于4℃下保存。菌株dtq-hk1进行pcr扩增its序，pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，此过程进行35次循环。最后72℃延伸10min，置于4℃条件下保存。利用引物对菌株进行pcr扩增its得到目的dna片段，得到的基因序列如下表seqid所示。

对得到的基因序列进行分析，测序结果在ncbi网站上用blast程序进行分析，与genbank中核酸序列进行序列同源性比较。结果显示菌株dtq-hk1的its基因序列与多种penicilliumsp.(青霉菌属)具有高度同源性。从genbank基因数据库中下载与菌株dtq-hk1序列相似性大于97％的及部分模式菌种的基因序列，通过clustalx软件进行聚类分析后，利用mega5.0软件以neighbor-joining计算方式生成系统发育树如图2。从图2可以看出，菌株dtq-hk1与penicilliumsp.有99％的同源性，可以确定菌株dtq-hk1为青霉菌属，并且在青霉菌属中与penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1有99％的同源性。因此可以认定该菌株为penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1。

实施例2荧蒽的降解实验

在得到penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1后，对penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生长曲线进行测定，在无菌条件下分别在培养的第1,3,5,7,14,21,35,42d对体系中脂磷的含量进行测定，得到菌种penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生长曲线如图3。由菌种生长曲线可以发现在培养初期微生物生长速率较快，而在培养21d后，菌种生长速度明显下降，在培养35d后菌种进入衰亡期，生物量呈下降趋势。

在对菌种penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生长曲线进行测定后，进一步研究菌种penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1对荧蒽的降解效果。首先，移取2ml培养7d后od600＝1的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1菌株至50ml荧蒽浓度为50mg/l的msm培养基中，于28℃恒温条件下避光振荡培养42d，每隔7d取样一次测定其中荧蒽的含量，做三组平行试验，并设空白对照组。得到的荧蒽降解率随时间变化的曲线如图4所示，从图4可以看出经过42d的培养，培养基内荧蒽浓度由50mg·l^-1降至23.89mg·l^-1，penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1对荧蒽的降解率可以达到52.22％，同时，可以看出在培养前21d菌种对荧蒽降解率提高比较快，21d后菌种对荧蒽的降解率趋于平缓，降解效果变化不明显。

其中荧蒽提取测定方法：取50ml待测样品于250ml的分液漏斗中，分三次向其中加入50ml的乙酸乙酯，每次震荡3min，收集三次萃取提取液，过无水硫酸钠去除水分后旋转蒸发浓缩至2ml左右，加入20ml甲醇(不能用一定量这样不确定的词语，要有具体数量或写明到达的要求)进行溶剂替换后于50ml容量瓶定容，取1.5ml溶液于样品瓶中hplc测定。hplc工作条件：色谱柱为venusilmpc18(150mm*4.6mm,5μm)，紫外检测器，检测波长324nm，柱温30℃，流动相为甲醇，流速1ml·min^-1，进样量为20μl。

实施例3荧蒽高效降解菌对污染底泥的修复实验

试验底泥的获取过程如下：取天津工业大学泮湖表层沉积物(0-10cm)，剔除底泥内的碎石、植物残体等杂物，在阴凉处风干，取风干土样研磨过10目筛子，并测定其中荧蒽含量为0.97mg/kg(干土)。由于泥样中荧蒽含量较低，为了试验观察向土样中投加荧蒽，使底泥中荧蒽浓度最终为100mg/kg(干土)。投加方法：先称取一定量风干土样研磨过100目筛后平铺于搪瓷盘内，称取准确投加量的荧蒽用二氯甲烷溶解后转移到有土样的搪瓷盘内，在通风橱中用玻璃棒不断搅拌，使荧蒽在土样中分布均匀，待二氯甲烷完全挥发后，把染荧蒽的干土样缓慢加入到湿样中，并将湿样搅拌均匀，暗处熟化一周备用。

采用实验室盆栽方式，将处理好的底泥干样装入2l塑料量杯中，加水使泥上保有3～5cm水层，以模拟河道底泥天然状态。在底泥中种植菖蒲并投加penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1和麦芽糖，实验培养期为3个月，每15d取样一次测定体系中荧蒽的含量。结果如图5所示，可以看出在菖蒲根系投加40mlod600＝2的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1和90mg麦芽糖培养3个月后后，菖蒲-penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1-麦芽糖共同作用体系对荧蒽的去除效果可达到100％。

其中荧蒽提取方法如下：首先采集泥样在阴凉处风干后用研钵将干土磨碎，过80目筛子后每份称取5.00g过筛干泥样，取上述处理好的干泥样于离心管中，向其中投加20ml二氯甲烷：正己烷(v:v＝1:1)后，放置于超声仪中超声30min，再取离心管放置到离心机中2000rpm离心3min，收集上清液于平底烧瓶中，上述过程重复三次。将三次收集到的上清液进行浓缩净化定容后，hplc测定其中荧蒽的含量。

seqidno:1

penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的its基因序列：

tctcgcggccacctcccacccttgtctctatacacctgttgctttggcgggcccaccggggccacctggtcgccgggggacgcacgtccccgggcccgcgcccgccgaagcgctctgcgaaccctgatgaagatgggctgtctgagtacgatgaaaattgtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggtgtggtccccccggggacctgcccgaaaggcagcggcgacgtccgtctggtcctcgagcgcatggggctctgtcactcgctcgggaaggacctgcgggggttggtcaccaccaca

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penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的its基因序列：

tctcgcggccacctcccacccttgtctctatacacctgttgctttggcgggcccaccggggccacctggtcgccgggggacgcacgtccccgggcccgcgcccgccgaagcgctctgcgaaccctgatgaagatgggctgtctgagtacgatgaaaattgtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggtgtggtccccccggggacctgcccgaaaggcagcggcgacgtccgtctggtcctcgagcgcatggggctctgtcactcgctcgggaaggacctgcgggggttggtcaccaccaca

引物

itsl(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)

its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)