一株人苍白杆菌FX02菌株及其在废水脱氮中的应用的制作方法

本发明涉及微生物脱氮
技术领域：
，具体地，涉及一株人苍白杆菌fx02菌株及其在废水脱氮中的应用。
背景技术：
：针对水环境质量的日益恶化，水体富营养化现象日趋严重的现象，高效、快速去除水中氮素是当今水污染防治领域的一个重要课题。传统的生物脱氮技术是硝化和反硝化两个过程相互独立，导致了脱氮过程的不连续性和效率低下，大大限制了传统生物脱氮技术的应用和发展。当前，一些新型生物脱氮技术的开发和应用则为生物脱氮提供了新的思路，许多新型脱氮菌相继被发现，如alcaligenesfaecalis、thiosphaerapantotropha和pseudomonassp.等，它们具有生长速率快、耐高有机负荷、环境适应性强等优点，使得同步硝化反硝化能在同一反应器中进行，对于减小反应器容积，加快整个反应过程，降低运行成本具有明显的优势，因而被广泛受到人们的重视。研究还发现，一些异养硝化菌同时又具有好氧反硝化的能力，使硝化和反硝化同时进行成为可能，这极大提高了它在污水处理方面的应用价值，也为废水生物脱氮的技术研究提供了理论支持。目前文献报道的异养硝化-好氧反硝化菌的筛选方法主要有以下三种：（1）间歇曝气法：该方法利用好氧反硝化菌可同时利用硝态氮和氧气作为电子受体的特性，频繁转换好氧/缺氧环境，淘汰完全好氧细菌和厌氧细菌，在竞争中使好氧反硝化菌保持优势地位。（2）酸碱指示剂法：该方法利用反硝化过程产碱的特性，在培养基中加入溴百里酚蓝(btb)指示剂，指示菌落周围的ph值，挑选ph值发生变化的菌落作为初筛菌株，以得到目的菌株。（3）极限稀释法：该方法通过稀释作用，将本来不占优势的好氧反硝化菌分离出来，再反复进行稀释以致筛选出目标菌株。分离出兼具异养硝化-好氧反硝化功能的菌株对提高污水的脱氮效率具有重要的实际意义。技术实现要素：本发明为了丰富脱氮菌株资源库，提供一株人苍白杆菌fx02菌株，该菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，使硝化和反硝化同时进行成为可能，在污水处理方面具有极大的应用价值。本发明的另一个目的是提供一株人苍白杆菌fx02菌株在废水脱氮中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一株人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)fx02菌株，所述菌株于2016年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno：60062，分类命名为人苍白杆菌(ochrobactrumanthropic)。本发明的人苍白杆菌fx02菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，因此，该菌株可同步去除氨氮和cod，因此，本发明要求保护人苍白杆菌fx02菌株在废水脱氮中的应用。本发明更进一步保护人苍白杆菌fx02菌株在同步去除废水中氨氮和cod的应用。一种废水脱氮的方法，包括如下步骤：将人苍白杆菌fx02菌株按照5～10％的接种量接种到废水中，在25～35℃、100～150r/min的条件下处理废水24～72h；所述人苍白杆菌fx02菌株于2016年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno：60062。优选地，将人苍白杆菌fx02菌株按照10%的接种量接种到废水中。优选地，在30℃、120r/min的条件下处理废水48h。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的fx02菌株可有效去除生活污水中的含氮物质，48h内对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的去除率分别为88.8%、100.0%和94.8%。该生物脱氮方法属于新型生物脱氮
技术领域：
，不仅能在同一体系中同时去除氨氮、硝态氮和亚硝态氮，而且去除氨氮和亚硝态氮的过程中没有硝态氮的生成，在实际应用中具有很好的应用前景。附图说明图1为本发明菌株与其他菌株的亲缘关系。图2为异养硝化-好氧反硝化菌的异养硝化生长和脱氮特性。图3为异养硝化-好氧反硝化菌的好氧反硝化生长和脱氮特性。图4为异养硝化-好氧反硝化菌的亚硝态氮利用特性。图5为异养硝化-好氧反硝化菌强化反应器脱氮的实验。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例中用到的培养基配方如下：lb培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，水1000ml，ph7.4～7.6。异养硝化培养基：(nh4)2so41g/l，柠檬酸三钠5.20g/l，na2hpo40.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4•7h2o0.2g/l，nacl30g/l，微量元素2ml，ph7.0～7.5。好氧反硝化培养基：kno33g/l，柠檬酸三钠5.52g/l，na2hpo42.0g/l，kh2po41.0g/l，mgso4•7h2o0.1g/l，微量元素2.00ml，ph7.0～7.3。微量元素溶液：edta50g/l，znso42.2g/l;，cacl25.5g/l，mncl2•4h2o5.06g/l，feso4•7h2o5.0g/l，(nh4)6mo7o2•4h2o1.1g/l，cuso4•5h2o1.57g/l，cocl2•6h2o1.61g/l，ph值6.0。亚硝态氮培养基：kno21.0g/l，柠檬酸钠5.4g/l，微量元素溶液2ml，ph7.4～7.6。实施例1异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选，具体步骤如下：1.驯化和富集：实验污泥来自广州大坦沙污水处理厂好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥10g分别置于装有200ml硝化培养液和反硝化培养液的500ml锥形瓶中，放置于摇床中，设置温度为30℃，转速为150r/min，驯化以3d为一周期。每周期结束后将瓶中培养液静置片刻，倒掉上清液，再重新加入新鲜培养液各200ml进行驯化。期间检测氨氮和硝态氮的去除情况。2.分离纯化：用无菌水将1ml的驯化液梯度稀释至10-1、10-3、10-510-7，然后分别涂布在异养硝化和好氧反硝化平板培养基上，置于生化培养箱中30℃培养3d，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化和好氧反硝化固体培养基上划线，然后在同一条件下培养3d。然后再挑选单菌落进行重复划线，直到获得纯菌株。3.菌株筛选：将纯化后的菌株接种至灭菌后的lb培养基中，置于摇床中在30℃、120r/min的条件下培养24h，在4000r/min条件下离心2min，收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/l。然后按10%的接种量分别接种于装有适量异养硝化和好氧反硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120r/min摇床培养，实验设3个平行，同时设置未接菌的对照组，分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h测定培养液中nh4+-n和no3--n的含量。从中分别选出具有硝化和反硝化功能的菌株。4.同时硝化反硝化能力的测定：将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的lb培养基中，在30℃、120r/min条件下摇床培养24h后，于4000r/min离心2min收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/l，按10%的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120r/min下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测nh4+-n和no3--n的含量。经过上述筛选分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株fx02，该菌株经生理生化测试为革兰氏阴性，不产芽孢，氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性。sem扫描发现，fx02菌体为杆状，大小为0.4um×0.8um。fx02菌株的16srdna序列如seqidno：1所示，将其16srdna序列进行同源性比对，结果见图1。经16srdna测序及生理生化实验确定fx02菌株为人苍白杆菌(ochrobactrumanthropic)，将该菌株于2016年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno：60062，分类命名为人苍白杆菌(ochrobactrumanthropic)。实施例2实施例1所述fx02菌株的生长和脱氮特性1.将fx02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/l），然后按10%的接种量接种于含100ml的异养硝化培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中nh4+-n、nh2oh、no3--n、no2--n、cod、tn和od600值。结果见图2，根据图2的结果显示，fx02菌株以氨氮为唯一氮源时，fx02菌株在经过12h的生长后进入对数期，经过很短暂的稳定期菌株进入衰亡期。在菌株生长的同时，nh4+-n、tn和cod下降，nh4+-n在72h时全部去除，最大nh4+-n去除率达到10.64mg/l•h，72h时tn和cod去除率分别达到66.8%和81.1%。培养期间羟胺有较多的积累，其含量最高达到55.5mg/l，而培养结束其基本被去除仅有2.8mg/l。整个培养过程中有少量no2--n的积累，并在培养结束时几乎全部去除。实验组和对照组相比产生了同等少量的硝态氮，可能是由于空气中菌进入培养基中将氨氮氧化成了硝态氮，基本可以推断在菌株硝化过程中没有硝态氮的产生。2.将fx02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/l），然后按10%的接种量接种于含100ml的好氧反硝化培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中no3--n、no2--n、nh2oh、tn、cod和od600值。结果见图3，根据图3结果显示，菌株以硝态氮为唯一氮源时，培养至48h时硝态氮可全部去除。且培养期间tn和cod的去除率分别达到64.6%和70.7%。整个培养过程中检测到亚硝态氮和羟胺的存在，且亚硝态氮含量较少，而在培养结束时期亚硝态氮已全部被去除，说明菌株能降解亚硝态氮。由od600和no3--n去除的关系可知，由于对数期菌株生长最快且细胞合成和代谢主要在这一阶段，所以好氧反硝化主要发生在对数期。在整个反硝化过程中，硝态氮的去除较快，且产生的亚硝态氮转化为羟胺的速率也较快，期间亚硝态的积累较小。3.将fx02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/l），然后按10%的接种量接种于含100ml的亚硝态氮培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中no2--n、no3--n、nh2oh、tn、cod和od600值。结果见图4，根据图4结果显示，菌株以亚硝态氮为唯一氮源时，菌株能有效利用亚硝态氮进行脱氮，且脱氮过程中和对照组相比菌株不产生硝态氮，而有羟胺的积累，48h时亚硝态氮的去除率达到94.8%。从图中可以看出菌株在去除亚硝态氮的同时可有效去除tn和cod，反应48h时tn和cod去除率分别达到74.7%和82.9%。实施例3实施例1所述的fx02菌株强化脱氮的应用。实验进水水质指标见下表2。水质指标nh4+-nno3--nno2--ncodph范围80～100mg/l50～60mg/l50～60mg/l800～1000mg/l7.2～7.5实验运行条件：将1l新鲜活性污泥接种于反应器中，试验过程中按照sbr反应器运行条件进行进水-反应-停滞-出水，每周期设定12h，其中进水时间为2h，且进水时同时曝气，反应时间为9小时25分钟，停滞时间为30min，出水时间为5min，期间控制进水流量为1l/d，空气从底部经曝气头扩散进入反应体系中，用空气流量计调节进气量为4.0l/min，加热棒控制体系温度为30℃左右，以只含氨氮的水质作为进水水质，每周期定期检测进出水的nh4+-n、tn和cod指标。待反应器系统稳定时加入目标菌fx02，并以24h为周期进行进出水运行反应，进水采用含氨氮、硝态氮和亚硝态氮的水质，每周期检测进出水的nh4+-n、no3--n、no2--n、tn和cod指标。根据图5图结果显示，反应器体系稳定后加入目标菌株fx02后，反应器运行至15d时基本达到稳定，稳定阶段nh4+-n、tn和cod的去除率分别达到87.9%、78.0%和89.4%以上。可见将目标菌运用的实际的废水处理中，能获得较好的污水处理效果，说明菌株xh02具有较好的应用前景。sequencelisting<110>暨南大学<120>一株人苍白杆菌fx02菌株及其在废水脱氮中的应用<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1400<212>dna<213>16srdna<400>1agggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaagtgcatgcgcggctacaca60tgcagtcgagcgccccgcaaggggagcggcagacgggtgagtaacgcgtgggaacgtacc120ttttgctacggaataactcagggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaa180agatttatcggcaaaggatcggcccgcgttggattagctagttggtgaggtaaaggctca240ccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacac300ggcccagacctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatcc360agccatgccgcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaccggtgaagat420aatgacggtaaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacg480aagggggctagcgttgttcggatttactgggcgtaaagcgcacgtaggcggacttttaag540tcaggggtgaaatcccggggctcaaccccggaactgcccggaactgcctgcctttgatac600tggaagtcttgagtatggtagaggtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtag660atattcggaggaacaccagtggcgaaggcggctcactggaccattactgacgctgaggtg720cgagtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgtt780agccgttggggagtttactcttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctgggg840agtacggtcgcaagattcgattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggt900ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcccttgacataccggt960cgcggacacagagatgtgtctttcagttcgggctggaccggatacaggtgctgcatggct1020gtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccc1080ttagttgccagcatttagttgggcactctaaggggactgccggactgataagccg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