本发明涉及生物法处理抗生素污染的
技术领域：
：，具体涉及一种四环素类抗生素降解菌株、含有该菌株的菌剂及其应用。
背景技术：
：：抗生素被广泛发现在水体和农业环境中，尽管发现的抗生素的浓度通常较低，但是它们通过不同的途径在不断地进入环境，使它们变得“假性持久性”。研究表明，土壤中的抗生素残留也会对植物、动物、微生物产生不同程度的影响甚至毒害作用。随着我国工业化、城镇化，农业和畜禽养殖业的发展，土壤中抗生素的污染也不断发生。局部地区农田土壤中抗生素的污染较严重，同时，大面积土壤抗生素污染风险也已经显现。进入土壤中的抗生素类药物极易诱导产生大量抗药菌，并可能诱导产生群落抗性，将对包括人类在内的生态系统健康产生深远影响。由于大多抗生素难于降解，也导致抗生素在土壤中大量累积，并可通过植物吸收进入食物链，影响人体健康。因此，抗生素导致的环境与健康问题在中国日益突出。四环素类抗生素，主要用于人和动物感染性细菌的治疗。土壤中的土霉素等四环素类抗生素可以通过植物吸收、富集，并可能在植物体内不同部位传输，最终进入食物链给人体健康带来潜在风险。某些地区土壤中存在土霉素类抗生素污染，张慧敏等(张慧敏，章明奎，顾国平.浙北地区畜禽粪便和农田土壤中四环素类抗生素残留.生态与农村环境学报，2008，24(3)：69-73)发现我国浙北地区农田表层土壤中四环素类抗生素的总量为80-6006μg·kg-1，其含量已经接近于土壤中其他农药类有机污染物的水平，hu等(hux.g.,zhouq.x.,luoy.occurrenceandsourceanalysisoftypicalveterinaryantibioticsinmanure,soil,vegetablesandgroundwaterfromorganicvegetablebases,northernchina.environmentalpollution,2010,158:2992-2998)研究发现天津地区有机蔬菜基地土壤中土霉素的含量高达2683μgkg-1。目前，对抗生素污染的处理方法主要分为非生物降解和生物降解两种。非生物降解方法多为物理或化学手段，主要方式有光解、水解和氧化降解等，其优点是反应迅速、去除率高。然而近些年国内外均有研究表明，应用于抗生素降解中的化学材料对环境也存在一定程度的毒副作用。生物降解的主要方式为微生物降解、植物降解以及植物-微生物复合降解。抗生素进入环境中最主要的降解途径就是微生物降解。有关四环素类抗生素微生物降解的报道并不多。如研究表明氨基杆菌、黄孢原毛平革菌、人苍白杆菌和蜡状芽孢杆菌等对土霉素等四环素类抗生素具有较好的降解作用。但是，目前发现的土霉素降解菌株还比较少，而且利用微生物实现对抗生素进行降解，机理比较复杂，具有很强的针对性。目前未见乙酸钙不动杆菌降解土霉素等四环素类抗生素的报道。因此，开展土霉素等四环素类抗生素污染微生物修复技术研究，筛选不同类型的土霉素等四环素类抗生素的高效降解微生物菌株是十分必要的，可为减低水体、土壤或作物中土霉素残留提供有效手段，为保障农产品安全和农田环境安全提供技术支持。技术实现要素：针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种四环素类抗生素降解菌株。本发明的第二目的在于提供一种含有上述菌株的菌剂。本发明的第三目的在于提供上述菌株或菌剂的应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的第一方面，提供一种四环素类抗生素降解菌株，其为乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005，该菌株已于2016年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，保藏号为cgmccno.12812，其保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。上述菌株来源于北京市庞各庄污水处理厂的活性污泥中，经富集、分离和纯化得到。该菌株对四环素类抗生素特别是土霉素具有很强的降解作用，具有如下特征：(1)将纯化后的菌株jzb42c005接种在lb固体培养基上，28℃培养48h后电镜观察菌株形态特征，其结果为：菌落形态为圆形，光滑不透明，菌落大小中等；为杆状，大小(0.9～1.6)μm×(1.5～2.5)μm，无芽孢，无鞭毛，参见图5。(2)取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、荚膜等染色，生理生化特征测定参照《常见细菌系统鉴定手册》，生理生化特性见表1。表1菌株jzb42c005的生理生化特性试验特征革兰氏染色－明胶液化－葡萄糖产酸+接触酶+氧化酶－柠檬酸盐利用+丙二酸盐+谷氨酸转移酶+硝酸还原酶－(3)pcr扩增上述菌株的16srdna，大小为1.5kb，测序结果显示具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，将其用dnamanversion5.2.2和blast软件与genbank中的序列进行同源性比对，发现该菌与乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)的同源性最高，达到100％。本发明参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠、蔡妙英)不动杆菌属的特征，并结合上述(1)-(3)的特征，将本发明菌株jzb42c005鉴定为乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)。本发明乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005可在普通固/液体培养基或lb固/液体培养基上生长，也可在土霉素浓度为1-50mg/l的基础无机盐液体培养基中培养，生长温度为25-35℃，ph为6-7.5，最适生长温度为30℃，ph为7。本发明的第二方面，提供一种含有上述菌株的菌剂，优选地，所述菌剂中乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005的浓度为0.5-5×107cfu/ml。本发明的第三方面，提供上述菌剂的制备方法，将纯化后的乙酸钙不动杆菌jzb42c005接种于普通液体培养基或lb液体培养基中，经培养后离心并收集沉淀物，然后洗涤所述沉淀物，最后采用稀释剂进行稀释得到所述菌剂，即菌体悬浊液。优选地，所述培养具体为：在25-35℃、180r/min条件下培养24-48h；所述离心条件为：温度4-5℃，转速10000-12000rpm，离心时间为5-12min；所述稀释剂为0.1mol/l的na2hpo4-kh2po4缓冲液。本发明的第四方面，提供上述菌株在降解四环素类抗生素方面的应用。本发明的第五方面，提供上述菌剂在降解四环素类抗生素方面的应用。在本发明的第四方面和第五方面中，所述四环素类抗生素为土霉素。本发明的有益效果：菌株jzb42c005对土壤或水体中四环素类抗生素尤其是土霉素具有非常好的降解效果。对于无机盐培养液中浓度为10mg/l的土霉素，处理5天后降解率达到67.8％。附图说明图1是不同降解时间条件本发明菌株jzb42c005对无机盐培养液中浓度为10mg/l的土霉素的降解效果图；图2是本发明菌株jzb42c005对不同初始浓度的土霉素的降解效果图；图3是不同ph条件下本发明菌株jzb42c005对无机盐培养液中浓度为10mg/l的土霉素的降解效果图；图4是不同温度条件下本发明菌株jzb42c005对无机盐培养液中浓度为10mg/l的土霉素的降解效果图；图5是本发明乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005的电镜扫描照片。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将采用实施例的方式对本发明进行详细说明，但这些实施例仅用于解释本发明，而不限制本发明。本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照sambrookj等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；或产品说明书。本发明使用的培养基的配制如下：1)富集培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调ph至7.0，高压灭菌20min。2)普通固体培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水补至1000ml，调ph至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。3)普通液体培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，蒸馏水补至1000ml，调ph至7.0，高压灭菌20min。4)基础无机盐培养基：1gnh4no3，0.5gmgso4·7h2o，0.5g(nh4)2so4，0.5gkh2po4，0.5gnacl，1.5gk2hpo4，蒸馏水补至1l，调ph至7.0，高压灭菌20min。5)分离培养基：1gnh4no3，0.5gmgso4·7h2o，0.5g(nh4)2so4，0.5gkh2po4，0.5gnacl，1.5gk2hpo4，15g琼脂，蒸馏水补至1l，调ph至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。6)lb液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，蒸馏水补至1l，调ph至7.0，高压灭菌20min。7)lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，15g琼脂，蒸馏水补至1l，调ph至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。0.1mol/l的na2hpo4-kh2po4缓冲液(ph＝7.0)的配制方法：首先，将61ml的0.2mol/l的na2hpo4水溶液与39ml的0.2mol/l的-kh2po4水溶液混合均匀，调ph至7.0。然后，将得到的混合液稀释1倍即得到0.1mol/l的na2hpo4-kh2po4缓冲液(ph＝7.0)。实施例1：乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005的分离与纯化取来源于北京市庞各庄污水处理厂的活性污泥样品3份，分别拌均，各取10g，在无菌操作条件下，分别加到100ml含土霉素的富集培养基中，土霉素在富集培养基中的浓度为10mg/l，然后将加完污泥样品的富集培养基放入摇床中进行避光培养7d，条件为30℃、180r/min；之后按10％的接种量(本实施例中“10％的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)将其转接到含土霉素浓度为20mg/l的下一批富集培养基中，继续培养7d；之后再按10％的接种量转接到含土霉素浓度为50mg/l的富集培养基中，继续培养7d；接着再按10％的接种量转接到含土霉素浓度为50mg/l的基础无机盐培养基中，继续培养7d；再按10％的接种量转接到含土霉素浓度为100mg/l的基础无机盐培养基中，继续培养7d；然后将三份所得的基础无机盐培养液稀释成10-1-10-6系列溶液(即将础无机盐培养液依次稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍)，各取1ml分别转接到对应的普通固体培养基平板上，涂布平板，置于30℃恒温培养箱中培养1d-3d，选取不同形态特征的菌株，分别接种于含土霉素浓度为100mg/l的分离培养基上，采用平板划线法分别进行3次分离纯化。纯化后选取平板上长势较好的单菌落菌株编号，其中一株定名为jzb42c005，保藏于具有普通固体培养基的斜面试管中。实施例2：乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)jzb42c005的16srdna鉴定1、pcr模板的获取：其包括两种方法，一种是提取基因组dna以将其作为pcr模板，另一种是直接热处理菌液以将热处理后的菌液作为pcr模板。下面对两种方法均做一介绍。1)提取基因组dna，采用溶菌酶加10％sds法，具体如下：(a)将纯化后的该菌接种于lb液体培养基中，在28℃条件下180r/min的摇床上培养24h，然后取新鲜培养菌液2ml，12000rpm，离心1-2min，弃去上清；(b)再向沉淀物中加入1ml、1×te(ph8.0)buffer混匀洗涤，12000rpm，离心1-2min，弃去上清；(c)再向沉淀物中加入400μl、5×te(ph8.0)buffer混匀洗涤，12000rpm，离心1-2min，弃去上清；(d)再向沉淀物中加入50μl、20mg/ml溶菌酶溶液，37℃水浴30-60min；(e)加入50μl、10wt％sds，20μl蛋白酶(20mg/ml)，55℃水浴60min；(f)加入500μl酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)混匀，12000rpm，离心10min；(g)取上清液转入新离心管中，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，混匀，12000rpm，离心10min；(h)取上清液转入新离心管中(1.5ml)，加入2倍上清液体积的无水乙醇，轻混匀直至dna沉淀，12000rpm，离心10min；(i)弃去上清液，70％乙醇洗涤，12000rpm，离心10min；(j)弃去上清液，操作台晾干，至dna透明；(k)加入50μl灭菌水，0.5μlrnase，混匀，-20℃冰箱保存，备用。2)直接热处理获得pcr模板，具体如下：将纯化后的该菌种接种于lb固体培养基上，28℃培养24h，然后用无菌枪头蘸取少量菌体，混匀在100μlddh2o中，沸水处理2min后12000rpm离心5min，上清液即为pcr扩增模板。本实施例采用了该方法获得pcr模板。2、pcrpcr引物采用16srdna通用引物27f(5′-gagagtttgatcctggctcag-3′，即序列表中seqidno.2)和1492r(5′-acggataccttgttacgactt-3′，即序列表中seqidno.3)。pcr反应体系25μl：2×taqpcrmix12.5μl，引物27f1μl，引物1492r1μl，ddh2o8.5μl，dna模板2μl。pcr程序：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃90s，30个循环；72℃10min。pcr结束后采用1％琼脂糖凝胶电泳，pcr产物为1.5kb，经纯化回收后连接到t载体上克隆，经蓝白筛选后提取质粒，将其送至中美泰和生物技术(北京)有限公司测序，测序结果显示具有序列表中seqidno.1的核苷酸序列，将其用dnamanversion5.2.2和blast软件与genbank中的序列进行同源性比对，发现该菌与乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)的同源性最高，达到100％。实施例3：不同处理时间条件下菌株jzb42c005对土霉素的降解效果测定将纯化后的菌株jzb42c005在lb液体培养基中培养至对数周期，以10％接种量接入含土霉素为10mg/l的基础无机盐培养基中，在30℃、180r/min的恒温摇床上振荡培养，同时设不接菌的基础无机盐培养基作对照，每个处理3个重复。分别在0、1、3、5、7、10天时，吸取上清液2ml，过0.2μm滤膜，然后采用液相色谱紫外检测器测定上清液中土霉素的残留量，其中进样量为20μl。土霉素的残留量的具体检测方法如下：1)标准曲线的绘制采用外标法定量。用乙腈将土霉素标准溶液依次稀释成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mg/l浓度，然后用液相色谱仪测定，每次进样2μl，每个处理重复3次，取其峰面积的平均值。然后以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。2)土霉素的液相色谱测定条件液相色谱为waters2695hplc，色谱柱：watersc18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)：0.1％的甲酸水溶液(b)＝75％：25％(体积比)，检测波长254nm；进样量2μl；柱温35℃。3)培养0、1、3、5、7、10天后培养液中土霉素残留量的计算：通过步骤1)的标准曲线得到不同时间培养液中土霉素残留量。通过残留量可以得到不同时间培养液中土霉素的降解率，结果参见图1，其中降解率＝(对照培养液中土霉素残留量-处理培养液中土霉素残留量)/对照培养液中土霉素残留量×100％。菌株jzb42c005对基础无机盐培养基中浓度为10mg/l土霉素的降解曲线见图1。从图1中可以看出，菌株jzb42c005对基础无机盐培养基中的土霉素具有一定的降解效果，随着时间的增长，土霉素的降解率增加，5天时达到最高降解率67.8％，随后有所下降。实施例4：菌株jzb42c005对不同浓度土霉素的降解效果将纯化后的菌株jzb42c005在lb液体培养基中培养至对数周期，以10％接种量分别接入含土霉素为1、5、10、20、50mg/l的基础无机盐培养基中，在30℃，180r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的基础无机盐培养基作对照，每个处理3个重复。培养结束后，液相色谱检测土霉素的残留量，具体检测方法同实施例3。菌株在土霉素不同初始浓度下的降解曲线见图2。实验结果表明，接种培养5天条件下，菌株jzb42c005对初始浓度1～10mg/l的土霉素的降解率在65％以上，对20mg/l的土霉素的也具有较高的降解能力，降解率在50％以上，对浓度50mg/l的土霉素的降解率为38.5％。实施例5：ph对菌株jzb42c005降解土霉素的影响将纯化后的菌株jzb42c005在lb液体培养基中培养至对数周期，以10％接种量分别接入到具有不同ph的含土霉素浓度为10mg/l的基础无机盐培养基中，ph分别为4、5、6、7、8、9，在30℃，180r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的基础无机盐培养基作对照，每个处理3个重复。培养结束后，液相色谱检测土霉素的残留量，具体检测方法同实施例3。菌株jzb42c005在不同ph下对土霉素的降解曲线见图3。实验结果表明，接种培养5天，不同ph条件下，菌株jzb42c005对基础无机盐培养液中10mg/l的土霉素的降解率不同，ph为7时，对10mg/l的土霉素的降解能力达到最高，ph为6时，对10mg/l的土霉素的降解能力也可达到50％。实施例6：不同温度对菌株jzb42c005降解土霉素的影响将纯化后的菌株jzb42c005在lb液体培养基中培养至对数周期，以10％接种量接入含土霉素为10mg/l的基础无机盐培养基中，在不同温度20、25、30、35、40、45、50℃条件下，180r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的基础无机盐培养基作对照，每个处理3个重复。培养结束后，液相色谱检测土霉素的残留量，具体检测方法同实施例3。菌株jzb42c005在不同温度下对土霉素的降解曲线见图4。实验结果表明，在不同温度条件下，接种培养5天，菌株jzb42c005对无机盐培养液中10mg/l的土霉素的降解率不同，温度为30℃时，对10mg/l的土霉素的降解能力达到最高，为60％以上；温度为25℃或35℃时，对10mg/l的土霉素的降解能力也可以达到55％左右。实施例7：菌剂的配制将纯化后的菌株jzb42c005接种于20mllb液体培养基中，在30℃、180r/min条件下培养36h后，在5℃下用4300r/min离心10min收集菌体，然后用10ml的0.1mol/l的na2hpo4-kh2po4缓冲液洗涤菌体2次，再用上述缓冲液4ml将其制成菌体悬浊液，即菌剂，该菌剂中菌株jzb42c005的浓度为1.0×107cfu·ml-1。实施例8(1)模拟土霉素污水中土霉素的降解试验将土霉素溶解于10ml甲醇中，然后添加此溶液到500ml水中，制备使土霉素的浓度为5mg/l和10mg/l的两种模拟土霉素污水。将实施例7制备的降解菌剂分别添加到上述两种模拟土霉素污水中，菌株jzb42c005在两种污水中的浓度均为1.0×107cfu/ml污水，并设不添加菌剂的对照，置于30℃培养箱中，在黑暗条件下培养1、3、5、7、10天后，分别取样测定污水中土霉素的残留量，具体检测方法同实施例3，结果见表2。此降解菌剂可以有效去除土霉素在水中的残留，去除效果较好。土霉素浓度为5mg/l和10mg/l时，菌株jzb42c005对其降解率分别为75.3％和58.6％。表2菌株jzb42c005对污水中不同初始浓度土霉素的降解率(2)模拟土霉素污染的污泥农用土壤中土霉素的降解试验选取未施药的北京郊区田间表层土壤(0-20cm)一定量，污水处理厂污泥一定量，按照污泥：土壤的质量比为1:3的比例混合，制成污泥农用土壤，然后称取该污泥农用土壤每份280g，置于大表面皿中，分别添加土霉素，添加浓度分别为5mg/kg和10mg/kg，将实施例7制备的降解菌剂均匀喷施于土壤表面，浓度为1.0×107cfu/g土壤，并设喷洒清水对照，置于30℃培养箱中，在黑暗条件下培养1、3、5、7、10天后，取测定土壤中土霉素的残留量，结果见表3，具体测定方法如下：土壤中的土霉素采用磷酸盐缓冲液与乙腈混合溶液提取，sax-hlb固相萃取小柱净化，esi(+)电离方式，多反应监测(mrm)定量，hplc/ms/ms测定，参照文献：马丽丽,郭昌胜,胡伟,沙健,朱兴旺,阮悦斐,王玉秋,固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素,分析化学，2010,38(1)，21-26。通过残留量可以得到不同时间土壤中土霉素的降解率，结果参见表3，其中降解率＝(对照土壤中土霉素残留量-处理土壤中土霉素残留量)/对照土壤中土霉素残留量×100％。此降解菌剂可以有效去除土霉素在污泥农用土壤中的残留，去除效果较好。土霉素浓度为5mg/kg和10mg/kg时，处理5天后菌株jzb42c005对其降解率分别为55.6％和48.8％。表3菌株jzb42c005对污泥农用土壤中不同浓度土霉素的降解率sequencelisting<110>北京市农林科学院<120>四环素类抗生素降解菌株、含有该菌株的菌剂及其应用<130>160671<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>1447<212>dna<213>acinetobactercalcoaceticus<400>1agccctgggccaacgtggttaccgccctctttgcagttaggctagctacttctggtgcaa60caaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggca120ttctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatcc180ggactacgatcggctttttgagattagcatcctatcgctaggtagcaaccctttgtaccg240accattgtagcacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtcccc300gccttcctccagtttgtcactggcagtatccttaaagttcccgacattactcgctggcaa360ataaggaaaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctga420cgacagccatgcagcacctgtatgtaagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagt480tcttactatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctc540caccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactcccc600aggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacggctagt660agacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccatgctttc720gcacctcagcgtcagtgttaggccagatggctgccttcgccatcggtattcctccagatc780tctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccacactctagctaacc840agtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatttgacttaattagccgc900ctacgcgcgctttacgcccagtaaatccgattaacgcttgcaccctct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