一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法与流程

本发明涉及一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法，属于医疗器械领域，适合于要求高通量，在线检测以及对扩增模板进行完全定量的聚合酶链式反应(PCR)。

背景技术：

聚合酶链式反应(PCR)是一种非常重要的核酸分析方法，得益于能够快速对目标分子进行富集，为下一步分析准备，故其广泛的应用于医学与生物研究领域，大大加快了生物基因组结构研究进程。传统的PCR仪器由于液体体积量大，故需要循环复杂的加热和冷却循环，消耗大量能源，缺少实时监测同时不能够进行绝对定量分析。数字PCR技术是近年快速发展的新型PCR技术，可进行绝对定量的核酸检测术。基本原理是通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至多包含一个拷贝的目标分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，其应用领域包括：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

基于这些优势液滴数字PCR被广泛的应用低模板浓度目标分子的检测。现有基于液滴数字PCR设备通常将整个循环分为三个部分：液滴发生装置(2)，热循环控制器和液滴荧光检测器，需要液滴在各个模块中进行转移，在移动和热循环过程中容易造成液滴破碎以及液滴之间相互融合导致不均匀，并且极易造成试剂之间的交叉污染。

技术实现要素：

本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法，具有高度的一体化设计，集成承压能力强的液滴发生装置(2)以及采用刚性热循环流道装置，具有高导热性的同时能够有效的抑制液滴破碎与样品之间的交叉污染。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一体式刚性流道液滴数字PCR系统，包括：动力装置、液滴发生装置、液滴PCR反应模组、荧光检测控制器、PC控制模块；动力装置包括反应试剂推进器(6)及油相推进器(7)；液滴PCR反应模组(3)包括刚性热循环模块(8)和热循环温度控制模块(15)；

试剂通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)分三路推进入液滴发生装置(2)中，在液滴发生装置(2)中产生大量油包反应试剂纳升级液滴，通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)来调节液滴发成装置(2)的进出口流量，进而形成对液滴生成以及液滴大小的控制；液滴发生装置(2)的出口与刚性热循环模块(8)上的热刚性流道(9)入口相连接，同时热循环温度控制模块(15)对刚性流道(9)表面温度进行控制；液滴在刚性热循环模块(8)经过热循环后进入荧光检测控制器(4)，荧光检测控制器(4)对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测，同时PC控制模块(5)对液滴荧光检测结果进行分析转换成数字信号，整个系统形成以前端液滴生成，PCR反应热循环以及末端液滴荧光实时在线检测的一体化设计。

上述的刚性热循环模块(8)主要由刚性流道(9)，刚性圆柱体(11)，圆柱形加热装置孔槽(12)以及热电偶安置孔槽(13)，其中刚性流道(9)是一个呈8字形均匀的缠绕于具有两个不同温度区的刚性圆柱体(11)上，液滴在高导热刚性流道(9)两个温度区间来回稳定流动，同时刚性圆柱体(11)中间部位有安置圆柱形加热装置的孔槽，刚性圆柱体(11)端部紧贴有一热电偶传感器用于检测导热部件温度。

上述的热循环温度控制模块(15)包括热电偶传感器(14)，PC客户端软件模块(16)，单片机(17)，控制电路(18)，DC电源(19)以及安捷伦数据采集仪器(20)。其中，热电偶传感器(14)与刚性热循环模块中的刚性圆柱体(11)热接触，实时返回温度数据给安捷伦数据采集仪器(20)，安捷伦数据采集仪器通过TCP/IP接口(或者GPIB接口)将采集到的温度数据上传到PC端，被PC客户端软件模块(16)收集处理，通过PID逻辑计算得出需要发送给单片机(17)的程控信号。PC客户端软件同时通过可编程仪器标准指令(SCPI)控制安捷伦仪器的数据采集参数(采样时间，采样模式，采样开始和结束)。由PC客户端软件计算得到的控制信号经由USB接口传送到单片机(17)，单片机按照程控信号的指令调节PWM输出口的占空比，从而控制晶体管(10)的开关，进而调节DC电源(19)的输出功率，而功率的改变引起刚性热循环模块的温度变化，这样完成一个温度控制循环过程。

上述动力装置(1)包括反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)。通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)将试剂分三路推进入液滴发生装置(2)中，在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂纳升级液滴。通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)来调节液滴发成装置(2)的进出口流量来影响流道内压力差，进而形成对液滴生成以及液滴大小的控制。

上述荧光检测控制器(4)组成部分包括改进的进样针(24)，荧光检测器(25)(guava easyCyte 5，Merck Millipore，美国)以及荧光数据收集分析软件(26)。刚性流道(9)末端与改进进样针(24)进行对接，接入荧光检测器，而后经过数据收集分析软件进行数据处理。

本发明的工作原理是：对样品进行稀释后，通过功率装置以及液滴发生器生成部分包含样品的液滴，通过热循环控制装置，使得包含样品液滴性状改变，从而改变被测样本的受激发光的强度，通过末端光学部件对包含样品液滴进行激发后，计算机统计检测到的发光强度，并经过一定的数据处理获取最终获取样品具有的生物信息如附图6所示。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

(1)本发明与现有数字PCR仪器的主要区别在于整个系统形成以前端液滴生成，PCR反应热循环以及末端液滴荧光实时在线检测的一体化设计，实现扩增与检测一步操作，能够有效减小现有分体式多步骤操作带来样品污染以及液滴融合等问题。

(2)本发明采用了刚性管道，得益于刚性流道为具有非弹性壁面能够有效抑制液滴在热循环运输过程，由于管道变形导致管内水利条件变化而造成液滴破裂与融合。同时由于具有高热传导系数(16W/M-K.20℃下测量)，相比于常规采用的聚四氟乙烯管(0.27W/M-K.20℃下测量)导热效率有很大的提升。

(3)本发明采用了末端荧光检测，在传统离线的检测有三点缺陷；由于含有目标模板的液滴其密度比作为连续相的矿物油的密度要大很多，随着检测时间的推移，液滴就会顺着重力的方向往下沉，这样经过一定时间后，液滴将完全沉积在检测管底端；传统荧光检测仪器中的内部结构设置中，为保护进样针，特意让进样针针端与样品管底端之间保留了一段距离，以免其不小心触碰到管底，造成损伤。在这种情况下，当检测进行到一定时间后，流式细胞仪便会因为进样针抽取不到沉降在样品管底部大量的液滴而导致无法正常检测出荧光信号；由于采用油包试剂模式，故在一定时间内液滴收集的体积远远比油的体积小的多，所以单个样品管内能收集到的液滴十分有限，这样就需要连续收集多管，就会造成实验效率降低。本发明得益于进样针的改造，用内径为200um的玻璃毛细管替代流式细胞仪自带的进样针，新进样针能直接与扩增系统相连，使得仪器能对微液滴进行实时，连续，高通量，检测。

附图说明

图1为本发明的一体式刚性流道液滴数字PCR系统流程图；

图2为图1中生成液滴装置示意图；

图3为图1中刚性通道具体缠绕结构示意图；

图4为本发明采用的荧光检测改进后进样针；

图5为本发明采用的热循环温度控制方式；

图6是一体式刚性流道液滴数字PCR荧光检测结果图，其中左图表示液滴大小与负责度分布情况，右图表示左图选中区域(R1)中液滴时实荧光检测分布情况。

具体实施方式

如图1所示，本发明包括动力装置1、液滴发生装置2、液滴PCR反应模组3、荧光检测控制器4和PC控制模块5。在该实例中，采用添加EM90的矿物油作连续相流体，含有目标DNA模板的样品则作分散相流体，以此来产生含有模板分子的单分散液滴。其中，矿物油内所含的EM90体积分数为2％，含有DNA模板的样品具体配比如下：每1mL PCR Mix反应试剂中含873μLddH2O、100μL 10*Buffer、20μL dNTP Mix、0.9μL Lib5S1、0.9μL Lib3A2以及5μL Pfu酶5U/mL，待上述配比完成后，再向其中加入4％的EvaGreen染料,该染料能与特定模板结合后，受特定波长的光激发后会产生荧光，其荧光强度可用于表征本实验扩增效率。通过反应试剂推进器6以及油相推进器7将试剂分三路推进入液滴发生装置2中，在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂纳升级液滴；液滴发生装置2出口与刚性热循环模块8上的刚性流道9入口相连接，同时热循环温度控制模块15对刚性流道9温度进行控制；液滴在刚性热循环模块8经过热循环后进入荧光检测控制器4，荧光检测控制器对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测，同时PC控制模块5对液滴荧光检测结果进行分析转换成数字信号。整个系统形成以前端液滴生成，PCR反应热循环以及末端液滴荧光实时在线检测的一体化设计。

如图2所示为液滴发生装置2，包括拧紧螺母21，液滴发生装置主体22以及适配器23。动力装置1将包含样品的试剂推入液滴发生装置2其中一个入口，同时将油相推入与反应试剂入口互相垂直的两个入口，由于流体剪切力的作用后而生成大量油包反应试剂纳升级液滴。动力装置1是通过毛细玻璃管27将试剂推进到液滴发生装置中。在准备连接用的毛细管时，应该使用专业的切割工具毛细管环形刀来裁剪，以此确保断面的平整性，避免出现玻璃破碎剥落，堵塞接头的现象。此外，对裁剪完的玻璃毛细管需进行显微镜观察，如发现有不平整之处，便可使用陶瓷片将切口轻轻磨平。由于该种液滴发生装置2的组装和拆卸都非常方便，于是在实验正式开始前的准备过程中，通常将还未组装好的接头部件先直接放入超声清洗器中清洗一遍，之后向接头内部通入酒精再次清洗，最后用氮气进行吹干。在装配时将毛细玻璃管伸入适配器23中，再采用拧紧螺母21将其拧紧在液滴发生装置主体22上。液滴发生装置2安装完成后，开启反应试剂推进器6以及油相推进器7将试剂推入液滴发生装置2中，通过调整推进器流量来控制液滴发生装置所生成液滴大小。

如图3所示为刚性流道9具体缠绕结构示意图。刚性热循环模块8主要由刚性流道9，刚性圆柱体11，圆柱形加热装置孔槽12以及热电偶安置孔槽13组成，其中刚性流道9是一个呈8字形均匀的缠绕于两个不同温度的刚性圆柱体11上，液滴在刚性流道9中沿着两个不同温度区的刚性圆柱体11来回稳定流动，同时刚性圆柱体11中间部位有安置圆柱形加热装置的孔槽，同时热电偶安置孔槽13内安放热电偶传感器14与刚性热循环模块中的刚性圆柱体11进行热接触，实时返回温度数据。

刚性流道9为高导热刚性流道，采用的是304不锈钢毛细管，管壁厚0.1mm，管内径0.35mm，其导热系数为16W/M-K(20℃下测量)，相比于常规采用同样管径的聚四氟乙烯管0.27W/M-K(20℃下测量)导热效率有极大的提升。

如图4所示为本发明采用的荧光检测改进后进样针24，其中包括处理后的玻璃毛细管28，为进样针主体29。采用的玻璃毛细管的内径为200um，外径为360um。将玻璃毛细管作为检测窗口部分放置在温度为200度浓硫酸中经过一小时后去除表面涂层替代流式细胞仪自带的进样针，其中在玻璃毛细管中间部分去除表面涂层的部分作为检测窗口。新进样针能直接与刚性流道9末端相连后液滴经过荧光检测控制器4检测窗口，实现对微液滴进行在线实时、连续检测。

如图5所示为本发明采用的热循环温度控制方式，主要热电偶传感器14，PC客户端软件模块16，单片机17，DC电源19以及安捷伦数据采集仪器20。其中，热电偶传感器14与刚性热循环模块中的刚性圆柱体3-2热接触，实时返回温度数据给安捷伦数据采集仪器20，安捷伦数据采集仪器通过TCP/IP接口或者GPIB接口将采集到的温度数据上传到PC端，被PC客户端软件模块16收集处理，通过PID逻辑计算得出需要发送给单片机17的程控信号。PC客户端软件同时通过可编程仪器标准指令SCPI控制安捷伦仪器的数据采集参数采样时间，采样模式，采样开始和结束。由PC客户端软件计算得到的控制信号经由USB接口传送到单片机17，单片机按照程控信号的指令调节PWM输出口的占空比，从而控制晶体管10的开关，进而调节DC电源19的输出功率。而功率的改变势必改变刚性热循环模块的温度，这样完成一个温度控制循环过程。

如图6所示是一体式刚性流道液滴数字PCR结合实例得到的荧光检测结果图。由于荧光检测控制器4采用的是流式细胞术测量，通常用两种散射方向的散射光进行测量：前向角散射FSC和侧向散射SSC。前向角散射光FSC的强度与颗粒的大小有关，对于同种颗粒群体，前向角散射光强随颗粒截面积的增大而增大；对于球形颗粒，则在小立体角范围内前向角散射光强基本上和颗粒截面积的大小成线性关系。而侧向散射光SSC的测量主要是用来获取关于颗粒内部精细结构的信息。因此，在本实验中液滴荧光检测结果中，前向散射光FSC的测量值反映的便是液滴的大小，而侧向散射光SSC的测量值反映的则是液滴的内部结构。基于在之前的样品配制中，使用的荧光染色剂Evagreen染料，其与特定模板结合后，受到激光的激发便会发出绿色的荧光，故在进行检测时，只需测定绿色荧光的值便可判定实验效果。随着液滴连续不断地经过进样针24进入检测系统，可以从PC控制模块5上得到图6所示的检测结果，其图6左图横坐标FSC值反映液滴大小均稳定在15000FSC-HLin，即说明液滴尺寸基本保持不变，整个系统的稳定性得到验证。随着检测时间的推移，液滴荧光值基本保持不变，其中含有模板分子的液滴被准确识别出来，其荧光值保持在1400GRN-HLog，而不含有模板分子液滴的荧光值保持在450GRN-HLog。这就表明：在两温度段的循环扩增系统内，包裹在液滴中的目标DNA分子确实进行了稳定有效的扩增，即扩增系统的有效性得到了验证。

提供以上实施案例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。