体外纤维化模型、该模型的制造方法以及用途与流程

本发明涉及一种体外纤维化模型、其制造方法以及用途。

背景技术：

目前，在全世界范围内有500万名以上的人因纤维化(fibrosis)而备受痛楚，每年10万名的新患者被诊断为纤维化，每年4万名的患者因纤维化而死亡。

纤维化的特征在于，引发器官的功能障碍及死亡的结合组织的过度的发育。纤维化通常对如肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨髓等多样的器官产生影响。在这些当中，包含肾小管间质性纤维化或肾小球硬化症在内的肾脏纤维化难以治疗，且被认为是非可逆的。

另外，作为针对纤维化的实验动物模型，已知有如下方法：给小鼠中投入博来霉素，或者通过遗传转化而制造肺纤维化等动物模型，，然而目前为止尚不知道用于在体外系统中研究纤维性组织并开发治疗剂的模型。因此，为了开发纤维化治疗剂而需要开发一种体外纤维化模型，其理想地模拟生物体内环境，并表现出纤维化病理学特性。

技术实现要素：

技术问题

本发明之一形态旨在提供一种体外(invitro)纤维化模型，其包括由间充质细胞分化的细胞集合体(cellcluster)，所述细胞集合体表现出纤维化病理学特征。

本发明的另一形态旨在提供一种体外纤维化模型的制造方法，包括如下步骤：将间充质细胞黏着于表面呈现疏水性的培养容器中培养而形成细胞集合体；以及将上述形成的细胞集合体至少额外培养12小时以上，从而在所述细胞集合体形成纤维化病理学特征。

本发明的又一形态旨在提供一种纤维化治疗剂的筛选方法，包括如下步骤：对所述体外纤维化模型处理被检测物质；以及在所述体外纤维化模型的细胞集合体或所述细胞集合体内的细胞中，与无处理对照组进行比较，从而将表现出改善或治疗纤维化的病理学特征的被检测物质作为用于治疗纤维化的候选物质而进行选择。

技术方案

本发明之一形态提供一种体外(invitro)纤维化模型，其包括由间充质细胞分化的细胞集合体(cellcluster)，所述细胞集合体表现出纤维化的病理学特征。

在本说明书中，术语“间充质细胞(mesenchymalcells)”作为可自我增殖并可分化为多样的系统(lineages)的多功能性干细胞，其可以表示能够分化成占据中胚层和内胚层之间的塑性的组织；结合组织、真皮、皮下组织、骨、软骨、骨髓、骨骼肌、平滑肌、心肌、血液细胞、淋巴结、淋巴管、血管、脾脏、胃等的未分化细胞。所述间充质细胞可以是从例如包含人类等的哺乳动物之类的对象体中分离的细胞，其可以包括脂肪干细胞、间充质干细胞(mesenchymalstemcells)、间充质基质细胞、骨髓干细胞或成纤维细胞。所述细胞中提及的术语“分离”可表示在与自然发生的细胞内的环境不同的环境中存在的细胞。例如，如果细胞自然发生于多细胞器官，而且所述细胞从多细胞器官被去除，则细胞可谓是“分离”的细胞。

术语“细胞集合体(cellcluster)”或“三维细胞集合体”(与“细胞组织体”互换而使用)是指2个以上的细胞密集的状态，既可以是组织状态，也可以是单细胞状态。各个细胞集合体可作为组织本身或局部、或者单细胞的集合体而存在，且可以包括由间充质细胞分化的类细胞组织体。并且，术语“三维(three-dimension)”可表示并非二维而是具有几何学的三个参数(例如，深度、宽度、高度或者x、y、z轴)模型的立体，因此，根据一个具体例的由间充质细胞分化的细胞集合体可表示如下的细胞集合体：三维培养，即从培养容器中脱附而以浮游状态被培养，且随着细胞增殖而具有立体的球形、片(sheet)状或者与之相似的三维形态(例如，类组织体)。所述细胞集合体的直径为300μm以上，例如可以是300至2000μm、400至1500μm、400至1000μm。而且，所述细胞集合体可包括由间充质细胞分化的血管细胞，例如可包括2×10⁴至1×10⁵细胞/cm²的血管细胞。

从所述间充质细胞向细胞集合体的分化可按如下方式进行分化：将所述间充质细胞黏着于表面呈现疏水性的培养容器中而进行培养。具体而言，如果将所述间充质细胞黏着于表面呈现疏水性的培养容器中而进行培养，则随着所述黏着的间充质细胞的密度增加，间充质细胞从培养容器中脱附而形成细胞集合体。并且，所述培养可以是如下的培养：在由间充质细胞分化成细胞集合体之后，至少再培养12小时以上，或者至少再培养1日以上，例如再培养了12小时至15日、1日至15日、3日至10日、3日至7日或者5日至7日。通过上述培养而形成细胞集合体的方法将会在后面详细说明。

所述纤维化的病理学特征可包括纤维化-特异性或者非特异性症状、纤维化-特异性或者非特异性的组织学形态特性、分子生物学特性、或者病理学特性。例如，纤维化的病理学特征可包括从由如下的病变组成的群中选择的一种或者其组合：比无纤维化的细胞或组织形成过度的结合组织；胶原的沉积；纤维化相关分子的表达、分泌或合成的增加；以及细胞的死亡增加。所述纤维化相关分子可包括纤维化-特异性或者非特异性的标记基因或者蛋白质，例如，可以是从由tgf(transforminggrowthfactor)-β、smad、层粘连蛋白及sma(smoothmuscleactin)组成的群中选择的一种以上。所述tgf-β可包括tgf-β1、2或3，所述smad可包括smad1至8、r-smad、co-smad或i-smad。所述sma作为肌成纤维细胞的标记，在纤维化中，胶原的沉积可因肌成纤维细胞而产生。因此，根据一个具体例的所述细胞集合体或所述细胞集合体内的细胞可表现出如上所述的纤维化的病理学特征。

在本说明书中，术语“纤维化(fibrosis)”可表示在器官或组织形成过多的纤维性结合组织。所述纤维化可包括从由如下的症状组成的群中选择的任意一种：特发性肺纤维化(ipf)、肺纤维化、间质性肺疾病、非特异性间质性肺炎(nsip)、普通型间质性肺炎(uip)、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维化、后腹膜纤维化、进行性肿块纤维化、肾源性全身纤维化、克罗恩病、陈旧性心肌梗塞症、皮肤硬化症/全身硬化症、神经纤维瘤症、hermansky-pudlak综合征、糖尿肾病症、肾纤维化、肥厚型心肌病症(hcm)、高血压相关肾病症、肾小管间质性纤维化、肾小球硬化症(fsgs)、辐射诱导纤维化、子宫肌瘤(fibroids)、酒精性肝病、脂肪肝症、肝纤维化、肝硬化症、c型肝炎病毒(hcv)感染、慢性器官移植排斥、皮肤的纤维性疾病、疙瘩疤痕、杜普伊特伦挛缩、ehlers-danlos综合征、营养障碍性表皮水疱症、口腔黏膜下纤维化、以及纤维增生障碍。

由于根据一个具体例的从间充质细胞分化的细胞集合体是以三维方式培养的产物，因此可理想地模拟生物体内环境，并表现出纤维化的表现型即纤维化中表现的病理学特性，因此可在体外纤维化模型中有效地使用。在本说明书中，术语“纤维化模型(fibrosismodel)”可表示将具有纤维化的器官、组织或细胞的结构或形状模式化的模型，其可以表示为了阐明具有纤维化的器官、组织或细胞间的交互作用、结构或形态之间的关联性而考虑的纤维化模型。因此，纤维化模型可以是如下的模型：表现出纤维化-特异性或非特异性的表现型、表现出纤维化-特异性或非特异性的标记基因或蛋白质的表达。

本发明的另一形态提供一种体外(invitro)纤维化模型的制造方法，包括如下步骤：将间充质细胞黏着于表面呈现疏水性的培养容器中而培养并形成细胞集合体；以及将所述形成的细胞集合体至少额外培养12小时以上，从而使所述细胞集合体形成纤维化的病理学特征。

与所述间充质细胞、细胞集合体及纤维化相关的内容，与上面记载的内容相同。

所述间充质细胞可通过与疏水性表面之间的细胞-基质间交互作用而黏着于培养容器。所述间充质细胞(例如，脂肪干细胞)例如可从人类脂肪组织中分离，人类脂肪组织可包括成熟的脂肪细胞及包围它的结缔组织，且可以从患者自身或者表现型一致的他人处容易获得。此时，与体内位置无关地，可以使用借助于采取脂肪时使用的所有方法而获取的所有脂肪组织，例如，可包括皮下脂肪组织、骨髓脂肪组织、肠系膜脂肪组织、胃脂肪组织或后腹膜脂肪组织。可通过公知的方法而从所述人类脂肪组织中分离出脂肪干细胞。例如，如同国际专利公开第wo2000/53795号及第wo2005/04273号中披露，通过脂肪吸入(liposuction)、沉积、胶原酶(collagenase)等酶处理、借助于离心分离的红血球等浮游细胞去除等过程而从脂肪组织获取。此外，可通过公知方法而从多样的组织分离间充质细胞，例如间充质干细胞、间充质基质细胞、骨髓干细胞或成纤维细胞。

对于如上所述地分离的间充质细胞而言，即使进行数次的传代培养，也直到传代数(passagenumber)达到16为止表现出优良的增殖率。因此，从人类组织分离的多能间充质细胞可在随后的三维细胞集合体形成中直接使用1传代培养细胞，或者使用在60％稠密度(confluency)下培养了10传代以上的细胞。

如果将如上所述地制备的间充质细胞接种到表面呈现疏水性的培养容器而培养，则因培养容器的疏水性表面而在间充质细胞与培养容器之间形成细胞-基质间交互作用，因此间充质细胞借助于物理吸附而在黏着于培养容器表面的状态下增殖。然后，对于形成所述细胞集合体的步骤而言，随着所述黏着的间充质细胞的密度增加，间充质细胞从培养容器中脱附，从而可以形成细胞集合体。

适于本发明的表面呈现疏水性的培养容器可以是如下的培养容器：在普通的细胞培养容器中，用赋予疏水性的高分子进行表面处理，或者由上述高分子进行制造。作为这样的疏水性高分子，例如可以是：聚苯乙烯(polystyrene)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚氯乙烯(pvc)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe)、作为脂肪族聚酯高分子的聚(l-乳酸)(plla)、聚(d,l-乳酸)(pdlla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(己内酯)(pcl)、聚(羟基烷酸酯)、聚二恶烷酮(pds)、聚三亚甲基碳酸酯中选择的一种、或者作为以其为单位的共聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚(l-乳酸-co-己内酯)(plcl)、聚(羟基乙酸-co-己内酯)(pgcl)、或者其衍生物等。并且，培养容器可具有如下的表面：由疏水性表面硅烷化的表面(silanizedsurface)、碳纳米管(cnt)表面、涂覆有烃的表面(hydrocarboncoatedsurface)、或者金属(例如，不锈钢、钛、金、铂等)表面。

而且，在本发明的另一具体例中，为了比间充质细胞与疏水性培养容器表面之间的交互作用所引起的物理吸附更加有效地将间充质细胞黏着于培养容器，可借助于与针对间充质细胞具有黏着活性的生长因子之间的交互作用而黏着于培养容器。例如，在将所述生长因子固定于培养容器表面之后，可利用固定的生长因子与间充质细胞之间的生化学交互作用。

所述生长因子可包括对间充质细胞具有黏着活性的生长因子，作为其例，可包括血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)、血小板诱导内皮生长因子(pdgf)、肝细胞生长因子(hgf)、类胰岛素生长因子(igf)或肝素结合区域(hbd)等。所述生长因子能够以5至100μg/ml的浓度固定于培养容器表面。

针对培养容器表面的生长因子的固定化是将多肽固定于固体基质表面使使用的方法，其可以通过相关技术领域中公知的方法实现，例如可利用物理吸附、基于非选择性化学反应的共价键等。作为这种固定化方法之例，已知如下方法：在将生物素(biotin)结合于蛋白质之后，将该蛋白质应用于由链霉亲和素(streptavidin)或抗生物素蛋白(avidin)处理的固体表面，从而利用生物素-链霉亲和素/抗生物素蛋白结合而将蛋白质固定；利用等离子体而在基板上集聚活性基团(用于利用化学键而固定蛋白质的化学作用基团)，从而将蛋白质固定；利用溶胶-凝胶(sol-gel)法而在固体基板表面形成比表面积充分增加的多孔性溶胶-凝胶薄膜，然后借助于物理吸附而将蛋白质固定于所述多孔性薄膜；通过等离子体反应而将抗血栓性蛋白质固定于聚四氟乙烯(ptfe)表面；将阳离子性氨基酸残基在2个酶中连续融合2个以上的酶结合，从而将蛋白质进行固定；利用基质而将蛋白质固定于与固体状支撑台相结合的疏水性高分子层；在塑料表面利用缓冲成分固定蛋白质；在酒精溶液中将蛋白质接触于具有疏水性表面的固体表面，从而将蛋白质进行固定。

在一个具体例中，可使用重组方面可实现大量表达及容易精制的多肽链而以在所述多肽链的羧基末端融合有生长因子的氨基酸末端的多肽链-生长因子重组蛋白质形态执行固定化。

适于本发明的多肽链(linker)通过其羧基末端而与生长因子的氨基末端结合，并可通过存在于该氨基末端的疏水性区域而被吸附于具有疏水性表面的培养容器，可包括如下的多肽链：在重组方面可实现大量表达和容易的精制，且不会对间充质细胞的培养产生影响。这种多肽链可包括：麦芽糖结合蛋白质(maltose-bindingprotein；mbp)、疏水蛋白(hydrophobin)或疏水性细胞穿透肽(hydrophobiccellpenetratingpeptides；cpps)等。

如上所述，如果将间充质细胞在表面呈现疏水性的培养容器中借助于细胞-基质间交互作用而物理接触并培养，或者借助于与固定在所述培养容器表面的生长因子之间的生化学交互作用而结合于生长因子的状态培养，则在初期能够以间充质细胞黏着于培养容器表面的状态增殖。所述间充质细胞能够以1×10³至1×10⁷细胞/cm³的浓度被播种。而且，所述培养温度可以是35℃至38.5℃，用于形成细胞集合体的培养期间可以是4小时至2日，例如可以是1日。适于所述培养的培养基为在间充质细胞的培养和/或分化中通常使用的培养基，只要包含血清或无血清，则可不加限制地使用，例如可以使用在dmem(dulbeco'smodifiedeaglemedium)、ham'sf12、它们的混合物等中添加血清的培养基。

然后，间充质细胞以黏着于培养容器表面的状态增殖，如果在高细胞密度下细胞-细胞间交互作用变得强于细胞-基质间交互作用，则间充质细胞从培养容器表面脱附，从而以浮游于培养液内的状态增殖，并相互凝集，从而可以形成肉眼可检测的大小的浮游的三维细胞集合体(cellcluster)。

在一个具体例中，在作为表面呈现疏水性而与之对应的细胞黏着相对较弱地发生的培养容器的由聚苯乙烯制造的非组织细胞培养用板(non-tissuecultureplate；ntcp)中接种间充质细胞，从而可以诱导三维细胞集合体的形成。接种到聚苯乙烯ntcp的间充质细胞在初期借助于细胞-基质间交互作用而在板表面被诱导较弱的细胞黏着，并以黏着的状态以二维单层的方式增殖，如果细胞的密度随着培养时间的经过而提高，则比起细胞-基质间交互作用而言，细胞-细胞间交互作用更强地作用，于是以二维单层的方式培养的细胞从培养容器表面脱附。此时，可以在初期将间充质细胞以黏着于培养容器表面的状态培养，而如果以不从初期开始发生细胞黏着而以浮游的状态培养，则形成的三维细胞集合体的大小较小，且可能呈现出大部分的细胞死亡的现象。如果将从培养容器脱附的细胞以浮游于培养液内的状态更进一步培养，则借助于细胞-细胞间交互作用而使细胞相互凝集，并可能形成三维细胞集合体。如此形成的三维细胞集合体中，虽然细胞在初期较弱地结合，但却随着培养时间的经过而借助于细胞-细胞间交互作用而使得形成细胞集合体的细胞之间的黏着力得到强化，从而可以形成稠密(compact)的三维细胞集合体。

并且，如果将上述形成的细胞集合体额外地培养12个小时以上，则细胞集合体或细胞集合体内的细胞中，可形成纤维化的病理学特征。所述额外的培养时间可以是至少12个小时以上、或至少1日以上，例如可以是12小时至15日、1日至15日、3日至10日、3日至7日、或者5日至7日。关于所述纤维化的病理学特征，如同上面的记载。

所述三维细胞集合体能够以所形成的三维细胞集合体形态增殖并分化成血管内皮细胞。如果间充质细胞以三维细胞集合体形态得到培养，则随着细胞集合体的形成，朝向内部的氧穿透减少，因此可能造成低氧状态。细胞集合体内部造成的低氧状态诱导出对血管内皮细胞的分化产生影响的多样的血管新生促进因子的生成，其结果可以实现向血管内皮细胞的分化。

对于如上所述地将间充质细胞黏着于培养容器表面而培养形成的三维细胞集合体而言，具有肉眼可检测的大小，例如具有300μm至2000μm的直径，从而可借助于过滤或离心分离等方法而容易回收。对于如此回收的三维细胞集合体而言，借助于利用胶原酶、胰蛋白酶或分散酶(dispase)的酶处理、利用压力的机械处理、或者它们的并用处理，可将集合体形态瓦解而以单细胞形态使用，或者将三维细胞集合体形态直接使用。

本发明的又一形态提供一种纤维化治疗剂的筛选方法，包括如下步骤：对所述体外纤维化模型处理被检测物质；以及在所述体外纤维化模型的细胞集合体或所述细胞集合体内的细胞中，与无处理对照组进行比较，从而将表现出纤维化病理学特征的改善或治疗的被检测物质作为用于治疗纤维化的候选物质而进行挑选。

关于所述间充质细胞、细胞集合体及纤维化的内容，与上述内容相同。

在上述筛选方法中，被检测物质可以是从由如下的物质组成的群中选择的任意一种：低分子化合物、抗体、反义核苷酸、小干扰rna(shortinterferingrna)、短发夹rna(shorthairpinrna)、核酸、蛋白质、肽、其他提取物及天然物。

并且，在所述筛选方法中，所述纤维化病理学特征可包括：纤维化-特异性或非特异性的症状、纤维化-特异性或非特异性的组织学形态特性、分子生物学特性或病理学特性。例如，纤维化的病理学特征可包括从由如下的病变组成的群中选择的一种或者其组合：比起无纤维化的细胞或组织而言，形成过度的结合组织；胶原的沉积；纤维化相关分子的表达、分泌或合成的增加；以及细胞的死亡增加。所述纤维化相关分子可包括纤维化-特异性或非特异性标记基因或蛋白质，例如可以是从由tgf(transforminggrowthfactor)-β、smad、层粘连蛋白及sma(smoothmuscleactin)所组成的群中选择的一种以上。所述tgf-β可包括tgf-β1、2或3，所述smad可包括smad1至8、r-smad、co-smad或i-smad。所述sma作为肌成纤维细胞的标记，在纤维化中，胶原的沉积可源于肌成纤维细胞。因此，例如，将所述用于治疗纤维化的候选物质进行挑选的步骤可以是：被检测物质相较于无处理对照组而在细胞集合体或细胞集合体内的细胞的结合组织的形成、胶原沉积或胶原纤维质的厚度减小的情况下、或者增大细胞的生存率的情况下，将所述被检测物质作为用于治疗纤维化的候选物质而进行挑选。所述纤维化的表现型，即结合组织的形成与否、胶原沉积与否或者胶原纤维质的厚度测定可借助于本领域技术人员所公知的h&e染色、mt染色、免疫荧光染色、或免疫组织化学染色等而确认，细胞的生存率或死亡程度则可借助于ldh试验或生存/死亡试验(live/deadassay)而确认。而且，当所述被检测物质使纤维化相关分子即纤维化-特异性或非特异性标记基因或蛋白质的表达减小或增加时，可将所述被检测物质作为用于治疗纤维化的候选物质而进行挑选。例如，当所述被检测物质使tgf-β、smad、层粘连蛋白或sma的表达减小时，所述被检测物质可作为用于治疗纤维化的候选物质而得到挑选。用于测定所述表达的方法可包括从由如下的方法组成的群中选择的任意一种方法：反转录聚合酶连锁反应(rt-pcr)、酶免疫分析法(elisa)、免疫组织化学、蛋白质印迹法(westernblotting)及流细胞分析法(facs)。

有益效果

根据基于一个形态的体外纤维化模型及其制造方法，可作为三维细胞集合体而理想地模拟生物体内环境，且表现出纤维化的表现型即在纤维化中呈现出的病理学特性，因此具有可在纤维化研究或治疗剂筛选方法中有效地使用的技术效果。

附图说明

图1a为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的扫描电子显微镜图像的照片。

图1b为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的h&e染色结果的照片。

图2是将根据一个具体例的三维细胞集合体的低氧状态用免疫荧光染色确认的结果的图。

图3为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的tgf-β表达的图。

图4为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的纤维化相关因子的表达的图。

图5a为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原沉积用免疫荧光染色及羟脯氨酸含量分析进行确认的结果的图。

图5b为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原沉积用免疫荧光染色及羟脯氨酸含量分析进行确认的结果的曲线图。

图6为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原ⅰ型(collagentypei)沉积用免疫荧光染色进行确认的结果的图。

图7为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原ⅰ型沉积用免疫化学染色进行确认的结果的图。

图8为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体利用透射电子显微镜观察的图像的图。

图9a为表示对根据一个具体例的三维细胞集合体的细胞生存率及死亡进行分析的结果的图。

图9a为表示对根据一个具体例的三维细胞集合体的细胞生存率及死亡进行分析的结果的图。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。然而，这些实施例仅用于示例性地说明本发明，本发明的范围并不被这些实施例所限定。

实施例：体外(invitro)纤维化模型的制造及其纤维化模型化特性分析

(1)体外(invitro)纤维化模型的制造

(1.1)人类脂肪干细胞(humanadiposestemcell:hasc)的分离

将天主教大学(韩国)整形外科研究室中分配提供的正常人的皮下脂肪组织利用含有1％青霉素/链霉素(ps)的pbs洗涤了3次，而将污染的血液去除之后利用手术用剪刀细碎地切碎(chopping)。将该脂肪组织浸泡在含有1％bsa(w/v)、0.3％胶原酶类型1及1％ps的组织溶解液(dmem/f-12、welgene)，然后在37℃下搅拌(orbitalshaking)1小时。然后，将上层液体倒除，并将细胞悬浊液用250μmnitex过滤器(sefaramericainc)进行过滤，从而去除组织碎片(debris)，并以1,000rpm进行了历时5分钟的离心分离。针对借助于离心分离收集到的细胞，在含有10％bsa的dmem/f-12中进行了再次悬浊。针对分离的1次细胞，在具有5％co2和95％空气的37℃的湿润的大气中，历时24小时覆盖于组织培养烧瓶(tissuecultureflask)。然后，将非贴附性细胞用相同体积的新鲜的培养基更换而去除。利用相位差显微镜观察了贴附性hasc的形态，然后对所有实验使用了5传代的hasc。

(1.2)源自脂肪干细胞的三维细胞集合体的制造

为了从所述获取的脂肪干细胞制造三维细胞集合体，将所述脂肪干细胞在非-组织细胞培养用96-孔板(non-tissueculturetreated96-wellplate；"ntcp"；为聚苯乙烯材料，表面呈现疏水性；falcon公司)中培养。所述板为涂覆有融合蛋白质mbp(maltosebindingprotein)-fgf(fribroblastgrowthfactor)的板，针对涂覆有所述融合蛋白质的板，韩国专利第1109125号中已予记载，其全部作为参考而被包含于本说明书。具体而言，在所述孔板中接种了每孔对应1×10⁵细胞/cm³的脂肪干细胞，然后在含有10％fbs的dmem/f-12培养基中进行培养。在培养24小时以内，在各个细胞黏着表面中形成了脂肪干细胞的三维细胞集合体。为了针对所述形成的三维细胞集合体的纤维化模型特性分析，收集了培养第一天(1day)、第三天(3day)及第五天(5day)的三维细胞集合体。而且，所述三维细胞集合体被确认为具有约500μm以上的直径。以下，将三维细胞集合体表示为“3dcm”。

并且，作为比较例，以二维方式培养了脂肪干细胞。具体而言，在组织细胞培养用96孔板(tcp)中接种了每孔对应1×10⁵细胞/cm³的的脂肪干细胞，然后在含有10％fbs的dmem/f12培养基中进行了培养，且与上述三维细胞集合体相同地，为了分析纤维化模型特性，收集了第一天(1day)、第三天(3day)及第五天(5day)的细胞。以下，将以二维方式培养的细胞表示为“2d”。

(2)体外(invitro)纤维化模型的纤维化模型化特性分析

(2.1)源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的特性分析

为了分析源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的形态特性，执行了扫描电子显微镜及h&e染色。并且，为了确认所述三维细胞集合体内部的低氧状态，执行了免疫染色。

具体而言，为了扫描电子显微镜观察，针对上述收集的三维细胞集合体，利用2.5％戊二醛而在4℃下历时2小时进行了固定，并利用脱离子水中1％四氧化锇(osmiumtetroxide)而进行了后固定。将固定的三维细胞集合体利用一系列浓度的乙醇(50％、70％、80％、90％及100％)而脱水了2遍。在脱水之后，将三维细胞集合体在六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane:hmds)中浸泡了2分钟，并振动干燥了一天。为了获得扫描电子显微镜图像，将三维细胞集合体贴附于贴附性碳胶带，并利用金而在10ma下历时60秒进行了溅射镀膜，在15kv下获得了图像，并将其结果示于图1a。

并且，为了h&e染色，将所述收集到的三维细胞集合体历时30分钟而在常温下用4％pfa固定，并利用一系列浓度的乙醇(50％、70％、80％、90％及100％)予以脱水，并投入到石蜡中。制造出4μm厚度的切片，并利用苏木精和伊红(h&e)而进行了染色。将切片去石蜡化，并利用蒸馏水进行水化，然后利用pbs洗涤了三次。然后，历时10秒而在苏木精(harris；sigma-aldrich)中浸泡，并在流动的水中历时10至15分钟进行了洗涤，并历时15秒而利用伊红进行了复染，然后再次历时10至15分钟进行了洗涤。然后，放到滑块上并利用光学显微镜进行了观察，其结果示于图1b。

而且，为了进行低氧免疫荧光分析，在上述各个培养时间点进行收集之前，将三维细胞集合体利用0.1ml溶液中的10mmol盐酸吡哆醇(pimonidazolehydrochloride)(羟基探针(hypoxyprobe^tm-1)套件；hypoxyprobe,usa)而历时2小时进行了培养。然后，收集三维细胞集合体，并利用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)而在4℃下历时30分钟进行了固定，并在oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)中进行了包埋。将6μm的冷冻切片利用pbs进行了洗涤，然后为了防止非特异性结合而利用pbs中4％bsa而历时1小时进行了培养。哌莫硝唑则借助于一次小鼠抗体(羟基探针)和二次羊抗鼠alexa488抗体(invitrogen)而检测。并且，为了核染色而使用了dapi(4,5-二氨基-2-苯基吲哚)(vectorlaboratories)。对照组则在相同的条件下以无一次抗体方式执行，并利用共聚焦显微镜(carlzeiss)进行了观察，其结果示于图2。

图1为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的扫描电子显微镜图像及h&e染色结果的图。

图2为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的低氧状态利用免疫荧光染色确认的结果的图。

如图1所示，可以确认，培养第一天的三维细胞集合体的外部表面稠密地表现基于h&e的染色，因此可确认借助于纤维性矩阵而使细胞连接。随着培养继续进行，培养第三天的三维细胞集合体的细胞之间的间距减小，培养第五天的三维细胞集合体的细胞之间的间距几乎不存在(箭头)。

并且，如图2所示，培养第一天的dapi-染色细胞在三维细胞集合体整体中均匀分布，并可确认更多的低氧探针阳性细胞存在于三维细胞集合体的内部。随着培养继续进行，培养第三天的三维细胞集合体内部的低氧探针阳性细胞增加，而且可以确认对于培养第五天的三维细胞集合体而言，外部的低氧探针阳性细胞也有所增加。据此，可知低氧在三维细胞集合体的内部被诱导，且扩散到了外部。其与图1的结果相关，从而可知由于三维细胞集合体的外部表面的细胞之间的间距关闭，从而诱导低氧。在纤维化中，tgf-1为重要的相关因子，tgf-1在低氧中过度表达。即，如果细胞与细胞之间的间距变窄，则细胞集合体内部的氧的供应受限，而且tgf-1被诱导而诱发纤维化。因此，由于上述结果，可以确认对于根据一个具体例的三维细胞集合体而言，模型化了纤维化的病理学特性。

(2.2)源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的纤维化相关因子分析

tgf-β为纤维化的主要分子，且因低氧条件而被诱导，为了确认在源于脂肪干细胞的三维细胞集合体中，纤维化相关因子是否被表达，对包含tgf-β的纤维化相关因子执行了elisa。

具体而言，为了测定总tgf-β1的量，由正常细胞ncc(normalcellconcentration)、以二维方式培养的细胞(2d)、以及三维细胞集合体(3dcm)制造了培养基。为了将潜在的tgf-β1以免疫反应性形态激活，将培养上层液用1nhcl进行培养，并用1.2nnaoh/0.5mhepes进行中和。使用quantikineelisa人类tgf-β1套件(r&dsystem)而根据制造商的指示执行了试验。使用multisakn(thermo)而在560nm下测定吸光度，其结果示于图3。

并且，为了确认三维细胞集合体的纤维化相关因子的表达，根据制造商的指示而利用三唑试药(invitrogen,usa)从上述收集到的三维细胞集合体提取了总rna。将提取出的rna溶解于核酸酶去除水，并使用nanodropnd1000分光光度计(spectrophotometer)(thermofisherscientific)而将rna浓度定量化。使用maximertpremix(intron)而根据制造商的指示执行了互补dna合成。从先驱者(bioneer)购入所有的靶引物而使用。使用abiprism7500(appliedbiosystems)而执行了所有聚合酶连锁反应，并使用sybrpremixextaq(takara)而将基因表达水平定量化。使用相对性ct方法(comparativectmethod)而计算出相对基因表达水平，其结果示于图4。

图3为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的tgf-β表达的图。

图4为表示根据一个具体例的三维细胞集合体的纤维化相关因子的表达的图。

如图3和图4所示，可确认，对于源于脂肪干细胞的三维细胞集合体而言，比起正常细胞和2d，包含tgf-β的纤维化相关因子即层粘连蛋白、sma(smoothmuscleactin)、胶原i型及smad3的表达增加。

(2.3)源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的胶原沉积分析

为了分析源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的总胶原沉积，执行了免疫荧光染色、免疫组织化学染色、羟脯氨酸(hydroxyproline)定量，并利用透射电子显微镜进行了观察。

具体而言，为了mt染色(massontrichromestaining)，而与所述h&e染色相同地执行了前处理，并利用masson'strichrome进行了染色。在三维细胞集合体中，使用imagej软件(nih)而对数字图像内的被染色的胶原面积的像素数进行了计数，从而确定了三维细胞集合体中的纤维化百分比，其结果示于图5a。而且，为了执行羟脯氨酸试验，使用ripa缓冲物而准备了以二维方式培养的细胞和三维细胞集合体，并利用12nhcl而在120℃下历时3小时执行了水解。根据制造商的指示，使用羟脯氨酸套件(sigma-aldrich)执行了试验。使用multisakn(thermo)而在560nm下测量了吸光度，其结果示于图5b。

并且，为了免疫荧光染色(immunofluorescence；if)，如同所述h&e染色，固定住三维细胞集合体，并包埋于oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)，且在-28℃下冻结并以6μm厚度截切。为了避免非特异性结合，将切片在常温下历时1小时而在bsa(4％)下进行培养。然后，在4℃下利用针对胶原i的一次抗体(rabit,abicam)而进行了一夜的培养。然后，利用pbs洗涤了试料，然后用1％bsa内的相应的荧光共轭二次抗体(donkeyanti-rabbit)(lifetechnologies)而历时1小时而在常温下进行了培养。而且，将dapi(4,5-二脒基-2-苯基吲哚)(vectorlaboratories)用于核染色。对照群则在相同的条件下以无一次抗体方式执行，并利用共聚焦显微镜(carlzeiss)进行了观察，其结果示于图6。

而且，为了免疫组织化学染色，与所述h&e染色相同地进行了前处理。分别使用小鼠单克隆抗体和fn及ln所对应的山羊多克隆抗体(santacruzbiotechnology)而检测出纤维连接蛋白(fn)和层粘连蛋白(ln)。为了αsma分析，使用小鼠单克隆抗体(dako)而进行检测。在4℃下分别用它们的一次抗体进行了一夜的培养，然后利用辣根标记抗鼠(horseradishlabelledanti-mouse)(fn和αsma)及抗羊(ln)二次抗体(vector)而在常温下历时1小时培养了切片。阳性染色则利用二氨基联苯胺(diaminobenzidine)(dab,vector)而进行了视觉化。阴性对照组则在相同的条件下以无一次抗体方式执行。利用苏木精而复染切片，并在普通的光学显微镜下观察，其结果示于图7。

并且，为了透射电子显微镜观察，如同所述扫描电子显微镜观察，对试料进行了前处理。附加地，将固定的三维细胞集合体利用环氧树脂(epoxyresin)进行了浸润，并包埋，且在60℃下历时24小时进行了聚合。利用超薄切片机(ultramicrotome)(ultracutc,leicaco.ltd)制造超薄切片，并利用醋酸铀和柠檬酸铅进行了染色。使用冻结tem(cryotecanaif20,feico.ltd)观察了图像，其结果示于图8。

图5为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原沉积利用免疫荧光染色和羟脯氨酸含量分析进行确认的结果的图。

图6为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原ⅰ型沉积利用免疫荧光染色进行确认的结果的图。

图7为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体的胶原ⅰ型沉积利用免疫化学染色进行确认的结果的图。

图8为表示将根据一个具体例的三维细胞集合体利用透射电子显微镜进行观察的图像的图。

如图5所示，可确认在mt染色中胶原在三维细胞集合体中被染色了众多，并可确认羟脯氨酸含量也比起用二维方式培养的细胞而言在三维细胞集合体中增加。

并且，如图6所示，可确认在免疫荧光染色中胶原i型在三维细胞集合体中显著增加。

并且，如图7所示，可确认免疫化学染色中αsma在三维细胞集合体中显著增加。αsma作为肌成纤维细胞的典型标记，胶原i型在纤维化中由肌成纤维细胞合成，因此可知上述结果与图6的结果一致。

而且，如图8所示，可确认如下的事实：在透射电子显微镜图像中，随着三维细胞集合体中培养期间变长，胶原纤维质(fiber)和胶原沉积渐进地增加。具体而言，更厚的胶原纤维质在培养第五天被观察(箭头)，这源于胶原的交联。并且可确认，在培养第五天，三维细胞集合体的内部的如初的细胞结构几乎无法被观察到。基于上述结果，沿着细胞周围，胶原纤维质变得更厚，而且这迎接营养成分的输送而引起细胞死亡，因此可确认，根据一个具体例的三维细胞集合体模型化纤维化的病理学特性。

(2.4)源于脂肪干细胞的三维细胞集合体的细胞生存率及死亡分析

胶原沉积在纤维化中最终诱导细胞死亡，因此为了确认这样的特性是否在源于脂肪干细胞的三维细胞集合体中也出现，执行了ldh试验和生存/死亡试验(live/deadassay)。

具体而言，为了执行ldh试验，测定了正常细胞ncc(normalcellconcentration)、以二维方式培养的细胞(2d)及三维细胞集合体(3dcm)培养基中的绝对性乳酸脱氢酶(ldh)释放。使用ldh试验套件(promega)而根据制造商的指示执行了上述测定。使用multisakn(thermo)而在490nm下测定了吸光度，其结果示于图9a。并且，根据制造商的指示，使用生存/死亡试验套件(molecularprobes)而执行了生存/死亡试验。简而言之，将收集到的三维细胞集合体利用含有1μl的绿色荧光核酸染色溶液(syto10)和1μl的红色荧光染色溶液(ethidiumhomodimer-2)的1ml的hepes-缓冲盐水(hbss)进行了处理，并在co2培养器中历时30分钟进行了培养。然后，将三维细胞集合体利用pbs而洗涤了3遍，并历时30分钟而用4％pfa进行固定，且包埋于oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)，并在-28℃下冻结并以10μm厚度切割。将整个三维细胞集合体完全截切，并从各个试料的中间和外侧部挑选择出2个滑块。使用共聚焦显微镜(carlzeiss)而分析了切片，其结果示于图9b。

图9为表示对根据一个具体例的三维细胞集合体的细胞生存率和死亡进行分析结果的图。

如图9a所示，可确认，在ldh试验中，三维细胞集合体比起正常培养细胞和2d而言ldh水平有所增加。而且，如图9b所示，与图9a的结果一致地，在三维细胞集合体中细胞死亡以视觉方式得到验证。

基于以上结果可知，根据一个具体例的三维细胞集合体表现出纤维化的病理学特性，因此可作为体外(invitro)纤维化模型有效地使用。