与互补碱基序列或包含错配碱基的互补碱基序列相连接的聚合酶链式反应引物及利用其的核酸扩增方法与流程

本发明涉及直接与引物的5'位置相连或者借助连接肽(linker)相连接的互补碱基序列或在互补碱基序列内包含错配(mis-matched)碱基序列的用于聚合酶链式反应(nucleicacidpolymerasechainreaction，以下称为“pcr”)的引物及其用途，更详细地，涉及直接在正向(forward)引物或反向(reverse)引物的5'末端使用互补碱基序列或包含错配碱基序列的互补碱基序列或者使用肌苷(inosine)作为连接肽(linker)的用于聚合酶链式反应的引物及包括在包含上述引物的聚合酶链式反应组合物中混合核酸模板后对上述混合物执行聚合酶链式反应的步骤的聚合酶链式反应方法和互补引物(complementaryprimer，cp)及其用途。

背景技术：

分子诊断检查或核酸诊断检查必不可少的聚合酶链式反应构成要素需要dna聚合酶、引物对、脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)、二价镁离子(mg++)及其他缓冲液(buffer)。为了使这些反应广泛地被使用，需要扩增具有高特异性和准确性的感兴趣的目标基因。

为了实现强大的聚合酶链式反应性能(robustpcrperformance)，需要如单拷贝(single-copy)dna分子检测(wabuyele，m.betal.singlemol.，2001，2：13-21)或血液媒介感染(elnifro，e.m.etal.clin.microbiol.rev.，2000，13：559-570)等高度敏感的分析性聚合酶链式反应。

通常，为了进行聚合酶链式反应，确保与所要检测的目标(target)基因有关的信息，进行引物&探针设计(design)。此时，尽管以在退火(annealing)温度下且仅使在模板(template)dna/rna中很好地杂交的方式研究所设计的引物序列(sequence)及长度，但还通常发生脱靶扩增(off-targetamplification)。认为其原因在于，在进行pcrmaster-mix准备或向初期变性温度的热循环仪的加热(thermalcyclerramping)时的低温条件(chou，qetal.nucleicacidsres.，1992，20：1717-1723)。在这种条件下的引物以多于目标的浓度存在，部分互补部位或引物之间进行非特异性反应。这些非特异性引物复合物(complex)在所期望的目标部位进行竞争性反应来抑制敏感度，以呈现高的对照(background)的原因来起作用。尤其在引物二聚物(dimer)的情况下，以聚合酶链式反应中的引物人工产品(artifacts)来制备复杂混合物(complexmixture)。

有多种提高聚合酶链式反应的特异度并广泛使用的方法，但其中的一种方法为使用热启动(hotstart)技术。此技术提高温度来使引物/目标杂交反应维持特异度，从而在pre-pcrmixture准备时，妨碍dna聚合酶过早的延伸(prematureextension)的方法(alexandrev.l.etal.lebedeva.v.et.al.，nucleicacidsres.，2008，36：e131.)。被使用的其他方法有物理区分反应结构物来使聚合酶链式反应不产生的方法(quinchouetal.，nucleicacidsres.，1992，20：1717-1723)、使用附属(accessary)蛋白的方法(clark,d.r.etal.u.s.pat.no.2006057617)、使用与dna聚合酶有关的抗体的方法、制备二价镁焦磷酸盐复合物(mg++-pyrophosphatecomplex)来阻止在低温下的非特异性反应的方法(bioneer)等。

除了调节反应结构物来提高特异度的方法以外，报告有使引物变形来提高特异度的多种方法。其中有加入竞争序列(competitorsequence)来使用的方法、利用引物的第二次结构的方法、增加杂交选择性(hybridizationselectivity)的方法及粘贴两种引物来使用的双低聚糖(dualprimingoligo)方法(seegene)。并且，作为3'-变型(modification)方法，报告有阻止(block)引物延长(extension)直到3'→5'核酸外切酶(exonuclease)被去除的方法、借助uv照射来去除的阻止(blocking)方法及热脱保护(thermaldeprotection)方法等。

这些方法虽具有减少非特异性反应的效果，但存在使用额外的酶的问题、追加额外的活性化条件、特定的核苷(specificnucleoside)变形、基于结构复杂的引物设计的与该目标基因(targetgene)的变种有关的覆盖(coverage)困难、敏感度减少等缺点。

现有专利文献

韩国专利公开号第1020040005426号

技术实现要素：

技术问题

本发明为了解决上述问题且根据上述必要性而提出，本发明的目的在于，提供在聚合酶链式反应中，减少基于扩增产物增加的敏感度增加及非特异发生的反应的引物。

本发明的另一目的在于，提供在聚合酶链式反应中，减少基于扩增产物增加的敏感度增加及非特异发生的反应的方法。

解决问题的方案

为了达成上述目的，本发明提供引物，作为由下述结构式1表示的用于基因扩增的引物，包含在直接与用于扩增特定基因序列的相应序列有关的引物的5'末端相连接或者借助肌苷(inosine)连接肽(linker)相连接的错配(mis-matching)核苷酸，从而包含形成气泡结构的互补双链的核苷酸：

结构式1：

在本发明中，优选地，在上述引物中，包含用于扩增特定基因序列的相应序列的互补核苷酸序列xa和与xa互补的错配核苷酸序列x'a，xa和x'a由通用碱基或非识别性碱基(non-discriminatorybase)的核苷酸序列ya连接而成。

根据本发明的一实例，优选地，在上述引物中，错配核苷酸的气泡结构由一个以上的双链序列连接而成，更优选地，在上述引物中，错配核苷酸的气泡结构由一个至四个双链序列连接而成，但不限定于此。

根据本发明的再一实例，优选地，上述引物具有在x'a和xa的双链包含一个以上的气泡的结构，更优选地，上述引物具有在x'a和xa的双链包含一个至三个气泡的结构，但不限定于此。

根据本发明的另一实例，优选地，上述引物包含互补碱基序列(x'a)内的错配核苷酸的个数为一个以上的碱基序列，更优选地，上述引物包含互补碱基序列(x'a)内的错配核苷酸的个数为3个至12个的碱基序列，但不限定于此。

根据本发明的还有一实例，优选地，上述引物具有在ya也包含0个以上的通用碱基或非识别性碱基的气泡结构，更优选地，上述引物具有在ya也包含0个至9个通用碱基或非识别性碱基的气泡结构，但不限定于此。

根据本发明的又一实例，优选地，上述引物选自由记载于序列3至15、序列18至19及序列22至29的引物组成的组中的一个以上，但不限定于此。

根据本发明的又一实例，优选地，上述引物分别独立地或一同使用于用于基因扩增的正向(forward)位置及反向(reverse)位置。

并且，本发明提供如下的扩增特定基因的方法，即，在由rna扩增特定基因序列的过程中，利用本发明的上述引物并借助用于逆转录反应的逆转录聚合酶来合成cdna，以上述cdna为模板来使用本发明的上述引物，从而扩增特定基因。

根据本发明的一实例，优选地，在上述扩增特定基因的方法中，使用本发明的上述引物来对rna模板进行逆转录反应后，一步进行特定基因扩增反应。

并且，本发明提供用于基因扩增的组合物，包含本发明的上述引物作为有效成分，并使用于用于对dna及rna进行基因扩增的聚合酶连锁反应法、实时聚合酶连锁反应法或等温扩增法。

根据本发明的一实例，优选地，上述用于基因扩增的组合物还包含选自由具有5'→3'核酸外切酶(exonuclease)活性的taq聚合酶(polymerase)、热启动(hotstart)taq聚合酶、pfu聚合酶及5'→3'核酸外切酶(-)、具有3'→5'核酸外切酶(-)活性的克列诺(klenow)聚合酶组成的组中的一个以上的聚合酶，但不限定于此。

并且，本发明提供扩增特定基因的试剂盒，包含本发明的上述引物作为有效成分，并对与感染性疾病、遗传性疾病、耐药性、药物抗性及感受性样品的dna及rna有关的特定基因进行扩增。

本发明的引物对于上述各个引物及引物对的碱基序列，可包含一个以上的碱基缺失、取代或加成的碱基序列。

本发明的引物及引物对可包含不改变基本性质的追加的特征。即，可利用该领域中公知的多种方案来对碱基序列进行变形。这种变形的例有，甲基化、帽化、取代成作为核苷酸的一个以上的同族体以及核苷酸可变形为膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯或氨基甲酸酯等未带电的连接体或硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯等带电的连接体。并且，核酸可具有核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚l赖氨酸等蛋白质、吖啶或补骨脂素等添加剂、金属、放射性金属、铁氧化物等螯合剂及烷化剂等一个以上的额外共价键合的残基。

并且，可利用能够直接或间接提供可检测的信号的标记来对本发明的引物及引物对的碱基序列进行变形。上述引物及引物对可包含利用分光学、光化学、生化学、免疫化学或化学方案来能够检测的标记。有用的标记包含32p、荧光染料、电子密集试剂、酶(通常用于酶联免疫吸附测定(elisas))、生物素或半抗原及抗血清或单克隆抗体可利用的蛋白质。

本发明的引物及引物对可通过包含直接的化学合成法的任意的其他公知的方法来化学合成。例如，上述直接的化学合成法为适当的序列的克隆及限制酶分解及纳兰(narang)等磷酸三酯方法(1979，meth，enzymol.68：90-99)，beaucage等二乙基亚磷酰胺方法(1981，tetrahedronlett.22：1859-1862)、及美国专利第4458066号的固体支撑方法。

以下，说明本发明。

本发明的目的在于，在用于聚合酶链式反应的引物中，直接与5'位置相连接或者借助连接肽相连接的互补碱基序列或在互补碱基序列内包含错配碱基序列，从而在聚合酶链式反应中，减少基于扩增产物增加的敏感度增加及非特异发生的反应。

本发明涉及直接与引物的5'位置相连接或者借助连接肽相连接的互补碱基序列或在互补碱基序列内包含错配碱基序列的聚合酶链式反应引物，更详细地，涉及直接在正向引物或反向引物的5'末端使用互补碱基序列或包含错配碱基序列的互补碱基序列或者使用肌苷作为连接肽的用于聚合酶链式反应的引物及包括在包含上述引物的聚合酶链式反应组合物中混合核酸模板后对上述混合物执行聚合酶链式反应的步骤的聚合酶链式反应方法。本发明的聚合酶链式反应引物包含与碱基序列互补或在互补碱基序列内部分错配碱基序列，从而具有可减少在扩增反应中发生的非特异反应的优点。

以下，详细说明本发明。

本发明提供在正向引物或反向引物的5'部位直接或借助连接肽来连接互补碱基序列或包含错配碱基序列的互补碱基序列部位的聚合酶链式反应引物。

在本说明书中，“互补碱基”是指在正向引物或反向引物的碱基序列具有互补序列的碱基，相应碱基的方向位于正向引物或反向引物的5'末端方向。在互补碱基中包含的“错配碱基序列”是指与正向引物或反向引物的碱基序列错配的碱基序列，作为dna碱基，可任选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿苷中。若在互补引物中无错配碱基的个数，则与引物的松动现象有关的解链温度(tm)值变高，由此，不利于在模板dna的碱基序列进行退火，从而不执行扩增反应。并且，若在互补引物中的错配碱基的个数大于13个，则引物的解链温度值显著地变低，由此，错配碱基个数增多，从而可在聚合酶链式反应执行期间导致非特异反应。因此，本发明的引物(cp)根据错配碱基的个数来产生气泡，起到错配碱基的个数越多，解链温度越低的作用。由此，在作为气泡部位的互补序列内的错配碱基部位形成一个至三个气泡。

引物与互补引物的可直接连接或使用连接肽来连接，此时所使用的碱基为肌苷，未特别限定肌苷碱基的个数，但优选为1个至9个。并且，本发明提供包含dna聚合酶、dntps、反应用缓冲溶液及上述聚合酶链式反应引物的用于聚合酶链式反应扩增的组合物。

作为上述反应用缓冲溶液，可适当地对包含三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)、氯化钾(kcl)、硫酸铵((nh4)2so4)、氯化镁(mgcl2)等成分的常规的聚合酶链式反应缓冲溶液进行变形来使用。上述dntps是指datp、dttp、dutp、dgtp及dctp，并非限定于可使用的dna聚合酶或特定的酶或热启动(hotstart)效果。在本发明的优选实施例中，使用taqdna聚合酶(5'→3'exo+)、热启动taqdna聚合酶(5'→3'exo+)、ventdna聚合酶(5'→3'exo-)，pfudna聚合酶(3'→5'exo+)来执行了聚合酶链式反应。并且，上述用于聚合酶链式反应扩增的引物的浓度可在0.2～1um范围内，该领域技术人员可容易地确定适当的引物浓度。

本发明涉及包括利用聚合酶链式反应引物来在包含上述引物的聚合酶链式反应组合物中混合核酸模板后对上述混合物执行聚合酶链式反应的步骤的聚合酶链式反应扩增方法，在上述聚合酶链式反应引物中，直接与在所要扩增的引物的5'末端部位相连接或者借助连接肽相连接的互补碱基序列或在互补碱基序列内包含错配碱基序列。

上述聚合酶链式反应反复执行变性、退火及延伸步骤，这种聚合酶链式反应原理对于技术人员是明确的。优选地，上述变性、退火及延伸温度分别在85℃至95℃执行1秒至60秒、在40℃至70℃执行1秒至60秒及在50℃至75℃执行1秒至60秒，根据反应条件，可适当地调节温度范围及时间。例如，根据本发明的优选实施例，在引物内的2～3个错配碱基被取代的情况下，解链温度(以下，称为“tm”)约降低5～10℃，在引物内的4～6个错配碱基被取代的情况下，解链温度(以下，称为“tm”)约降低10～20℃，在引物内的7～12个错配碱基被取代的情况下，解链温度(以下，称为“tm”)约降低20～30℃。tm的温度变化可根据所使用的dna聚合酶的种类、引物的长度、引物内碱基的种类、反应条件等稍微变化。当以如上所述的tm变化程度为基础来设计在互补碱基序列内包含错配碱基部位的引物时，可确立赋予温度同等性的引物制备条件，引入适当个数的错配碱基，从而可增加聚合酶链式反应的特异性。

利用下述实施例结果，从而在设计与引物位置有关的引物时，可确立赋予温度同等性的引物制备条件，将连接肽和错配碱基导入互补碱基序列的适当的位置，从而能够制备使可发生的tm值的显著差最小化的碱基序列，可增加因聚合酶链式反应而引起的特异性。并且，所使用的dna聚合酶的核酸外切酶(exonulease)(5'→3、3'→5')与是否具有功能无关地可维持聚合酶链式反应的特异度及敏感度。

发明的效果

综上所述，包含直接与引物的5'位置相连接或者借助肌苷连接肽相连接的互补碱基序列或错配碱基序列，在以dna、rna为模板的核酸扩增反应中，增加扩增产物来有效地改善敏感度，可减少所发生的非特异反应。这种效果与dna聚合酶种类无关地都起作用。

附图说明

图1依次示出利用本发明的引物(cp)来扩增双链dna的方法。

图2依次示出利用本发明的引物(cp)来扩增单链rna的方法。

图3为示出为了核酸扩增而对所需的两个引物中的一个引物利用本发明的引物(cp)的方法，示出基于在位于本发明的引物(cp)的目标部位5'-末端的气泡部位1所包含的脱氧肌苷个数结果。

图4和图5为在位于本发明的引物(cp)的互补部位的气泡部位2中基于错配核苷酸的个数(0、3、7、12)的结果。图4及图5为示出为了核酸扩增而对所需的两个引物中的一个引物利用本发明的引物(cp)的方法的结果。

图6为示出为了核酸扩增而对所需的两个引物中的一个引物利用本发明的引物(cp)的方法，示出通过包含本发明的引物(cp)的气泡部位1和气泡部位2来利用总气泡个数分别为2个、3个、4个的本发明的引物(cp)的结果。

图7至10为示出为了核酸扩增而对所需的两个引物中的一个引物利用本发明的引物(cp)的方法，图7为使用taqdna聚合酶的结果、图8为使用热启动taqdna聚合酶的结果、图9为使用pfudna聚合酶的结果、图10为使用ventdna聚合酶的结果。

图11为在人类基因组dna(humangdna)中，为了对β-肌动蛋白(beta-actin)基因进行核算扩增而对所需的两个引物分别利用作为本发明的引物(cp)的分别正向引物及反向引物进行反应和将两个引物均用作本发明的引物(cp)来利用的扩增反应的结果。图12为在大鼠基因组dna(ratgdna)中，为了对磷酸甘油醛脱氢酶(gapd)基因进行核酸扩增而对所需的两个引物利用本发明的引物(cp)来进行扩增反应的结果。

图13至图15示出在位于本发明的引物(cp)的互补部位的气泡部位2中根据错配的核苷酸的个数并基于cdna合成温度的逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)结果。

具体实施方式

以下，通过实施例来进一步详细说明本发明。但是，下述实施例仅是用于例示本发明，本发明的内容并非限定于下述实施例。

实施例1：基于本发明的引物(cp)的气泡部位1的连接肽的效果分析

用于扩增人类免疫缺陷病毒反式转录激活因子(hivtat)的模板dna通过将人类免疫缺陷病毒(hiv)-1isolate10br_pe064(gi：672918720，5281-5700bp)在质粒dna(plasmiddna)基因合成来制备了人类免疫缺陷病毒反式转录激活因子质粒dna(hivtatplasmiddna)。

本发明的引物(cp)将与现有方法(nucleicacidsresearch，36：20，2008)的人类免疫缺陷病毒反式转录激活因子基因有关的正向引物及反向引物设计为靶向部位，为此，将互补序列位于5'-末端，在互补序列中包含了7～8个错配序列。如图1所示，在靶向部位与互补序列之间的气泡部位1中，将肌苷连接肽与序列3～10相同地进行了设计。序列3为在气泡部位1中不包含连接肽的引物，序列4～10以包含1(ix1a、ix1b、ix1c)个、3(ix3)个、5(ix5)个、7(ix7)个、9(ix9)个肌苷连接肽的方式进行了设计。

所制备的上述引物使用序列1作为正向引物、将使用序列2作为反向引物的混合物用作对照组，试验组中使用与序列3～10有关的本发明的引物(cp)作为正向引物，使用序列2作为反向引物的混合物。

作为使用上述引物并与核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含3.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps(neb)、1.75u的taqdna聚合酶、10ng的人类基因组dna(humangenomicdna)、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入45ul的上述反应混合物和5ul的浓度为69fg/ul、6.9fg/ul、0.69fg/ul的上述模板dna，在94℃的温度下进行10分钟的最初的变形步骤(initialdenaturationstep)，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤(denaturationstep)、在55℃的温度下进行30秒的退火步骤(annealingstep)、在72℃的温度下进行2分钟的延长步骤(extensionstep)，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤(finalextensionstep)来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料(gelgreendye)的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

其结果，如图3所示，在以345fg的模板浓度反应的多个第三条线中，与现有的引物(对照组(con)的第三条线)相比，示出本发明的引物(cp)(ix9、ix7、ix5、ix3、ix1a、ix1b、ix1c、ix0的第三条线)的扩增产物增加。在模板浓度为34fg的多个第二条线中，与现有的引物(对照组的第二条线)相比，示出本发明的引物(cp)(ix7、ix5、ix3、ix1a、ix1b、ix1c、ix0的第二条线)的扩增产物增加。

在与上述反应有关的结果中，可确认本发明的引物(cp)中的ix1、ix3、ix5、ix7与ix0相比，扩增产物增加。由此，确认了核酸扩增反应的扩增产物随着本发明的引物(cp)的气泡部位1包含肌苷而增加。

实施例2：基于本发明的引物(cp)的气泡部位2的错配个数的效果分析

使用人类免疫缺陷病毒反式转录激活因子质粒dna作为模板，本发明的引物(cp)在气泡部位1包含一个肌苷后，在气泡部位2包含0个、3个、8个、12个错配序列来制备了序列11、12、4、13。

所制备的上述引物使用序列1作为正向引物、将使用序列2作为反向引物的混合物用作对照组，试验组中使用与序列11、12、4、13有关的本发明的引物(cp)作为正向引物、使用序列2作为反向引物的混合物。

作为使用上述引物并与核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含3.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.75u的taqdna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入45ul的上述反应混合物和5ul的浓度为69fg/ul、6.9fg/ul、0.69fg/ul的上述模板dna，在94℃的温度下进行10分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在55℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行2分钟的延长步骤，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

图4的m0为将不包含错配的序列的序列11用作正向引物的结果，未产生扩增产物。m3为包含3个错配序列的序列12，现有的引物(序列1)在使345fg的模板dna反应的多个第三条线中，与对照组的第三条线相比，m3的第三条线的扩增产物增加。但是，在使34.5fg反应的多个第二条线中的m3的第二条线中，未确认到扩增产物。

图5的m8为包含8个错配序列的序列4，m12为包含12个错配序列的序列13，与现有的引物(序列1)相比，在使3.45fg的模板dna反应的多个第一条线中，确认了扩增产物，尤其确认了在m8中扩增产物增加最多。

由上述结果确认，对基于本发明的引物(cp)的气泡部位2的错配个数的扩增产物的增加及敏感度上升的影响。

实施例3：基于本发明的引物(cp)的气泡个数的效果分析

本发明的引物(cp)在气泡部位1包含肌苷、在气泡部位2包含错配序列。气泡部位1产生一个气泡，气泡部位2产生一个至三个气泡。

序列13在气泡部位1产生一个、在气泡部位2产生一个，共产生两个气泡，序列14在气泡部位1产生一个、在气泡部位2产生两个气泡。序列15在气泡部位1产生一个、在气泡部位2产生三个气泡。

通过使用上述本发明的引物(cp)作为正向引物并使用序列2作为反向引物，来制备了作为与核酸扩增反应有关的混合物的包含3.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.75u的taqdna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入45ul的上述反应混合物和5ul的浓度为69fg/ul、6.9fg/ul、0.69fg/ul的上述模板dna，在94℃的温度下进行10分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在45℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行2分钟的延长步骤，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

图6为利用多个a线的气泡个数为2个、多个b线的气泡个数为3个、多个c线的气泡个数为4个的本发明的引物(cp)的结果，由气泡个数2～4个确认以多个第二条线的模板dna进行扩增反应至34.5fg，在使用345fg的多个第三条线中，确认了扩增产物与对照组的第三条线相比增加。

实施例4：dna聚合酶的各种类对本发明的引物(cp)的扩增反应分析

为了确认基于核酸扩增反应中所使用的dna聚合酶的本发明的引物(cp)的扩增反应，将序列4的本发明的引物(cp)用作正向引物、将反向引物用作序列2来进行了基于taqdna聚合酶、热启动taqdna聚合酶、ventdna聚合酶、pfudna聚合酶的扩增反应。

在图7的核酸扩增反应中，作为与上述taqdna聚合酶的核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含3.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.75u的taqdna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

在图8的核酸扩增反应中，作为与上述热启动taqdna聚合酶的核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含3.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.75u的热启动taqdna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

在图9核酸扩增反应中，作为与上述pfudna聚合酶的核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含2.0mm的硫酸镁、0.2mm的dntps、1.75u的pfudna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

在图10的核酸扩增反应中，作为与上述ventdna聚合酶的核酸扩增反应有关的混合物，制备了包含1×缓冲液(20mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、10mm的硫酸铵、10mm的氯化钾、2mm的硫酸镁、0.01％的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)、ph为8.8)、0.2mm的dntps、1.75u的ventdna聚合酶、10ng的人类基因组dna、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入45ul的上述反应混合物和5ul的浓度为69fg/ul、6.9fg/ul、0.69fg/ul的上述模板dna，在94℃的温度下进行10分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在45℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行2分钟的延长步骤，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

基于上述taqdna聚合酶的结果为图7，在使用3.45fg的模板dna的对照组的第一条线中未确认到扩增产物，但是在本发明的引物(cp)的第一条线中确认了扩增产物。

基于上述热启动taqdna聚合酶的结果为图8，与使用34.5fg的模板dna的对照组的第二条线相比，确认了在本发明的引物(cp)的第二条线中扩增产物增加。

基于上述pfudna聚合酶的结果为图9，虽然在使用34.5fg的模板dna的对照组的第二条线中未确认到扩增产物，但可在本发明的引物(cp)的第二条线中确认扩增产物。在使用3.45fg的模板dna的对照组的第一条线的情况下，虽然检测出100bp以上的扩增产物，但在本发明的引物(cp)的第一条线中不能确认100bp以上的扩增产物。

基于上述ventdna聚合酶的结果为图10，虽然在使用34.5fg的模板dna的对照组的第三条线和本发明的引物(cp)的第三条线的扩增产物呈现类似的带厚度，但对照组的第一条线、第二条线、第三条线均产生牵引现象，在本发明的引物(cp)的第一条线、第二条线、第三条线的情况下，可确认无牵引现象。

实施例5：基于在分别使用或使用一对的本发明的引物(cp)正向引物及反向引物的情况下的扩增反应分析

图11为了扩增人类基因组dna的β-肌动蛋白基因，作为现有方法(nucleicacidsresearch，36：20，2008)的引物的对照组线将序列16用作正向引物、将序列17用作反向引物来执行了核酸扩增反应。

本发明的引物(cp)在气泡部位1包含一个肌苷、在气泡部位2包含4个错配的序列来制备了与序列16和序列17有关的作为序列18和序列19的本发明的引物(cp)。

利用本发明的上述引物(cp)，在图11的a_f线中，将序列18的本发明的引物(cp)用作正向引物、将现有的序列17的引物用作反向引物来执行核酸扩增反应，a_r线使用序列16的现有的引物，反向引物使用序列19的本发明的引物(cp)。a_f&r线使用序列18和序列19的本发明的引物(cp)作为正向引物和反向引物。

作为与上述引物对有关的核酸扩增反应的混合物，制备了包含2.5mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.25u的taqdna聚合酶、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入上述反应混合物和100ng、10ng、1ng的人类基因组dna(普洛麦格(promega)，g3041)，将总共为50ul的反应物在94℃的温度下进行2分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在60℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行45秒的延长步骤，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

在基于上述核酸扩增反应的结果中，在使用本发明的引物(cp)的a_f、a_r、a_f&r线中表示单带的扩增产物，在使用现有的引物的对照组线中确认了3个以上与带有关的带有关的扩增产物。与β-肌动蛋白基因有关的扩增产物为相当于653bp的单扩增产物，在图11的基于本发明的引物(cp)的结果中可确认，与现有的引物相比特异度高，确认了在正向引物和反向引物中仅使用一个本发明的引物(cp)，特异度也上升。在扩增产物的增加效果中，确认了从两个引物中仅使用一个，本发明的引物(cp)扩增产物增加，使用一对，扩增产物也增加。

图12为了扩增大鼠基因组dna的磷酸甘油醛脱氢酶基因，将作为现有的引物(nucleicacidsresearch，36：20，2008)的序列20用作正向引物、将序列21用作反向引物，本发明的引物(cp)在气泡部位2中使用错配序列为6个的序列22和错配序列为10个的序列24作为正向引物，使用错配序列为8个的序列23和错配序列为10个的序列25作为反向引物。

作为与上述引物对有关的核酸扩增反应的混合物，制备了包含2.0mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1u的taqdna聚合酶、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入上述反应混合物和1000pg,100pg,10pg,1pg的大鼠基因组dna(clontech，cat.no.636404)，将总共为25ul的反应物在94℃的温度下进行5分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在55℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行30秒的延长步骤，反复35次，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

图12的第一条线为使用1pg的大鼠基因组dna的核酸扩增反应的扩增产物，与对照组第一条线相比，在与使用本发明的引物(cp)的气泡部位2的6个和8个错配序列的序列22和序列23有关的m6&m8的第一条线和使用本发明的引物(cp)的气泡部位2的10个和10个的序列24和序列25有关的m10&m10的多个第一条线中，确认了扩增产物增加。

由上述11和12的结果，在与核酸扩增反应有关的引物对中仅使用一个或两个作为本发明的引物(cp)的结果中，可确认特异度及扩增产物的增加。在本发明的引物(cp)的错配序列个数不同的两对本发明的引物(cp)组合中也确认了扩增产物的增加。

实施例6：利用本发明的引物(cp)的逆转录聚合酶链式反应的扩增有效性验证

在人的总rna(stratagene，cat.no.750500)中，为了扩增β-肌动蛋白基因，利用现有引物(nucleicacidsresearch，36：20，2008)和本发明的引物(cp)来进行了逆转录聚合酶链式反应。如图2所示，作为逆转录聚合酶链式反应的第一步骤，为了使rna合成为cdna，利用相当于现有引物对的反向引物的序列17，本发明的引物(cp)分别利用在气泡部位2包含4个错配序列的序列19和6个错配序列的序列27，并且利用错配序列为8个的序列29来利用于合成cdna。

为了合成cdna，制备了包含1×缓冲液(50mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、ph为8.3、3mm的氯化镁、10mm的二硫苏糖醇(dtt)、75mm的氯化钾)、2mm的dntps、1um的引物、200u的逆转录酶(m-mlvrtase)、分别含有40ng、4ng、0.4ng的人的总rna的混合物。

为了上述混合物的cdna合成反应，分别在45℃、55℃、65℃的温度下反应60分钟后，在94℃的温度下对逆转录酶进行5分钟的惰性化。

以上述cdna反应液为模板，由序列17合成的反应液将序列16和序列17作为引物对、由序列19合成的反应液将序列18和序列19作为引物对、由序列27合成的反应液将序列26和序列27作为引物对、由序列29合成的反应液将序列28和序列29作为引物对来进行了核酸扩增反应。

作为与上述引物对有关的核酸扩增反应的混合物，制备了包含2.5mm的氯化镁、0.2mm的dntps、1.25u的taqdna聚合酶、0.5um的引物对的反应混合物。

分别加入上述反应混合物和5ul的与人的总rna有关的各引物的cdna反应液(2ng、0.2ng、0.02ng)，将总共为50ul的反应物在94℃的温度下2分钟的最初的变形步骤，并且在94℃的温度下进行30秒的变形步骤、在60℃的温度下进行30秒的退火步骤、在72℃的温度下进行45秒的延长步骤，进行40次循环，通过在72℃的温度下进行7分钟的最终延长步骤来完成了核酸扩增反应，在2％的包含凝胶绿色染料的琼脂玫瑰凝胶中对5ul的扩增产物进行了电泳分析。

图13为以65℃的温度进行上述cdna合成反应的结果，以现有引物的对照组线相比，确认了在本发明的引物(cp)的气泡部位2中，分别包含4个、6个、8个的错配序列的a、b、c线的扩增产物增加。图14为以55℃的温度进行上述cdna合成反应的结果，与引物相比，确认了在本发明的引物(cp)中扩增产物增加，错配序列为8个的c的第一条线与对照组和a、b的第一条线相比，扩增产物增加。图15为以45℃的温度进行上述cdna合成反应的结果，与现有引物相比，在本发明的引物(cp)中扩增产物增加，错配序列为6个、8个的c的第一条线与对照组和a的第一条线相比，扩增产物增加。

由上述结果，确认了利用本发明的引物(cp)来在合成cdna时，与现有引物对相比，根据温度范围，反应性增加。因此，使用本发明的引物(cp)，在单链的rna中，通过逆转录聚合酶链式反应确认了与特定基因的扩增反应有关的有用性。

sequencelisting

<110>艾思蒂生物传感器有限公司

<120>与互补碱基序列或包含错配碱基的互补碱基序列相连接的聚合酶链式反应引物及利用其的核酸扩增方法

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