优先权
本申请要求于2014年11月5日提交，标题为““reducingdnadamageduringsamplepreparationandsequencingusingsiderophorechelators”的美国临时专利申请序列号62/075,708的优先权权益，其通过引用以其整体并入本文用于所有目的。
发明领域
本文提供的实施方案涉及用于下一代测序的方法和组合物。一些实施方案涉及包含铁载体和电解质的用于测序相关样品制备的试剂。
发明背景
螯合剂用于生物化学中以除去或失活可导致反应中有害的和不期望的影响的二价阳离子。由于产生促进有害自由基化学的fe2+(edta)复合物，目前在测序相关样品制备应用中使用的作为螯合剂的edta可导致dna的严重和不可逆氧化，特别是在污染铁的存在下(lloydandphillips,mutationres.(1999)424:23-36；wangetal.,nuc.acidres.(2008)36:e85)。这导致dna样本中的局部点突变从而导致深度测序分析期间错误的多态性调用(calls)。这种表型在必须敏感检测低频多态性的癌症相关的深度测序应用中尤其成问题，并具有重要的生物学意义。
发明概述
本文公开的实施方案提供了包含铁载体的用于核酸制备的试剂。在一些实施方案中，铁载体是细菌铁载体。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐。在一些实施方案中试剂可以包含dna聚合酶。在一些实施方案中，试剂可以包含dntp。在一些实施方案中，试剂不含有edta。
本文公开的实施方案提供了制备核酸文库的方法，其包括：从样品提供多个核酸分子；并且在包含铁载体的用于核酸制备的试剂中操作所述多个核酸分子。在一些实施方案中，操作所述多个核酸分子包括将多个核酸分子与多个寡核苷酸探针杂交。在一些实施方案中，将所述多个核酸分子和/或多个寡核苷酸探针固定化在支持物上。在一些实施方案中，通过与所述支持物的结合配偶对将所述多个核酸分子和/或多个寡核苷酸探针固定化在支持物上。在一些实施方案中，所述支持物是磁珠。在一些实施方案中，操作所述多个核酸分子包括除去未特异性结合至所述多个核酸分子的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述方法包括修饰特异性结合至所述多个核酸分子的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述方法包括将所述多个核酸分子片段化。在一些实施方案中，所述方法包括将衔接头添加到所述多个核酸分子。在一些实施方案中，所述通过扩增，将所述衔接头添加到所述多个核酸分子。
本文公开的实施方案提供了用于减少对核酸分子的氧化损伤的方法，所述方法包括在不存在edta的情况下制备所述核酸分子。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括在铁载体存在的情况下制备所述核酸分子。在一些实施方案中，铁载体是细菌铁载体。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括将所述核酸分子暴露于fe(iii)。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包含将所述核酸分子暴露于磁珠。在一些实施方案中，所述氧化损伤包含所述核酸分子中的点突变。在一些实施方案中，所述点突变是c至a颠换。
本文公开的实施方案提供了用于增加测序反应的q(phred)得分的方法，所述方法包括在不存在edta的情况下制备核酸分子。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括在铁载体存在的情况下制备核酸分子。在一些实施方案中，铁载体是细菌铁载体。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐。在一些实施方案中，所述q得分大于约34。在一些实施方案中，所述q得分大于约38。在一些实施方案中，所述q得分大于约42。在一些实施方案中，测序反应是深度测序应用。在一些实施方案中，所述深度测序应用是癌症相关深度测序应用。在一些实施方案中，所述方法包括在不存在edta的情况下对所述核酸分子测序。
本公开的实施方案提供了包含至少一个容器装置(means)的试剂盒，其中所述至少一个容器装置包含含有铁载体的用于核酸制备的试剂。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐。在一些实施方案中，所述试剂不含有edta。
附图简述
图1显示了来自使用含有和不含有edta，dfo-b，egta或dtpa的缓冲液的测序实验的q得分的比较研究的示例性实施方案的结果。
发明详述
定义
本文中引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过对参考材料的引用完整并入。如果本文中使用的术语或短语的方式与本文通过引用作为参考的专利、申请，公开的申请和其他出版物中所阐述的定义相反或者在其它方面不一致，则本文中的使用优于通过引用并入本文的定义。
如本文所用，除非另有明确说明或上下文另有说明，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数提及物。例如除非明确或根据上下文另有指示，二聚体包括一个或多个二聚体。
术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用以指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，其类似物，或其混合物。该术语仅指该分子的一级结构。因此，该术语包括三链，双链和单链脱氧核糖核酸(“dna”)，以及三链，双链和单链核糖核酸(“rna”)。其还包括多核苷酸的修饰(例如通过烷基化，和/或通过加帽)，和未修饰形式。更具体地说，“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)、包括trna,rrna,hrna,和mrna的多核糖核苷酸(包含d-核糖)，剪接或未剪接的、嘌呤或嘧啶碱基的n-或c-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有正常核苷酸主链(normucleotidicbackbones)的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(“pna”))和多吗啉代(polymorpholino)(可从anti-virals,inc.,corvallis,or.以
“核酸探针”和“探针”可互换使用并指包含如上定义的多核苷酸的结构，该多核苷酸含有可以与相应靶标杂交的核酸序列。探针的多核苷酸区域可以由dna和/或rna，和/或合成的核苷酸类似物组成。
通常，杂合物的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后变化但更高严格性的清洗。中等严格杂交是指允许核酸分子(例如探针)结合互补核酸分子的条件。杂交的核酸分子通常具有至少60％的互补性，包括例如70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或100％互补性中的至少任一种。中等严格条件是相当于在50％甲酰胺，5xdenhardt's溶液，5xsspe，0.2％sds中42℃杂交，然后在42℃下在0.2xsspe，0.2％sds中清洗的条件。可以提供高严格条件，例如通过在42℃下在50％甲酰胺，5xdenhardt's溶液，5xsspe，0.2％sds中杂交，然后在65℃下在0.1xsspe和0.1％sds中清洗。
低严格度杂交是指等温于10％甲酰胺，5xdenhardt's溶液，6xsspe，0.2％sds在22℃杂交，然后在1×sspe，0.2％sds中37℃清洗的条件。denhardt溶液含有1％ficoll，1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(bsa)。20xsspe(氯化钠，磷酸钠，乙二胺四乙酸(edta))含有3m氯化钠，0.2m磷酸钠和0.025m(edta)。其他合适的中等严格性和高严格性杂交缓冲液和条件是本领域技术人员公知的。
如本文所用，“生物样品”是指从生物或病毒来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括可从其获得核酸或蛋白质或其他大分子的受试者的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物源或被处理的样品中获得的样品。例如，被扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于，体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液，来自动物和植物的组织和器官样品以及由其衍生的加工样品。还包括的是土壤和水样品和其他环境样品，病毒，细菌，真菌，藻类，原生动物及其组分。
如本文所用，术语“特异性结合”指特异性结合对的结合特异性。在其他潜在靶标存在下，特定靶标的抗体的识别是此类结合的一个特征。特异性结合涉及两个不同的分子，其中一个分子通过化学或物理手段与第二分子特异性结合。两个分子的意义在于它们彼此的结合使得它们能够将其结合配偶体与具有相似特征的其它测定组分区分开。结合成分对的成员称为配体和受体(抗配体)，特异性结合对(sbp)成员和sbp配偶体等。分子也可以是用于分子聚集的sbp成员；例如针对第二抗体及其相应抗原的免疫复合物所产生的抗体可被认为是免疫复合物的sbp成员。
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施例包括“组成”和/或“基本上由......组成”方面和实施方案。
从下面结合附图的说明书中，本发明的其它目的，优点和特征将变得显而易见。
用于核酸制备的试剂
本文公开的一些实施方案提供了包含铁载体或其类似物的用于核酸制备的试剂。
铁载体是由细菌，真菌和禾本科植物生产的化合物，已知其对fe(iii)具有高亲和力和选择性。关于铁载体的化学与生物学的综述，参见例如hider&kong,nat.prod.rep.(2010)27:637-57，其内容以其整体通过引用并入本文。铁载体是对fe(iii)具有高亲和力和选择性的低分子量化合物(500-1500道尔顿)。铁载体的生物合成通常受生物所在环境的铁水平所调节。有超过500种不同的铁载体，其中有270种已经在结构上表征。
本公开考虑的是天然产生或合成的铁载体或其类似物。
如本文所概述，各种铁载体或其类似物可适用于本文公开的用于核酸制备的试剂。在一些实施方案中，所述铁载体可以是细菌铁载体，真菌铁载体，植物铁载体或它们的组合。在本公开中考虑了具有各种官能团的铁载体，如儿茶酚、α-羟基羧酸，羟基苯基恶唑酮，异羟肟酸(hydroxamate)，α-羟基咪唑等，或它们的组合。例如，在一些实施方案中，铁载体可以是异羟肟酸铁载体，如去铁胺b(去铁胺(deferoxamine))、去铁胺e、镰孢氨酸c(fusarininec)、ornibactin、红酵母酸(rhodotorulicacid)等，儿茶酚铁载体，如肠菌素、bacillibactin、vibriobactin等，或混合的配体，如固氮菌素(azotobactin)、荧光嗜铁素(pyoverdine)、耶尔森杆菌素(yersiniabactin)等，或它们的类似物或组合。可用于试剂的其他铁载体包括但不限于分支杆菌生长素(mycobactin)，铁色素(ferrichrome)，粪生素(coprogen)，arthrobactin，铁色素a，2,3-二羟基苯甲酰丝氨酸，阿凡酸(avenicacid)，根际铁结合蛋白(rhizoferrin)，mecam，amonabactint，根际铁结合蛋白(rhizoferrin)等，或它们的类似物或组合。在一些实施方案中，铁载体可以是去铁胺b或其类似物。在一些实施方案中，铁载体可以是去铁胺b甲磺酸盐。
对fe(iii)具有高亲和力的铁载体对于本文公开的方法和组合是理想的。hider和kong(同上)的表2中列出了一些铁载体的fe(iii)亲和常数。因此，在一些实施方案中，铁载体可以具有logkf(feiii)，其是约或高于25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50，或具有任何这些值之间的范围的logkf(feiii)，例如25至50,30至40,40至50等。
在一些实施方案中，用于核酸制备的试剂可以具有低于2mm,1mm,0.5mm,0.2mm,0.1mm,0.05mm,0.02mm,0.01mm的edta浓度，或者具有任何这些值之间的范围的edta浓度，例如0.01mm至0.05mm,0.02mm至0.05mm等。在一些实施方案中，用于核酸制备的试剂可以具有约为0的edta浓度。
其他螯合剂(诸如铁载体或其类似物，egta，dtpa等)可以以多种浓度存在于用于核酸制备的试剂中。例如，在一些实施方案中，用于核酸制备的试剂可以具有铁载体或其类似物的浓度，即为、为约或高于0.01mm,0.02mm,0.05mm,0.1mm,0.2mm,0.5mm,1mm，或者任何这些数值间的范围的铁载体或其类似物的浓度，例如0.01mm至0.05mm,0.02mm至0.5mm等。在一些实施方案中，用于核酸制备的试剂可以具有egta的浓度，即为，为约或高于0.01mm,0.02mm,0.05mm,0.1mm,0.2mm,0.5mm,1mm，或者任何这些数值间的范围的egta的浓度，例如0.01mm至0.05mm,0.02mm至0.5mm等。在一些实施方案中，用于核酸制备的试剂可以具有dtpa的浓度，即为、为约或高于0.01mm,0.02mm,0.05mm,0.1mm,0.2mm,0.5mm,1mm，或者任何这些数值间的范围的dtpa的浓度，例如0.01mm至0.05mm,0.02mm至0.5mm等。
铁载体的另一个理想特征是在fe2+的存在下减少活性氧(reactiveoxygenspecies)和/或自由基的产生的能力。
本文公开的方法和组合物可用于多种核酸应用中，例如，杂交、扩增、连接、延伸、清洗、测序等。常用试剂描述于
常用试剂和/或成分包括以下一种或多种：重悬缓冲液(rsb),
本文公开的铁载体或其类似物可以与各种盐或酶一起使用。例如，本文公开的铁载体或其类似物应与大多数(如果不是全部)测序和/或文库制备试剂以及任何不需要铁发挥功能的酶相容。
在一些实施方案中，本文公开的试剂可以包含dna聚合酶。在一些实施方案中，本文公开的试剂可以包含dntp。其他试剂包括在核酸应用，例如样品制备和/或测序中常见的试剂。
用于制备核酸文库的方法
一些实施方案提供了使用本文公开的试剂制备核酸文库的方法，其包括：从样品提供多个核酸分子；并且在试剂中操作多个核酸分子。
在一些实施方案中，操作多个核酸分子包括将多个核酸分子与多个寡核苷酸探针杂交。在一些实施方案中，操作多个核酸分子包括除去未特异性结合至所述多个核酸分子的寡核苷酸探针。
在本文提供的一些实施方案中，核酸群体是选择性剪切的，从核酸群体除去单链种类和突出端，并修复核酸。在一些实施方案中，可以在文库制备前通过进行以下的两个或多个来处理核酸群体：选择性剪切，单链种类去除，核酸突出端去除和核酸修复。一些此类实施方案可以为进一步核酸文库制备提供底物。制备核酸文库的方法是本领域熟知的。实例包括将衔接头连接到核酸群中的核酸。在一些实施方案中，核酸片段可以是钝末端的，磷酸化的，偶联到a尾的，和/或与衔接头偶联以产生核酸文库。在一些实施方案中，可以进一步扩增核酸文库。文库制备方案的实例包括但不限于，用于以下试剂盒的方法nexteratmdna样品制备试剂盒(
在一些实施方案中，将多个核酸分子和/或多个寡核苷酸探针固定化在支持物上。可以以多种方式将多个核酸分子或寡核苷酸探针固定化在支持物上。在一些实施方案中，使用了纯化标签。本文的“纯化标签”是指可用于纯化核酸分子的部分，其通常通过连接到如本文所概述的固体支持物。合适的纯化标签包括结合配偶对的成员。例如，标签可以是将结合其结合配偶体的半抗原或抗原。例如，合适的结合配偶对包括但不限于：抗原(如蛋白质(包括肽))和抗体(包括其片段(fab等))；蛋白质和小分子，包括生物素/链霉亲合素；酶和底物或抑制剂；其他蛋白质-蛋白质相互作用对；受体-配体；和碳水化合物及其结合配偶体。核酸-核酸结合蛋白对也是有用的。
在一些实施方案中，通过与支持物的结合配偶对将多个核酸分子和/或多个寡核苷酸探针固定化在支持物上。在一些实施方案中，所述支持物是磁珠。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括修饰与多个核酸分子特异结合的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，本文公开的方法包括将所述多个核酸分子片段化。在一些实施方案中，将衔接头添加到所述多个核酸分子。在一些实施方案中，通过扩增，将所述衔接头添加到所述多个核酸分子。
减少对dna分子氧化损伤的方法
本发明公开的一些实施方案提供了用于减少对核酸分子的氧化损伤的方法，所述方法包括在不存在edta的情况下制备所述核酸分子，更优选地在不存在fe2+(edta)的情况下制备所述核酸分子。
使用edta以外的螯合剂或不使用螯合剂，对于本文公开的方法和组合物可能是期望的。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括在egta,dtpa,铁载体，或它们的组合的存在的情况下制备核酸分子。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括在铁载体存在的情况下制备核酸分子。在一些实施方案中，铁载体是细菌铁载体。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐或其类似物。
本文公开的方法和组合物对于在核酸分子制备期间减少活性氧物质(ros)和/或氧自由基是有用的。例如，在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括将所述核酸分子暴露于fe(iii)。在一些实施方案中，制备所述核酸分子包括将所述核酸分子暴露于磁珠。通过在不存在edta，和/或含有egta、dtpa、铁载体，或它们的组合的情况下制备样品，可以减少ros。
ros由细胞中的正常氧代谢产生并被公认为活性分子的列表，如超氧化物；过氧化氢；羟基自由基；羟基离子；一氧化氮等。已知ros在核酸分子中引起氧化损伤。在迄今发现的所有病变中，dna和rna中最丰富的是8-氧基鸟嘌呤。参见kasaietal.,nucleicacidsres.(1984)12:2127-2136；kasai&nishimura,environhealthperspect.(1986)67:111–116；kanvahetal.,acc.chem.res.(2010)43(2):280-287，每个文献的内容在此通过引用以其整体并入本文。因此，在一些实施方案中，氧化损伤包括核酸分子中的点突变。如本文所用，术语“点突变”指一个核苷酸或多个的取代，缺失，或插入。在一些实施方案中，所述点突变是c至a颠换。通过减少ros，可以减少对核酸分子的氧化损伤。
本文提供的一些方法和组合物包括从获得自样品的核酸制备文库。如本文所用，“样品”包括含有核酸的各种来源和组合物。样品可以是生物样品，但该术语还包括其他，例如包含核酸分子的人工样品，所述核酸分子如包含已纯化核酸(其可进一步浓缩和/或进一步纯化)的pcr产品或组合物。生物样品包括病毒颗粒，细胞，组织，器官和生物体的任何部分。
在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，修复了核酸群体中用于制备核酸文库的核酸。例如，可以填补和修复缺口；可以复制突出端以形成核酸的双链区段。修复核酸的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，核酸修复可以包括切除修饰的或损伤的碱基；除去无碱基位点，添补切口，切口连接的连接，除去3’封闭基团，以及逆转交联如嘧啶二聚体。
增加测序反应q得分的方法
本文公开的一些实施方案提供了用于增加测序反应的q(phred质量)得分的方法，该方法包括在不存在edta的情况下制备核酸分子。q得分最初由程序phred开发，并且被定义为与碱基调用错误概率对数相关的性质p:q＝-10log10p。例如，如果phred对碱基分配质量得分为30分，该碱基被不正确调用的机会是1/1000。
可以使用本文公开的方法和组合物优化测序反应的q得分。例如，测序反应可以具有的q得分为、为约，或大于30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50，或者q得分是任何这些数值之间的范围，例如30至50,30至40,40至50,44至46等。在一些实施方案中，q得分大于约34。在一些实施方案中，q得分大于约38。在一些实施方案中，q得分大于约42。
本文公开的方法和组合物对于深度测序反应是特别有用的。如本文所用“深度测序”指测序反应，期间读段的总数是比正在研究的序列的长度大多倍。深度(覆盖)用于指代表重构建序列中的给定核苷酸的平均读段。深度可以从原始基因组的长度(g)，读段的数目(n)和平均读段长度(l)计算为nxl/g。因此，深度测序意指大于7的测序反应深度。例如，可以覆盖给定核苷酸的深度，其为，为约2，或大于30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50，或者任何这些数值之间的范围的深度，例如30至50,30至40,40至50,44至46等。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于具有>100的测序深度的超深度测序(ajayetal.,genomeres.(2011)21:1498-505)。在一些实施方案中，深度测序应用是癌症相关深度测序应用。在一些实施方案中，如本文所述，所述方法包括在不存在edta和/或在存在egta,dtpa,铁载体或它们的组合的情况下测序核酸分子。
测序方法
本文描述的方法可以与各种核酸测序技术结合使用。特别适用的技术是如下那些技术，其中将核酸附接在阵列中的固定位置，使得它们的相对位置不改变，并且其中阵列被重复成像。在不同颜色通道(例如与用于区分一种核苷酸碱基类型与另一种核苷酸碱基类型的不同标记物相符)中获得图像的实施方案是特别适用的。在一些实施方案中，测定靶核酸核苷酸序列的过程可以是自动化过程。优选的实施方案包括合成测序(sequencing-by-synthesis)(“sbs”)技术。
“合成测序(sbs”)技术”通常涉及通过相对于模板链重复添加核苷酸来酶促延伸新生核酸链。在sbs的传统方法中，可以在每个递送中，在聚合酶存在下，向目标核苷酸提供单个核苷酸单体。然而，在本文所述的方法中，在递送中，在聚合酶存在下，可以将多于一种类型的核苷酸单体提供给目标核酸。
sbs可以利用具有终止剂部分的核苷酸单体或那些缺少任何终止剂部分的核苷酸单体。使用缺乏终止剂的核苷酸单体的方法例如包括，使用γ-磷酸/磷酸盐标记的核苷酸的焦磷酸测序和测序，如下面进一步详细阐述的。在使用缺乏终止剂的核苷酸单体的方法中，每个循环中加入的核苷酸数目通常是可变的，并取决于模板序列和核苷酸递送模式。对于利用具有终止剂部分的核苷酸单体的sbs技术，终止剂可以在使用的测序条件下是有效不可逆转的，传统的利用双脱氧核苷酸的sanger测序就是如此，或者终止剂可以是可逆的，如solexa(现在是illumina,inc.)开发的测序方法就是如此。
sbs技术可以利用具有标记物部分的核苷酸单体或缺乏标记物部分的核苷酸单体。因此，可以基于标记物的特征来检测掺入事件，如标记物的荧光；核苷酸单体的特征如分子量或电荷；核苷酸掺入的副产物，如磷酸(盐)释放等。在实施方案中，其中测序试剂中存在两个或更多个不同的核苷酸，可以彼此区分不同的核苷酸，或者替代地，在使用的检测技术下，两个或更多个不同的标记物可以是不可区分的。例如，测序试剂中存在的不同核苷酸可以具有不同的标记物并且可以使用solexa(现在是illumina,inc.)开发的测序方法示例的适当的光学仪器(optics)来区分它们。
优选实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测在将特定的核苷酸掺入到新生链中时无机焦磷酸盐(ppi)的释放(ronaghi,m.,karamohamed,s.,pettersson,b.,uhlen,m.andnyren,p.(1996)“real-timednasequencingusingdetectionofpyrophosphaterelease.”analyticalbiochemistry242(1),84-9；ronaghi,m.(2001)“pyrosequencingshedslightondnasequencing.”genomeres.11(1),3-11；ronaghi,m.,uhlen,m.andnyren,p.(1998)“asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate.”science281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320,前述公开通过引用以它们的整体并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的ppi可以通过atp硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(atp)来检测，并且通过萤光素酶产生的光子检测产生的atp水平。可以将要测序的核酸附接到阵列中的特征，并且可以成像以捕捉由于在阵列的特征处掺入核苷酸而产生的化学发光信号。在用特定核苷酸类型(例如a,t,c或g)处理阵列后可以获得图像。在添加每种核苷酸类型后获得的图像就检测阵列中的哪些特征而言将有所不同。图像中的这些差异反映了阵列上特征的不同序列内容。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。可以使用本文所述的方法来存储，处理和分析图像。例如，在用每种不同核苷酸类型的阵列处理后获得的图像可以以与本文例举的用于基于可逆终止剂的测序方法的不同检测通道获得的图像相同的方式来处理。
在sbs的另一个示例性类型中，循环测序通过逐步添加可逆终止剂核苷酸来完成，所述可逆终止剂核苷酸例如包括以下所述的可切割或者光致漂白(photobleachable)染料标记物：国际专利公开号wo04/018497和美国专利公开7,057,026，所述公开以其整体通过引用并入本文。这种方法正在被solexa(现在是illumina,inc.)商业化，并且还描述于国际专利公开号wo07/123,744，所述公开以其整体通过引用并入本文。荧光标记的终止剂的可用性(其中既可以逆转终止又可以切割荧光标记物)促进有效的循环可逆终止(crt)测序。也可以共同工程化改造聚合酶以有效地掺入这些修饰的核苷酸并从这些修饰的核苷酸延伸。
优选地，在基于可逆终止剂的测序实施方案中，在sbs反应条件下，标记物基本上不能抑制延伸。然而，检测标记物可以是可移除的，例如通过切割或降解。在将标记物掺入测定的核酸特征之后，可以捕获图像。在具体实施方案中，每个循环涉及将四种不同核苷酸类型同时递送至阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱上不同的标记物。然后可以获得四个图像，每个图像使用对四个不同标记物之一选择性的检测通道。或者，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在此类实施方案中，每个图像将显示已经掺入特定类型的核苷酸的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，不同的图像将存在或不存在不同的特征。然而，图像中的特征的相对位置将保持不变。可以如本文所述对从此类可逆终止剂-sbs方法获得的图像进行储存，处理和分析。在图像捕获步骤之后，可以去除标记物，并且可以除去可逆终止剂部分以用于随后的核苷酸添加和检测循环。标记物在它们在特定循环内和后续循环前检出后除去可以提供降低背景信号和循环之间串扰的优点。有用的标记物和去除方法的实例如下所述。
在具体实施方案中，一些或全部核苷酸单体可以包括可逆终止剂。在此类实施方案中，可逆终止剂/可切割荧光素(fluor)可以包括经由3'酯键连接至核糖部分的荧光素(metzker,genomeres.15:1767-1776(2005),其通过引用以其整体并入本文)。其他方法将终止剂化学与荧光标记物的切割分离(rupareletal.,procnatlacadsciusa102:5932-7(2005),其通过引用以其整体并入本文)。ruparel等人描述了可逆终止剂的开发，所述可逆终止剂使用小的3'烯丙基封闭延伸，但是可以通过用钯催化剂的短暂处理容易地解封。荧光团经由光可切割接头附接在碱基上，所述接头可以通过暴露于长波长uv光30秒而容易地被切割。因此，可以使用二硫化物还原或光切割作为可切割的接头。可逆终止的另一种方法是使用在dntp上放置大体积染料之后发生的自然终止。dntp上带电荷的大体积染料的存在可以通过空间和/或静电阻碍作为有效的终止剂起作用。除非染料被去除，一个掺入事件的存在防止进一步掺入。染料的切割可去除荧光素，并有效地反转终止。修饰的核苷酸的实例也描述在美国专利7,427,673和美国专利7,057,026中，其通过引用以它们的整体并入本文。
可以与本文描述的方法和系统一起使用的附加的示例性sbs系统和方法描述于以下中：美国专利公开号2007/0166705，美国专利公开号2006/0188901,美国专利7,057,026,美国专利公开号2006/0240439,美国专利公开号2006/0281109，国际专利公开号wo05/065814,美国专利公开号2005/0100900,国际专利公开号wo06/064199,国际专利公开号wo07/010,251,美国专利公开号2012/0270305以及美国专利公开号2013/0260372,每个公开的内容通过引用以其整体并入本文。
一些实施方案可以利用使用少于四种不同的标记物来检测四种不同的核苷酸。例如，可以使用描述于美国专利公开号2013/0079232中的方法和系统来执行sbs，该专利以其整体通过引用并入本文。作为第一个实例，可以以相同的波长检测一对核苷酸类型，但是基于对的一个成员与另一成员相比的强度差异，或基于对的一个成员的改变(例如，经由化学修饰，光化学修饰或物理修饰)区分，所述改变导致相较于对该对的另一个成员检测到的信号所出现或消失的明显信号。作为第二个实例，在特定条件下可以检测四种不同核苷酸类型中的三种，而第四核苷酸类型缺少在那些条件下可检测的标记物，或在那些条件下被最小检测(例如，由背景荧光引起的最小检测等)。前三种核苷酸类型掺入至核酸可以基于它们各自存在的信号来测定，并且可以基于任何信号的不存在或最小检测来确定第四核苷酸类型掺入到核酸中。作为第三个实例，一种核苷酸类型可以包括在两个不同通道中检测到的标记物，而在不超过一个通道中检测到其他核苷酸类型。上述三个示例性构造认为不是相互排斥的，并且可以以各种组合使用。组合了所有三个实例的示例性实施方案为基于荧光的sbs法，其使用在第一通道中检测到的第一核苷酸类型(例如，当被第一激发波长激发时在第一通道中检测到的具有标记物的datp)，在第二通道中检测到的第二核苷酸类型(例如，当被第二激发波长激发时在第二通道中检测到的具有标记物的dctp)，在第一和第二通道中检测到的第三核苷酸类型(例如，当被第一和/或第二激发波长激发时在两个通道中检测到的具有至少一个标记物的dttp)以及在任一通道中未被检出或被最小检出的缺少标签的第四核苷酸类型(例如，没有标记物的dgtp)。
此外，如并入美国专利公开号2013/0079232中所描述的，可以使用单个通道获得测序数据。在所谓的单染料测序方法中，第一种核苷酸类型是标记的，但该标记在第一种图像生成后被去除，并且仅在产生第一图像之后标记第二核苷酸类型。第三核苷酸类型在第一和第二图像中保留其标签，并且第四核苷酸类型在两个图像中保持未标记。
一些实施方案可以利用连接测序(sbl)技术。此类技术利用dna连接酶掺入寡核苷酸并鉴定此类寡核苷酸的掺入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中特定核苷酸的身份相关的不同标记物。与其他sbs方法一样，在用标记的测序试剂处理核酸特征阵列之后可以获得图像。每个图像将显示已经掺入特定类型的标记物的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，不同的图像将存在或不存在不同的特征，但是图像中的特征的相对位置将保持不变。从基于连接的测序方法获得的图像可以如本文所述进行存储，处理和分析。可以与本文描述的方法和系统一起使用的示例性sbl系统和方法描述于美国专利6,969,488，美国专利6,172,218和美国专利6,306,597中，所述专利通过引用以其整体并入本文。
一些实施方案可以利用纳米孔测序(deamer,d.w.&akeson,m.“nanoporesandnucleicacids:prospectsforultrarapidsequencing.”trendsbiotechnol.18,147-151(2000)；deamer,d.andd.branton,“characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis”.acc.chem.res.35:817-825(2002)；li,j.,m.gershow,d.stein,e.brandin,andj.a.golovchenko,“dnamoleculesandconfigurationsinasolid-statenanoporemicroscope”nat.mater.2:611-615(2003),上述公开通过引用以其整体并入本文)。在此类实施方案中，目标核酸穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，如α-溶血素。当目标核酸通过纳米孔时，可以通过测量孔隙电导的波动来鉴定每个碱基对(u.s.patent7,001,792；soni,g.v.&meller,“a.progresstowardultrafastdnasequencingusingsolid-statenanopores.”clin.chem.53,1996-2001(2007)；healy,k.“nanopore-basedsingle-moleculednaanalysis.”nanomed.2,459-481(2007)；cockroft,s.l.,chu,j.,amorin,m.&ghadiri,m.r.“asingle-moleculenanoporedevicedetectsdnapolymeraseactivitywithsingle-nucleotideresolution.”j.am.chem.soc.130,818-820(2008),上述公开通过引用以其整体并入本文)。从纳米孔测序获得的数据可以如本文所述进行存储，处理和分析。特别地，可以根据本文所列的光学图像和其他图像的示例性处理将数据作为图像进行处理。
一些实施方案可以利用涉及实时监测dna聚合酶活性的方法。可以通过含荧光团的聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(fret)相互作用来检测核苷酸掺入，其例如描述于美国专利7,329,492和美国专利7,211,414中(上述公开通过引用以其整体并入本文)，或者可以用零模式波导和使用荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶来检测核苷酸掺入。所述零模式波导例如描述于美国专利7,315,019中(该公开通过引用以其整体并入本文)，所述荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶例如描述于美国专利7,405,281和美国专利公开号2008/0108082中(上述公开通过引用以其整体并入本文)。可以将照明(illumination)限制在围绕表面系留聚合酶的zeptoliter-尺度体积，使得可以低背景观察荧光标记核苷酸的掺入(levene,m.j.etal.“zero-modewaveguidesforsingle-moleculeanalysisathighconcentrations.”science299,682-686(2003)；lundquist,p.m.etal.“parallelconfocaldetectionofsinglemoleculesinrealtime.”opt.lett.33,1026-1028(2008)；korlach,j.etal.“selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsinglednapolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures.”proc.natl.acad.sci.usa105,1176-1181(2008),上述公开通过引用以其整体并入本文)。从这些方法获得的图像可以如本文所述进行存储，处理和分析。
一些sbs实施方案包括在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子的检测。例如，基于检测释放的质子的测序可以使用可从iontorrent(guilford,ct,lifetechnologies子公司)购得的电检测器以及相关的技术或者描述于以下专利中的测序方法和系统：美国专利公开号2009/0026082；美国专利公开号2009/0127589；美国专利公开号2010/0137143；或美国专利公开号2010/0282617中，上述公开通过引用以其整体并入本文。本文所列的使用动力学排除用于扩增目标核酸的方法可以容易地应用于检测质子的基底。更具体地，本文所述的方法可用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
上述sbs方法可以有利地以多重格式进行使得多个不同的靶核酸被同时操作。在具体实施方案中，不同的靶核酸可以在常见的反应容器中或在特定的基底的表面上进行处理。这允许以多重方式来方便地递送测序试剂，去除未反应的试剂和检测掺入事件。在使用表面结合靶核酸的实施方案中，靶核酸可以是阵列格式。在阵列格式中，目标核酸通常可以以空间上可区分的方式结合到表面。目标核酸可以通过直接共价附接，附接到珠或其他颗粒或结合至聚合酶或附接于表面的其它分子结合。该阵列可以包括在每个位点(也称为特征)的目标核酸的单拷贝，或者具有相同序列的多个拷贝可以存在于每个位点或特征。可以通过如下文进一步详述的桥式扩增或乳液pcr的扩增方法生产多个拷贝。
本文所列的方法可以使用阵列，所述阵列具有以下密度特征：所述密度为，或约为，小于或大于10特征/cm2、100特征/cm2、500特征/cm2、1,000特征/cm2、5,000特征/cm2、10,000特征/cm2、50,000特征/cm2、100,000特征/cm2、1,000,000特征/cm2、5,000,000特征/cm2、或者所述密度是这些数值间的任何范围，例如，10特征/cm2至5,000,000特征/cm2、100特征/cm2至1,000,000特征/cm2、500特征/cm2至100,000特征/cm2、1,000特征/cm2至50,000特征/cm2、5,000特征/cm2至10,000特征/cm2等。
本文所列方法的优点在于它们以并行的方式为多个目标核酸提供了快速和有效的检测。因此，本公开提供了能够使用本领域已知的技术制备和检测核酸的集成系统，例如上面列举的那些。因此，本公开的集成系统可以包括流动组件，其能够递送扩增试剂和/或测序试剂到一个或多个固定化的dna片段，所述系统包含如泵，阀，储存器，流体管线等组件。流动池可以在用于检测靶核酸的集成系统中配置和/或使用。示例性的流动池例如描述于美国专利公开号2010/0111768a1和美国专利申请号13/273,666中，每篇专利通过引用以其整体并入本文。如流动池所示例，集成系统的一个或多个流体组件可用于扩增方法和检测方法。以核酸测序实施方案为例，集成系统的一个或多个流体组件可以用于本文所述的扩增方法和用于在诸如上述例举的测序方法中递送测序试剂。或者，集成系统可以包括单独的流体系统以执行扩增方法和执行检测方法。能够创建扩增核酸并还能够测定核酸序列的集成测序系统的实例包括但不限于miseqtm平台(illumina,inc.,sandiego,ca)和描述于美国专利申请号13/273,666中的设备，其以其整体通过引用并入本文。
试剂盒
本文公开的实施方案还提供了包括至少一个容器装置，其中所述至少一个容器包含如本文公开的含有egta，dtpa，铁载体或其组合的用于核酸制备的试剂。在一些实施方案中，铁载体是去铁胺b(dfo-b)甲磺酸盐。在一些实施方案中，所述试剂不含有edta。
实施例
提供以下实施例来说明而不是限制本发明。
为了便于理解，提供了具体实施方案以帮助解释技术方案，即，这些实施方案仅仅是为了说明的目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。除非另有说明，实施方案不表示具体条件，其符合常规条件或制造商的推荐条件。
实施例1：使用不同螯合剂制备的样品的q得分的比较。
使用缓冲液sws链霉亲合素清洗缓冲液用于核酸样品制备，进行比较研究，其中缓冲液被修饰以除去edta，并且包括浓度为2.0mm，1.5mm，1.0mm，0.5mm，0.2mm，0.1mm，0.05mm或0.0mm(ews_noedta)的dfo-b，egta或dtpa。包括了含有0.2mmedta的未修饰的缓冲液作为对照(ews_control)。样品制备后，使用hiseq2500测序方案，在标准试剂中对样品进行测序，并计算q得分。单个样品的q得分显示出由于降低的氧化和c至a颠换而产生的碱基调用最大质量的明显和显著增加(图1)。从样品中消除edta导致q得分的显著增加，其中包含dfo-b导致进一步的改善。用egta或dtpa替代edta也导致了改善的q得分。
结果显示了dfo-b甲磺酸盐(细菌铁载体)由于其螯合feiii的能力而克服了在生物化学文库制备过程中对dna的氧化损伤。dfo-b提供的其他优点基于试剂与溶液中某些条件下形成的自由基直接反应的能力。自由基也可以损害dna，从而导致为测序制备的样品的完整性丧失。
上述实施方式的详细描述参考附图，其示出本公开的具体实施方式。具有不同结构和操作的其他实施方案不脱离本公开的范围。术语“本发明”等与参考本说明书中所列的申请人发明的许多替代方面或实施方案的某些具体示例一起使用，并且其使用和缺失都不旨在限制申请人的发明的范围或权利要求的范围。本详细说明仅为了方便读者而分成几部分。标题不应被解释为限制本发明的范围。这些定义旨在作为本发明的实施方案描述的一部分。
尽管已经参考附图结合本发明的实施例对本发明进行了充分的描述，但是应当注意，对于本领域技术人员来说，各种变化和修改将变得显而易见。此类改变和修改被理解为包括在本发明的范围内。另外，虽然以上根据各种示例性实施例和实现方式描述了本发明，但是应当理解，在一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不限于它们对于它们进行描述的特定实施例的适用性。它们可以单独地或以某种组合应用于本发明的一个或多个其他实施方案，无论这些实施方案是否被描述，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施方案的一部分。因此，本发明的广度和范围不应受任何上述示例性实施例的限制。
在本申请中提及的所有出版物，包括专利文献和科学文章，参考书目和附件通过引用的方式并入参考资料，并以其全部内容的全部内容出现在所有目的，如同每个单独的出版物通过引用单独并入。
对上述出版物或文件的引用并不意味着承认任何前述内容是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。