专利名称：一种c端特异的人dna错配修复蛋白mlh1多肽及其抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种C 端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体制备方法，属于生 物医学技术领域。
背景技术：
MLH1 ( MutL protein homolog 1)是一种DNA错配修复蛋白。错配DNA的修复是维持不同时相遗传信息完整性的必须环节。DNA复制过程中 链间错配而滑落会造成一个微小重复的改变，这被称为微卫星不稳定性。目 前已有研究将这种DNA修复功能的缺陷和人类的致癌作用联系在一起。随 着遗传性非息肉直肠癌(HNPCC)遗传基础的阐明，错配修复基因的重要 性越来越来明显。MSHS2参与复制错配修复过程中错配核苷酸的起始识别 过程，研究表明，当MSH2与错配的DNA二聚体结合后，即与MLH1和 PMSH形成的异源二聚体相连，三者一同辅助错配修复的后期步骤。发明内容本发明是为解决通过免疫实验特异性检测人DNA错配修复蛋白 MLH1的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品 的问题，而提供的一种能特异性针对人MLH1的C端的合成多肽、相应 抗体及其制备方法。本发明还可同时解决目前使用的类似抗体价格高， 亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本发明所 述的抗人MLH1合成多肽、相应抗体，按照以下步骤制备抗原表位分析与拮抗位置确定利用多种表位预测软件，如 DNAstar， OMIGA， UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水 性结构、抗原指数、表面可及性等，再结合我们己有实际制备抗体的验 证经验，最终确定第446到第460位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为 SLEGDTTKGTSEMSE多肽的合成革E标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不 能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选 择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制 备出人工免疫原。免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原， 免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性词养后进行 多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次 使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人DNA 错配修复蛋白MLH1分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本 较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后 可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。
图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。 图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。图3是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度 为86.4%。图2表明多肽分子量理论值为1673.8，质谱鉴定实测值M+H+
为術5丄图3中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为 106-107L/mol。
具体实施方式
实施例1:人MLH1抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析软件，对人MLH1氮 基酸序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面 可及性(surfaceprobability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们 已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第446到第460位为靶标，其 氨基酸序列为SLEGDTTKGTSEMSE。在全自动多肽合成仪上由固定羧 基向氨基端递减合成后获得粗品。经30%乙睛溶解后，进行高压液相色 谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽， 质谱鉴定。实施例2:合成多肽与载体的偶联。载体蛋白选择KLH (Keyhole !impethemocyanin)，用双功能试剂 顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶 联取KLH5mg (0.11,1，含赖氨酸2.2|jmol)，溶于0.75mL偶联 缓冲液1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mg MBS (",)溶 于75)JL二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转 混匀，室温下作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8mL)加 入预先用偶联缓冲液2 (0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱， 收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶 联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56，室温下旋转混合，作用2小 时后置4。C过夜，将反应混合物(约0.7mL)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、 MBS-KLH禾口 偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
鉴定偶联效率。
实施例3:抗多肽抗体的制备。
取偶联的KLH-多肽500Mg，溶于500mL磷酸缓冲液，加等体积的 完全福氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)， 经过适应性饲养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半 (250|jg)，加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行 第二次加强免疫，方法同前。再2周后开始耳缘静脉少量采血，用合成 多肽(1|jg/mL)包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加 强免疫，至取血测抗体效价达到1: 16万时停止免疫，采用颈动脉放血 收集抗体。
实施例4:亲和层析纯化抗多肽抗体。
① 人MLH1合成多肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化 Sepharose4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液 洗2次，迅速与溶于5mL偶联缓冲液的合成多肽500ijg混合，室温旋 转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1 小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50mL磷 酸盐缓冲液洗凝胶，按终止浓度0.02。/。加叠氮钠(NaN3)，置4。C保存。
② 亲和层析纯化抗多肽抗体将20mL兔抗多肽血清与16mL多肽 偶联的Sepharose 4B共同加入50mL离心管，4°C旋转混合6小时。将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用15mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每 次加0.8mL pH2.9， 0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别 加入8支预先加入80ijL2mol/LTris-HCL缓冲液(pH7.5) ， 20mL磷
酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作在4。c下完成。毎管取洗脱液2ijL， 稀释50倍后测280nm的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。
实施例5:抗体鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。
用合成肽交联BSA，分别以5 ug/mL和10 ug/mL的浓度，在4 度下包被ELISA检测板过夜，10。/。的山羊血清室温封闭2小时后加入倍 比稀释的己知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗兔IgG 二抗0.1mL， TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标，以曲线 达到水平时的A450值为100%，以其他相对于该浓度的百分数为纵坐标 作图，求出A50即50% A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n —1)/2(n[Ab，] t一2[Ab]t)算出抗体相对亲和常数，其中[Ab， ]t 、 [Ab]t指的是A50 时即包被抗原分别为5 u g/mL和10 u g/mL时抗体半饱和时抗体的摩尔 浓度，[Ag]t、 [Ag' ] t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10 u g和5 yg， n=[Ag]t/[Ag， ] t，本实验中n=2。试验效果
1. 人MLH1合成多肽HPLC纯化后，使用液相色谱鉴定纯度为 86.4.6%。多肽分子量理论值为1673.8，质谱鉴定实测值M+H+
为1675.1。
2. 多肽与载体的偶联效率SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回 收率大致相符，大于80%。
3. 抗体效价多只家兔得到的抗血清效价均在1:10万以上。
4. 抗体亲和力相对亲和常数为106-107L/mol。
5. 抗体的应用以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于蛋 白印迹和各种酶免实验，以及建立相应体外免疫分析试剂。序列表
<110>北京意宏安生物科技有限公司
<120> —种C端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体制备
方法
<160>2
<210> 1 <211> 756 <212> PRT <213>人
<400> 1
MSFVAGVIRRLDETWNRIAAGSLEGDTTKGTSEMSENCLDAKSTSI QVIVKEGGLKLIQIQDNGTGIRKEDLDIVCERFTTSKLQSFEDLASIST丫GF RGEALASISHVAHVTITTKTADGKCA丫RASYSDGKLKAPPKPCAGNQGTQ ITVEDLFYNIATRRKALKNPSEE丫GKILEWGR丫SVHNAGISFSVKKQGET VADVRTLPNASTVDNIRSIFGNAVSRELIEIGCEDKTLAFKMNGYISNANYS VKKCIFLLFINHRLVESTSLRKAIETVYAAYLPKNTHPFLYLSLEISPQNVDV NVHPTKHEVHFLHEESILERVQQHIESKLLGSNSSRM丫FTQTLLPGLAGP SGEMVKSTTSLTSSSTSGSSDKVYAHQMVRTDSREQKLDAFLQPLSKPL SSQPQAIVTEDKTDISSGRARQQDEEMLELPAPAEVAAKNQSLEGDTTK GTSEMSEKRGPTSSNPRKRHREDSDVEMVEDDSRKEMTAACTPRRRIINLTSVLSLQEEINEQGHEVLREMLHNHSFVGCVNPQWALAQHQTKLYLL NTTKLSEELFYQILIYDFANFGVLRLSEPAPLFDLAMLALDSPESGWTEED GPKEGLAEYIVEFLKKKAEMLADYFSLEIDEEGNLIGLPLLIDNYVPPLEGL PIFILRLATEV隨DEEKECFESLSKECAMFYSIRKQYISEESTLSGQQSEV PGSIPNSWKWTVEHIVYKALRSHILPPKHFTEDGNILQLANLPDLYKVFER C
<210>2 <211> 15 <212> PRT <213>人
<400> 2
SLEGDTTKGTSEMSE
权利要求
1.一种C端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为SLEGDTTKGTSEMSE。
2. —种特异的抗人DNA错配修复蛋白MLH1C端合成多肽抗体，其特征在于该抗体效价在 1: 100000以上，特异性强，亲和力高达106—107 L/mol。
3. —种特异的抗人DNA错配修复蛋白MLH1C端合成多肽抗体的制备方法，其特征在于以 人MLH1氨基酸序列中第446到第460位的SLEGDTTKGTSEMSE肽段序列作为抗原肽 合成人MLH1抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白载体偶联，经柱层析纯化后；制备出人工免 疫原，免疫动物，制备多肽抗体，并经亲和层析纯化而成。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于载体蛋白为钥孔嘁血蓝素。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于偶联的KLH—多肽加福氏佐剂免疫后收集抗体。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于抗原肽与载体蛋白偶联作为免疫原，免疫家 兔制备兔抗人MLH1合成多肽抗体。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于合成多肽偶联S印harose4B，制备亲和层析 柱，用于纯化抗多肽抗体。
全文摘要
本发明公开了一种C端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体的制备方法，属于生物医学技术领域。C端特异的人MLH1多肽的氨基酸序列为SLEGDTTKGTSEMSE。抗人MLH1多肽抗体按以下方法制备(1)人MLH1抗原表位的分析；(2)人MLH1 C端多肽的合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗人MLH1多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人MLH1多肽抗体。本发明制备的C端特异的抗人MLH1合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人DNA错配修复蛋白MLH1发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为研究人MLH1的生物学功能及其与相关疾病的关系提供了有用的工具。
文档编号C07K7/00GK101318997SQ20071010017
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者吕玉娥, 杜宏武, 陈光宇 申请人:北京意宏安生物科技有限公司