用于改进多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的基于多肽的穿梭剂，其用途、及与其相关的方法和试剂盒与流程

本发明涉及用于增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的合成肽。更具体地，本发明涉及合成肽和基于多肽的穿梭剂，其包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)或与组氨酸富集结构域和cpd可操作连接的eld。

背景

将大分子运输入真核细胞内的细胞递送技术具有广泛的应用，特别是在生物制药工业中。尽管一些可溶性的化学物质(例如小分子药物)可被动地扩散通过真核细胞膜，但较大负荷(例如生物制剂、多核苷酸和多肽)需要穿梭剂的帮助以达到其细胞内靶标。细胞递送技术的进步将大大受益的一个领域是细胞疗法领域，在过去的二十年中取得了巨大的飞跃。解读掌管细胞扩增、分化和重新编程的不同生长因子和分子线索，为治疗未满足的医疗需求打开了许多治疗可能性的大门。例如，直接从成体细胞诱导多能干细胞、直接细胞转化(反向分化)和基因组编辑(锌指核酸酶、talen^tm和crispr/cas9技术)是已经开发的用于临床应用的最大化细胞治疗价值的方法实例。目前，具有高治疗活性的细胞的生产通常需要离体操作，主要通过病毒转导实现，其引起重要的对人类应用的安全性和经济顾虑。在这些细胞内直接递送活性蛋白例如转录因子或人造核酸酶的能力可以有利地规避与更危险的基因转移方法相关的安全性问题和监管障碍。在这些细胞内直接递送活性蛋白如转录因子或人造核酸酶的能力可以有利地规避与更危险的基因转移方法相关的安全性顾虑和监管障碍。

就这一点而言，基于多肽的转导剂可以用于将纯化的重组蛋白直接导入靶细胞中，例如帮助绕过关于引入外源dna的安全性问题。存在基于脂质或阳离子聚合物的转导剂，但引入关于化学毒性和效率的安全性问题，这阻碍了其在人类治疗中的应用。涉及将重组蛋白质负荷直接融合至细胞穿透肽(例如，hiv反式激活蛋白tat)的蛋白质转导方法需要大量的重组蛋白质，并且往往不能将负荷递送至适当的亚细胞位置，导致巨大的内体捕获和最终的降解。已经开发了几种内体膜破坏肽来尝试和促进内体捕获的负荷逃逸到胞质中。然而，这些内体切割肽中的许多旨在缓解已经在细胞内递送的负荷的内体截留，并且本身不帮助使负荷在细胞内穿梭过质膜的初始步骤(salomone等人,2012；salomone等人,2013；erazo-oliveras等人,2014；fasoli等人,2014)。因此，需要能够增加多肽负荷的转导效率并将负荷递送到靶真核细胞的细胞质中的改进的穿梭剂。

本说明书引用许多文献，其内容通过提述以其整体并入本文。

概述

本说明书源自令人惊讶的发现，即包含与细胞穿透结构域(cpd)和任选的组氨酸富集结构域可操作地连接的内体泄漏结构域(eld)的合成肽具有增加能够用感兴趣的多肽负荷转导的细胞的比例，而合成肽并不与多肽负荷共价结合。在成功转导之后，合成肽可促进内体捕获的多肽负荷获得进入细胞质并任选靶向多种亚细胞区室(例如细胞核)的能力。

因此，本说明书可涉及以下方面：

(1)合成肽，其包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)，或与组氨酸富集结构域和cpd可操作连接的eld。

(2)基于多肽的穿梭剂，其包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)或与组氨酸富集结构域和cpd可操作连接的eld，其用于在增加独立的多肽负荷向靶真核细胞的细胞质的转导效率中使用。

(3)(1)或(2)的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂：(a)包含20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的最小长度和35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个氨基酸残基的最大长度；(b)在生理ph具有至少+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15的预测的净电荷；(c)在水性溶液中是可溶的；或(d)(a)至(c)的任意组合。

(4)(1)至(3)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中：

(a)所述eld为或来自：内体切割肽；抗微生物肽(amp)；线性阳离子α-螺旋抗微生物肽；杀菌肽-a/蜂毒肽杂交(cm系列)肽；ph-依赖性膜活性肽(pamp)；肽两亲物；衍生自流感血凝素(ha)的ha2亚单元n末端的肽；cm18；白喉毒素t结构域(dt)；gala；pea；inf-7；lah4；hgp；h5wyg；ha2；eb1；vsvg；假单胞菌毒素；蜂毒肽；kala；jst-1；c(llkk)3c；g(llkk)3g；或其任意组合；(b)所述cpd为或来自：细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白转导结构域；tat；ptd4；穿透素(控制触角的基因)；pvec；m918；pep-1；pep-2；xentry；精氨酸伸展；运输蛋白；synb1；synb3；或其任意组合；(c)所述组氨酸富集结构域是至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的伸展，其包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的组氨酸残基；和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续的组氨酸残基；或(d)(a)至(c)的任意组合。

(5)(1)至(4)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂包含：(a)含有seqidno:1-15、63或64任一项的氨基酸序列或具有内体切割活性的其变体或片段的eld；(b)含有seqidno:16-27或65任一项的氨基酸序列或具有细胞穿透活性的其变体或片段的cpd；(c)具有至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6个连续的组氨酸残基的组氨酸富集结构域；或(d)(a)至(c)的任意组合。

(6)(1)至(5)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述结构域经由一个或多个接头结构域可操作连接。

(7)(1)至(6)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂包含至少两个不同类型的cpd和/或eld。

(8)(1)至(7)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂包含：(a)eld，其为具有seqidno:1、14或63的氨基酸序列的cm18、kala或c(llkk)3c，或与seqidno:1、14或63具有至少85％、90％或95％同一性且具有内体切割活性的其变体；(b)cpd，其为具有seqidno:17或65的氨基酸序列的tat或ptd4，或与seqidno:17或65具有至少85％、90％或95％同一性且具有细胞穿透活性的其变体；或为具有seqidno:18的氨基酸序列的穿透素，或与seqidno:18具有至少85％、90％或95％同一性且具有细胞穿透活性的其变体，；(c)组氨酸富集结构域，其包含至少6个连续的组氨酸残基；或(d)(a)至(c)的任意组合。

(9)(1)至(8)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂包含seqidno:57-59、66-72或82-102任一项的氨基酸序列或与seqidno:57-59、66-72或82-102任一项具有至少85％、90％或95％同一性的其功能变体，或由其组成。

(10)(1)至(9)任一项的合成肽或基于多肽的穿梭剂，其中所述合成肽或基于多肽的穿梭剂是非毒性的和/或可代谢的。

(11)一种组合物，其包含：(a)如(1)至(10)任一项定义的合成肽或基于多肽的穿梭剂，和另一独立的包含组氨酸富集结构域和cpd的合成肽；和/或(b)如(1)至(10)任一项定义的至少2、至少3、至少4或至少5种不同类型的合成肽或基于多肽的穿梭剂的鸡尾酒。

(12)如(1)至(11)任一项定义的合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物的用途，其用于将独立的多肽负荷递送至靶真核细胞的细胞质。

(13)用于增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的方法，所述方法包括将所述靶真核细胞与如(1)至(11)任一项定义的合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物；以及所述多肽负荷接触。

(14)一种用于增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的试剂盒，所述试剂盒包含如(1)至(11)任一项定义合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物和适当的容器。

(15)(1)至(14)任一项的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其用于在血清存在下增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率中使用。

(16)(2)至(15)任一项的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其中所述多肽负荷：(a)包含或缺乏cpd或如权利要求4(b)定义的cpd；(b)是重组蛋白；(c)包含亚细胞靶向结构域；(d)与dna和/或rna分子复合；或(e)(a)至(d)的任意组合。

(17)(16)的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其中所述亚细胞靶向结构域为：(a)核定位信号(nls)；(b)核仁信号序列；(c)线粒体信号序列；或(d)过氧化物酶体信号序列。

(18)(17)的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其中：(a)所述nls来自：e1a、t-ag、c-myc、t-ag、op-t-nls、vp3、核浆素、组蛋白2b、非洲爪蟾n1、parp、pdx-1、qki-5、hcda、h2b、v-rel、amida、ranbp3、pho4p、lef-1、tcf-1、bdv-p、tr2、sox9或max；(b)所述核仁信号序列来自birc5或recql4；(c)所述线粒体信号序列来自tim9或酵母细胞色素c氧化酶亚单元iv；或(d)所述过氧化物酶体信号序列来自pts1。

(19)(2)至(18)任一项的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其中所述多肽负荷是转录因子、核酸酶、细胞因子、激素、生长因子或抗体。

(20)(19)的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其中：(a)所述转录因子是：hoxb4、nup98-hoxa9、oct3/4、sox2、sox9、klf4、c-myc、myod、pdx1、ngn3、mafa、blimp-1、eomes、t-bet、foxo3a、nf-ya、sall4、isl1、foxa1、nanog、esrrb、lin28、hif1-α、hlf、runx1t1、pbx1、lmo2、zfp37、prdm5、bcl-6或其任意组合；和/或(b)所述核酸酶是：rna导向的核酸内切酶、crispr核酸内切酶、i型crispr核酸内切酶、ii型crispr核酸内切酶、iii型crispr核酸内切酶、iv型crispr核酸内切酶、v型crispr核酸内切酶、vi型crispr核酸内切酶、crispr结合蛋白9(cas9)、cpf1、锌指核酸酶(zfn)、转录激活剂样效应核酸酶(talen)、导归核酸内切酶、大范围核酸酶或其任意组合。

(21)(1)至(20)任一项的合成肽、基于多肽的穿梭剂、组合物、用途、方法或试剂盒，其用于在细胞疗法、基因组编辑、过继性细胞转移和/或再生医学中使用。

(22)(2)至(21)任一项的穿梭剂、穿梭系统、组合物、用途、方法或试剂盒，其中所述靶真核细胞是干细胞、原代细胞、免疫细胞、t细胞或树突状细胞。

(23)一种真核细胞，其包含如(1)至(10)任一项定义的合成肽或基于多肽的穿梭剂，或(11)的组合物。

(24)(23)的真核细胞，其中所述细胞进一步包含由所述合成肽或基于多肽的穿梭剂细胞内递送的独立的多肽负荷。

(25)用于将独立的多肽负荷递送至靶真核细胞的细胞质的方法，所述方法包括使所述靶真核细胞与如(1)至(10)任一项定义的合成肽或基于多肽的穿梭剂或(11)的组合物；以及待由所述合成肽或基于多肽的穿梭剂细胞内递送的独立的多肽负荷接触。

(26)(23)或(24)的真核细胞或(25)的方法，其中所述独立的多肽负荷如(16)至(20)任一项定义。

(27)(24)或(26)的真核细胞或(25)或(26)的方法，其中所述独立的多肽负荷如(16)至(20)任一项定义。

(28)(23)、(24)、(26)或(27)的真核细胞或(25)、(26)或(27)的方法，其中所述真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、t细胞或树突状细胞。

一些方面，本说明书可涉及下述一项或多项：

1.用于增加独立的多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的方法，所述方法包括将所述靶真核细胞与合成肽和所述独立多肽负荷接触，其中所述合成肽：

(a)包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的具有内体切割活性的内体泄漏结构域(eld)或其变体或片段，其中所述eld包含seqidno:1-15、63或64任一项的氨基酸序列

(b)不与所述独立的多肽负荷共价结合；

(c)具有20至100个氨基酸残基的总长度；

(d)在生理ph具有至少+6的净电荷；和

(e)在生理ph在水性溶液中是可溶的，

其中所述cpd允许所述合成肽的细胞内递送，且所述eld允许内体捕获的独立的多肽负荷逃逸至靶真核细胞的细胞质。

2.项1的方法，其中所述合成肽具有20只70个氨基酸残基的总长度。

3.项1的方法，其中所述cpd包含具有细胞穿透活性的seqidno:16-27或65任一项的氨基酸序列或其变体或片段。

4.项1的方法，其中所述合成肽进一步包含组氨酸富集结构域，所述组氨酸富集结构域由含有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％组氨酸残基的至少6个氨基酸伸展构成；和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6个连续的组氨酸残基。

5.项1的方法，其中所述eld变体或eld片段与seqidno:1-15、63或64的任一项具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。

6.项3的方法，其中所述cpd变体或cpd片段与seqidno:16-27或65的任一项具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。

7.项1的方法，其中所述eld和cpd经由一个或多个接头结构域可操作连接。

8.项1的方法，其中所述合成肽是化学合成的无n末端甲硫氨酸残基。

9.项1的方法，其中所述合成肽包含seqidno:57-59、66-72或82-102任一项的氨基酸序列，或与seqidno:57-59、66-72或82-102任一项具有至少70％、至少85％、至少90％或至少95％同一性其功能变体。

10.项1的方法，其中所述独立的多肽负荷是缺乏cpd的重组蛋白。

11.项1的方法，其中所述独立的多肽负荷是转录因子、核酸酶、细胞因子、激素、生长因子或抗体。

12.项11的方法，其中：

(a)所述转录因子是：hoxb4、nup98-hoxa9、oct3/4、sox2、sox9、klf4、c-myc、myod、pdx1、ngn3、mafa、blimp-1、eomes、t-bet、foxo3a、nf-ya、sall4、isl1、foxa1、nanog、esrrb、lin28、hif1-α、hlf、runx1t1、pbx1、lmo2、zfp37、prdm5、bcl-6或其任意组合；或

(b)所述核酸酶是rna导向的核酸内切酶、crispr核酸内切酶、i型crispr核酸内切酶、ii型crispr核酸内切酶、iii型crispr核酸内切酶、iv型crispr核酸内切酶、v型crispr核酸内切酶、vi型crispr核酸内切酶、crispr结合蛋白9(cas9)、cpf1、锌指核酸酶(zfn)、转录激活剂样效应核酸酶(talen)、导归核酸内切酶或大范围核酸酶。

13.项11的方法，其中所述核酸酶是cas9或cpf1。

14.项13的方法，其中所述核酸酶进一步包含导向rna、crrna、tracrrna或crrna和tracrrna二者。

15.项1的方法，其中所述独立的多肽负荷包含核定位信号和另一种核定位信号。

16.项15的方法，其中所述独立的多肽负荷是转录因子或核酸酶。

17.项16的方法，其中：

(a)所述转录因子是：hoxb4、nup98-hoxa9、oct3/4、sox2、sox9、klf4、c-myc、myod、pdx1、ngn3、mafa、blimp-1、eomes、t-bet、foxo3a、nf-ya、sall4、isl1、foxa1、nanog、esrrb、lin28、hif1-α、hlf、runx1t1、pbx1、lmo2、zfp37、prdm5、bcl-6或其任意组合；或

(b)所述核酸酶是rna导向的核酸内切酶、crispr核酸内切酶、i型crispr核酸内切酶、ii型crispr核酸内切酶、iii型crispr核酸内切酶、iv型crispr核酸内切酶、v型crispr核酸内切酶、vi型crispr核酸内切酶、crispr结合蛋白9(cas9)、cpf1、锌指核酸酶(zfn)、转录激活剂样效应核酸酶(talen)、导归核酸内切酶或大范围核酸酶。

18.项17的方法，其中所述核酸酶是cas9或cpf1。

19.项18的方法，其中所述核酸酶进一步包含导向rna。

20.项1的方法，其中所述细胞是干细胞、原代细胞、免疫细胞、t细胞或树突状细胞。

21.用于增加独立的多肽负荷向靶真核细胞的细胞至转导的效率的方法，所述方法包括将所述靶真核细胞与合成肽和所述独立的多肽负荷接触，其中所述合成肽：

(a)包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)，其中所述eld是内体切割肽，其为或源自：线性阳离子α-螺旋抗微生物肽；杀菌肽-a/蜂毒肽杂交(cm系列)肽；ph-依赖性膜活性肽(pamp)；肽两亲物；衍生自流感血凝素(ha)的ha2亚单元n末端的肽；cm18；白喉毒素t结构域(dt)；gala；pea；inf-7；lah4；hgp；h5wyg；ha2；eb1；vsvg；假单胞菌毒素；蜂毒肽；kala；jst-1；c(llkk)3c；g(llkk)3g；

(b)不与所述独立的多肽负荷共价结合；

(c)具有20至100个氨基酸残基的总长度；

(d)在生理ph具有至少+6的净电荷；和

(e)在生理ph在水性溶液中是可溶的，

其中所述cpd允许所述合成肽的细胞内递送，且所述eld允许内体捕获的独立的多肽负荷逃逸至靶真核细胞的细胞质。

22.项21的方法，其中所述cpd为或源自：细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白转导结构域；tat；ptd4；穿透素(控制触角的基因)；pvec；m918；pep-1；pep-2；xentry；精氨酸伸展；运输蛋白；synb1；synb3；或其任意组合。

23.项21的方法，其中所述合成肽进一步包含组氨酸富集结构域，所述组氨酸富集结构域由含有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的组氨酸残基的至少3个氨基酸伸展构成；和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6个连续的组氨酸残基。

24.项21的方法，其中所述eld和cpd经由一个或多个接头结构域可操作连接。

25.项21的方法，其中所述独立的多肽负荷是转录因子、核酸酶、细胞因子、激素、生长因子或抗体。

26.项25的方法，其中所述转录因子是：hoxb4、nup98-hoxa9、oct3/4、sox2、sox9、klf4、c-myc、myod、pdx1、ngn3、mafa、blimp-1、eomes、t-bet、foxo3a、nf-ya、sall4、isl1、foxa1、nanog、esrrb、lin28、hif1-α、hlf、runx1t1、pbx1、lmo2、zfp37、prdm5、bcl-6或其任意组合。

27.项25的方法，其中所述核酸酶是rna导向的核酸内切酶、crispr核酸内切酶、i型crispr核酸内切酶、ii型crispr核酸内切酶、iii型crispr核酸内切酶、iv型crispr核酸内切酶、v型crispr核酸内切酶、vi型crispr核酸内切酶、crispr结合蛋白9(cas9)、cpf1、锌指核酸酶(zfn)、转录激活剂样效应核酸酶(talen)、导归核酸内切酶或大范围核酸酶。

28.项25的方法，其中所述核酸酶是cas9或cpf1。

29.用于增加独立的多肽负荷向靶真核细胞的细胞至转导的效率的方法，所述方法包括将所述靶真核细胞与合成肽和所述独立的多肽负荷接触，所述独立的多肽负荷不与所述合成肽共价结合，其中所述合成肽包含与细胞穿透结构域可操作连接的内体泄漏结构域(eld)或与cpd和组氨酸富集结构域可操作连接的eld，其中：

(a)所述eld包含seqidno:1-15、63,或64任一项的氨基酸序列；

(b)所述cpd包含seqidno:16-27或65任一项的氨基酸序列；且

(c)所述组氨酸富集结构域包含至少两个连续的组氨酸残基。

30.用于将crispr结合蛋白9(cas9)递送至靶真核细胞的核的方法，所述方法包括使所述真核细胞与含有核定位信号的cas9重组蛋白和单独的合成肽穿梭剂接触，所述合成肽穿梭剂长度小于100个残基且包含与细胞穿透结构域可操作连接的内体泄漏结构域(eld)或与cpd和组氨酸富集结构域可操作连接的eld，其中：

(a)所述eld包含seqidno:1-15、63或64任一项的氨基酸序列；

(b)所述cpd包含seqidno:16-27或65任一项的氨基酸序列；且

(c)所述组氨酸富集结构域包含至少两个连续的组氨酸残基。

一般性定义

提供标题和其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求书。在说明书或权利要求书中使用标题或其他标识符不一定要求以字母或数字顺序或其呈现的顺序来执行步骤或元素。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，使用词语“一”或“一个”可以表示“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

术语“约”用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的标准偏差。一般来说，术语“约”意味着指定高达10％的可能变化。因此，术语“约”包含1、2、3、4、5、6、7、8、9和10％的值的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(以及包含的任何形式，诸如“包含”和“包含”)、“具有”(以及具有的任何形式诸如“具有”和“具有”)、“包括”(以及包括的任何形式诸如“包括”和“包括”)或“包含”(以及包含的任何形式，如“包含”和“包含”)是包容性的或开放式的且不排除额外、未记载的元素或方法步骤。

如本文所用，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸的任何肽连接的链，其可以包含或可以不包含任何类型的修饰(例如翻译后修饰如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、sumo化、异戊烯化、泛素化等)。

如本文所用，表述“是或来自”或“来自”包括给定蛋白质结构域(cpd或eld)的功能变体，例如保守的氨基酸取代、缺失、修饰以及变体或功能衍生物，这不会消除蛋白质结构域的活性。本说明书的其他目的、优势和特征将通过阅读以下仅参照附图以实例的方式给出的具体实施方案的非限制性描述而变得更加明显。

附图简述

在附图中：

图1钙黄绿素内体逃逸测定的典型结果，其中hek293a细胞负载有荧光染料钙黄绿素(“100μm钙黄绿素”)，然后用促进钙黄绿素内体逃逸的穿梭剂处理(或不处理)(“100μm钙黄绿素+cm18-tat5μm”)。图a显示了荧光显微镜实验的结果，而图b显示了流式细胞术实验的结果。

图2显示了钙黄绿素内体逃逸流式细胞术测定的结果，其中hela细胞负载有钙黄绿素(“钙黄绿素100μm”)，然后用递增浓度的穿梭剂cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)处理。

图3和4显示了钙黄绿素内体逃逸流式细胞术测定的结果，其中hela细胞(图3)或原代成肌细胞(图4)装载有钙黄绿素(“钙黄绿素100μm”)，然后用5μm或8μm穿梭剂cm18-tat-cys或cm18-穿膜肽-cys(分别标记为“cm18-tat”和“cm18-穿膜肽”)处理。

图5显示了通过荧光显微镜观察的gfp转导实验的结果，其中将gfp负荷蛋白与0、3或5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育，然后暴露于hela细胞。通过明场(上图)和荧光显微镜(下图)观察细胞。

图6显示gfp转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将gfp负荷蛋白(10μm)与不同浓度的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育。细胞通过流式细胞术进行评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图7显示了gfp转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将不同浓度的gfp负荷蛋白(10、5或1μm)与5μm的cm18-tat-cys(图a，标记为“cm18tat”)或2.5μm的dcm18-tat-cys(图b，标记为“dcm18tat”)共温育。通过流式细胞术评估细胞，并显示荧光(gfp-阳性)细胞的百分比。

图8和9显示了gfp转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将gfp负荷蛋白(10μm)与不同浓度和组合的cm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)、cm18-穿膜肽-cys(标记为“cm18穿膜肽”)和每种的二聚体(dcm18-tat-cys(标记为“dcm18tat”)、dcm18-穿膜肽-cys(标记为“dcm18穿膜肽”)共温育。通过流式细胞术评估细胞，并显示荧光(gfp-阳性)细胞的百分比。

图10显示了tat-gfp转导实验的典型结果，其中在暴露于hela细胞之前，将tat-gfp负荷蛋白(5μm)与3μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育。通过10倍和40倍放大倍数的明场和荧光显微镜观察细胞和gfp荧光。箭头指示在不存在cm18-tat-cys的情况下tat-gfp的内体递送以及在cm18-tat-cys存在下的其核递送。

图11显示tat-gfp转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将tat-gfp负荷蛋白(5μm)与不同浓度的cm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)共温育。细胞通过流式细胞术评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图12显示gfp-nls转导实验的典型结果，其中在暴露于hela细胞5分钟之前，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育。通过放大10倍、20倍和40倍的明场和荧光显微镜观察细胞和gfp荧光。箭头表示gfp-nls的核递送区域。

图13显示gfp-nls转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与不同浓度的cm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)共温育。细胞通过流式细胞术评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图14和15显示gfp-nls转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与不同浓度和组合的cm18-tat(标记为“cm18tat”)、cm18-穿透素(标记为“cm18穿膜肽”)和每种的二聚体(dcm18-tat-cys、dcm18-穿膜肽-cys；分别标记为“dcm18tat”和“dcm18穿膜肽”)共温育。通过流式细胞术评估细胞，并显示荧光(gfp-阳性)细胞的百分比。

图16显示gfp-nls转导效率实验的结果，其中在进行流式细胞术分析之前，在纯dmem培养基(“dmem”)或含有10％fbs(“fbs”)的dmem培养基中，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与单独的cm18-tat-cys(3.5μm，标记为“cm18tat”)或与dcm18-穿膜肽-cys(1μm，标记为“dcm18pen”)共温育5分钟或1小时。显示了荧光(gfp-阳性)细胞的百分比。使用未用穿梭剂或gfp-nls(“对照”)处理的细胞以及用不具有穿梭剂(gfp-nls5μm)的gfp-nls处理的细胞用作对照。

图17显示gfp-nls转导效率实验的结果，其中在暴露于thp-1细胞之前，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与或不与1μmcm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)共温育。细胞通过流式细胞术评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图18显示了转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，负荷蛋白fitc标记的抗微管蛋白抗体(0.5μm)与5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育。功能性抗体递送通过明场(20x)和荧光显微镜(20x和40x)观察，其中可见在细胞质中的荧光微管蛋白纤维。

图19显示了fitc标记的抗微管蛋白抗体转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将抗体负荷蛋白(0.5μm)与3.5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)、cm18-穿膜肽-cys(标记为“cm18pen”)或dcm18-穿膜肽-cys(标记为“dcm18pen”)或3.5μm的cm18-tat-cys和0.5μm的dcm18-穿膜肽-cys的组合共温育。细胞通过流式细胞术评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图20显示了dna转染效率实验的结果，其中在暴露于hek293a细胞之前，将用cy5^tm染料标记的质粒dna(pegfp)与0、0.05、0.5或5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18-tat”)共温育。流式细胞术分析允许定量cy5^tm发射(对应于dna细胞内递送；y轴)和gfp发射(对应于dna的成功核递送；每个柱状图上指示的百分比)。

图21显示gfp-nls转导效率实验的结果，其中在暴露于hela细胞之前，将gfp-nls负荷蛋白(5μm)与1、3或5μm的cm18-tat-cys(标记为“cm18tat”)、his-cm18-tat(标记为“his-cm18tat”)共温育。细胞通过流式细胞术评估，荧光(gfp-阳性)细胞的百分比显示在图a中，相应的细胞毒性数据显示在图b中。

图22显示转导效率实验的结果，其中在hela细胞中使用穿梭his-cm18-ptd4细胞内递送gfp-nls负荷蛋白质。通过流式细胞术评估gfp-nls转导效率并显示了gfp荧光细胞的百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。图a显示了使用不同转导方案的gfp-nls转导效率的比较(方案a比b)。图b显示了当使用方案b时使用不同浓度的穿梭his-cm18-ptd4的效果。

图23-26是显示转导实验结果的显微图像，其中gfp-nls(图23、24a、24b、25和26)或fitc标记的抗微管蛋白抗体(图24c和24d)负荷蛋白使用穿梭his-cm18-ptd4在hela细胞中细胞内递送。图23、24和26中显示了活细胞的明场和荧光图像。在图25中，将细胞固定，透化并用抗gfp抗体和荧光二抗进行免疫标记。白色三角形窗口指示核(dapi)和gfp-nls信号之间共标记区域的实例。图26显示了通过共聚焦显微镜捕获的图像。

图27显示hela细胞中的动力学(时程)转导实验的显微镜图像，其中在使用穿梭his-cm18-ptd4细胞内递送后45、75、100和120秒跟踪gfp-nls负荷蛋白的荧光。45秒后观察到的扩散的细胞质荧光模式(图a)在120秒时逐渐变成更浓缩的核模式(图d)。

图28显示共递送转导实验的显微镜图像，其中两种负荷蛋白(gfp-nls和mcherry^tm-nls)通过穿梭his-cm18-ptd4在hela细胞中同时细胞内递送。通过(a)明场和(b-d)荧光显微镜观察细胞和荧光信号。白色三角形窗口指示核(dapi)和gfp-nls或mcherry^tm之间共标记区域的实例。

图29显示使用不同穿梭剂或单结构域/对照肽的hela细胞中gfp-nls转导效率实验的结果。通过流式细胞术评估gfp-nls转导效率且在图a、b、d-g和i显示gfp荧光细胞百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。在图a和d-f中，将细胞暴露于负荷/穿梭剂10秒钟。在图i中，细胞暴露于负荷/穿梭剂1分钟。在图b、c、g和h中，细胞暴露于负荷/穿梭剂1、2或5分钟。“相对荧光强度(fl1-a)”或“信号强度”对应于gfp-nls荧光蛋白在用穿梭剂递送后来自具有gfp荧光信号的每个细胞的所有荧光强度的平均值。图d显示了对照实验的结果，其中仅使用单结构域肽(eld或cdp)或肽his-ptd4(his-cpd)而不是多结构域穿梭剂用于gfp-nls转导。

图30显示使用穿梭剂(a)tat-kala、(b)his-cm18-ptd4、(c)his-c(llkk)3c-ptd4、(d)ptd4-kala、(e)eb1-ptd4和(f)his-cm18-ptd4-his以gfp-nls转导hela细胞的显微镜图像。最下面一排中的插图显示了相应的流式细胞术分析的结果，表明呈现gfp荧光的细胞的百分比。

图31显示转导效率实验的结果，其中使用穿梭his-cm18-ptd4使用不同的方案(方案a对c)在thp-1细胞中细胞内递送gfp-nls负荷蛋白。通过流式细胞术评估了gfp-nls转导效率并显示了gfp荧光细胞的百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。“对照”对应于在没有穿梭剂的情况下暴露于gfp-nls负荷蛋白的thp-1细胞。

图32显示了使用穿梭his-cm18-ptd4以gfp-nls负荷蛋白转导的thp-1细胞的显微镜图像。以4倍，10倍和40倍放大倍数拍摄的图像分别显示在图a-c中。图c中的白色三角形窗口指示细胞(明场)和gfp-nls荧光之间共标记的区域的实例。图d显示相应的流式细胞术分析的结果，表明呈现gfp荧光的细胞的百分比。

图33显示了使用穿梭his-cm18-ptd4以gfp-nls负荷蛋白转导的thp-1细胞的显微镜图像。白色三角形窗口指示细胞(明场；图a和b)和gfp-nls荧光(图c和d)之间共标记区域的实例。

图34显示了在thp-1细胞中使用穿梭tat-kala、his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4的gfp-nls转导效率实验的结果。负荷蛋白/穿梭剂暴露于thp-1细胞15、30、60或120秒。通过流式细胞术评估了gfp-nls转导效率且在图a中显示了gfp荧光细胞的百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。在图b中，“相对荧光强度(fl1-a)”对应gfp-nls荧光蛋白在用穿梭剂递送后来自具有gfp荧光信号的每个细胞的所有荧光强度的平均值。

图35显示转导效率实验的结果，其中thp-1细胞在穿梭剂存在下每天暴露于gfp-nls负荷2.5小时。在图a-e中使用his-cm18-ptd4，在图f中使用his-c(llkk)3c-ptd4。在第1天和第3天通过流式细胞术确定gfp-nls转导效率，且在图a-c和f中将结果表示为gfp荧光细胞的百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。对于暴露于his-cm18-ptd4穿梭剂的细胞，图d显示1、2、4和24h后thp-1细胞的代谢活性指数，且图e显示1-4天后thp-1细胞的代谢活性指数。

图36显示如通过流式细胞术所测量，在多种不同类型的细胞中(例如贴壁和悬浮，以及细胞系和原代细胞)使用穿梭his-cm18-ptd4的gfp-nls转导效率的比较。结果表示为gfp荧光细胞的百分比(“阳性细胞(％)”)以及相应的细胞活力数据(“活力(％)”)。

图37显示使用穿梭his-cm18-ptd4以gfp-nls负荷转导的不同类型的细胞(a-h)的荧光显微镜图像。通过荧光显微镜在10x放大倍数下观察gfp荧光。插图中还提供了平行的流式细胞术实验结果(gfp荧光细胞的活力和百分比)。

图38显示使用穿梭his-cm18-ptd4以gfp-nls转导的原代人成肌细胞的荧光显微镜图像。在用抗gfp抗体和荧光二抗免疫标记gfp-nls之前，将细胞固定并透化。图a中显示了免疫标记的gfp，并且该图像于图b中的核(dapi)标记重叠。

图39显示了用于评估细胞内递送的crispr/cas9-nls复合物的活性的转染质粒替代测定的示意图(a、b和c)和样品荧光图像(d和e)。(a)在第1天，用编码荧光蛋白mcherry^tm和gfp的表达质粒转染细胞，用终止密码子分离它们的两个开放阅读框。用表达质粒转染细胞仅导致mcherry^tm表达(d)。然后将已经设计/编程以在终止密码子处切割质粒dna的crispr/cas9-nls复合物细胞内递送至表达mcherry^tm的转染细胞，在终止密码子处产生质粒dna的双链切割(b)。在一部分细胞中，发生切割的质粒的随机非同源dna修复，并导致终止密码子的去除(c)，从而去除gfp表达和荧光(e)。白色三角形窗口表示mcherry^tm和gfp荧光的共同标记区域的实例。

图40显示了表达mcherry^tm和gfp的hela细胞的荧光显微图像，表明crispr/cas9-nls介导的质粒替代dna的切割。在图a-d中，以三种质粒共转染hela细胞：如图39概述中所述的质粒替代品，和分别编码cas9-nls蛋白和crrna/tracrrna的两种其他表达质粒。crispr/cas9-介导的在终止密码子处质粒替代的切割和随后的通过细胞的dna修复允许gfp(图b和d)以及mcherry^tm(图a和c)的表达。在图e-h中，使用穿梭his-cm18-ptd4以质粒替代品转染且随后以活性crispr/cas9-nls复合物转导hela细胞crispr/cas9-介导的在终止密码子处质粒替代的切割和随后的通过细胞的dna修复允许gfp(图f和h)以及mcherry^tm(图e和g)的表达。

图41a显示通过琼脂糖凝胶电泳分离的dna切割测定(t7e1测定)的产物，其用于测量crispr/cas9介导的细胞基因组dna的切割。将hela细胞用经程序化以切割ppib基因的crispr-cas9-nls复合物转导。在白色框1和2中出现切割产物表明通过crispr-cas9-nls复合物(其使用穿梭his-c(llkk)3c-ptd4(道b)或以用作阳性对照的脂质转染剂(道d)细胞内递送)对ppib基因的切割。该切割产物在阴性对照(道a和c)中不存在。

图41b显示通过琼脂糖凝胶电泳分离的dna切割测定(t7e1测定)的产物，其用于测量crispr/cas9介导的细胞基因组dna的切割(ppibdna序列)。左图显示了在hela细胞中用穿梭剂his-cm18-ptd4递送复合物之后通过cripr/cas9复合物扩增的ppibdna序列的切割产物。右图显示在t7e1消化程序之前扩增的dna序列作为阴性对照。

图41c显示通过琼脂糖凝胶电泳分离的dna切割测定(t7e1测定)的产物，其用于测量crispr/cas9介导的细胞基因组dna切割(ppibdna序列)。左图显示了hela细胞与cas9/rna复合物在脂质转染剂存在下温育后的扩增ppibdna序列(dharmafect^tm转染剂#t-20xx-01)(阳性对照)。右图显示在t7e1消化程序之前扩增的dna序列作为阴性对照。图42-44显示了使用不同浓度的穿梭his-cm18-ptd4和不同的负荷/穿梭剂暴露时间，已经用转录因子hoxb4转导的thp-1细胞的转录活性。通过实时pcr监测靶基因的mrna水平来确定hoxb4的成功的核内递送，并且将结果针对阴性对照(hoxb4而无穿梭剂)中的那些进行标准化并表示为“超过对照的倍数”(左侧柱状图)。量化总细胞rna(ng/μl)并用作细胞活力的标记物(右侧柱状图)。或“对照”意为“无处理”；“tf”意为‘’仅转录因子”；“fs”意为“仅穿梭剂”。

图45显示了使用穿梭his-cm18-ptd4以野生型hoxb4负荷转导的hela细胞的荧光显微镜图像。30分钟温育以允许转导的hoxb4-wt在核中积累后，固定、透化细胞并使用原代抗hoxb4单克隆抗体和荧光二抗标记hoxb4-wt(图b和d)。以dapi标记核(图a和c)。白色三角形窗口表示核和hoxb4间共标记区域的实例–比较a比b(x20放大倍数)和c比d(x40放大倍数)。

图46显示了通过琼脂糖凝胶电泳分离的dna切割测定的产物，其用于在以不同的穿梭剂胞内递送复合物之后测量crispr/cas9介导的细胞基因组dna的切割(hptr序列)。图a显示在hela细胞中使用下述穿梭剂的结果：his-cm18-ptd4、his-cm18-ptd4-his和his-c(llkk)3c-ptd4。图b显示在jurkat细胞中使用his-cm18-ptd4-his和his-cm18-l2-ptd4的结果。阴性对照(图a和b中的道4)显示细胞与crispr/cas9复合物而无穿梭剂存在下温育后扩增的hptrdna序列。阳性对照(图a和b中的道5)显示细胞与crispr/cas9复合物在市售脂质转染剂存在下温育后扩增的hptrdna序列。

图47显示使用穿梭剂his-cm18-ptd4、tat-kala、eb1-ptd4、his-c(llkk)3c-ptd4和his-cm18-ptd4-his已用转录因子hoxb4转导的thp-1细胞的转录活性。通过实时pcr监测靶基因的mrna水平来确定hoxb4的成功的核内递送，并且将结果针对阴性对照(hoxb4而无穿梭剂)中的那些进行标准化并表示为“超过对照的倍数”(左侧柱状图)。量化总细胞rna(ng/μl)并用作细胞活力的标记物(右侧柱状图)。或“对照”意为“无处理”；“tf”意为‘’仅转录因子”；“fs”意为“仅穿梭剂”。

图48显示通过his-cm18-ptd4在大鼠顶叶皮层中的体内gfp-nls递送。简而言之，在穿梭剂his-cm18-ptd4(20μm)的存在下将gfp-nls(20μm)注射到大鼠的顶叶皮质中10分钟。收集腹侧大鼠脑切片并在(a)4x，(c)10x和(d)20x放大倍数下通过荧光显微镜分析。注射部位位于顶叶皮层(pcx)的最深层。在his-cm18-ptd4穿梭剂存在下，gfp-nls在pcx，胼胝体(cc)和纹状体(str)的细胞核中扩散(白色曲线标记脑结构间的限制)。图b显示来自franklin和paxinos的大鼠脑图谱的注射部位(黑色箭头)的立体坐标。在脑的左侧部分实施his-cm18-ptd4存在下gfp-nls的注射，在对侧部位进行阴性对照(仅gfp-nls的注射)。图b中的黑色圆圈和黑色连线显示在荧光图像(a，c和d)中观察到的区域。

序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其命名为sequence_listing.txt，生成于2016年4月3日，具有约57kb的大小。计算机可读形式通过提述并入本文。

发明详述

本说明书源自令人惊讶的发现，即包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)的多结构域合成肽可以显著增加独立的多肽负荷向真核靶细胞的细胞质转导的效率。相反，使用仅含有eld的独立的单结构域肽，或者仅使用单独的cpd或与cpd一起(即在单独的单结构域肽的混合物中)没有发现转导效率的这种增加。因此，在一些方面，本说明书涉及一种基于多肽的穿梭剂，其包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作连接的内体泄漏结构域(eld)，或与组氨酸富集合结构域和cpd可操作连接的eld，其用于增加独立的多肽负荷向靶真核细胞的细胞质的转导效率。

合成肽和基于多肽的穿梭剂

如本文所用，在如“合成肽”或“合成多肽”的表述中使用的术语“合成”旨在表示可以在体外产生的非天然存在的分子(例如化学合成和/或使用重组dna技术产生的)。多种合成制剂的纯度可以通过例如高效液相色谱分析和质谱来评估。与细胞表达系统(例如酵母或细菌蛋白质表达系统)相比，化学合成方法可能是有利的，因为它们可能排除了对广泛的重组蛋白质纯化步骤(例如临床使用所需)的需要。相比之下，较长的合成多肽经由化学合成方式可能是更复杂且成本更高的且这样的多肽可以使用细胞表达系统更有利地产生。在一些实施方案中，与从重组宿主细胞表达相反，本发明的肽或穿梭剂可以是化学合成的(例如，固-液相肽合成)。在一些实施方案中，本发明的肽或穿梭剂可能缺乏n-末端甲硫氨酸残基的。本领域的技术人员可以通过使用一个或多个经修饰的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)，或通过化学修饰本发明的合成肽或穿梭剂以使本发明的合成肽或穿梭剂适应稳定性的特定需求或其他需求。

当在本发明穿梭剂的语境中使用时，表述“基于多肽的”旨在将本发明所述的穿梭剂与非多肽或非基于蛋白的穿梭剂如基于脂质或阳离子多聚体的转导剂进行区分，基于脂质或阳离子多聚体的转导剂经常与增加的细胞毒性相关且可能不适于在人类疗法中使用。

如本文使用的表述“增加转导效率”指穿梭剂(例如本发明基于多肽的穿梭剂)改善感兴趣的负荷(例如多肽负荷)细胞内递穿过质膜进入其中的靶细胞群的百分比或比例。可以使用免疫荧光显微术、流式细胞术和其他适当的方法以评估负荷的转导效率。在一些实施方案中，本发明的穿梭剂允许至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的转导效率，例如如通过免疫荧光显微术、流式细胞术、facs和其他适当的方法所测量。在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可允许上述转导效率之一同时期待至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞活力，例如如通过实施例3.3a中所述的测定或通过其他本领域已知的适当的测定所测量。

如本文使用，术语“独立的”一般旨在指彼此不共价结合的分子或作用剂。例如，表述“独立的多肽负荷”旨在指不与本发明的穿梭剂共价结合(例如未融合)的待细胞内递送的多肽负荷。一些方面，具有独立于多肽负荷(未与其融合)的穿梭剂通过提供增加的穿梭剂的通用性是有利的--例如对于不同的多肽负荷无需再次工程化新的融合蛋白)和/或能够容易地改变穿梭剂比负荷的比率(与在融合蛋白中限制为1:1的比率的情况相反)。

除增加的靶细胞转导效率，本发明的穿梭剂可促进感兴趣的负荷(例如多肽负荷)向靶细胞的细胞质的递送。在这方面，使用基于细胞穿透肽的方法将细胞外负荷有效递送至靶细胞的细胞质可能是具有挑战性的，这是因为负荷在穿过质膜后经常被捕获在细胞内内体中，这可能限制其细胞内的利用度并导致其最终的代谢降解。例如，已报导使用来自hiv-1tat蛋白的蛋白转导结构域导致负荷被大量封存到细胞内囊泡中。一些方面，本发明的穿梭剂可促进内体捕获的负荷从内体逃逸并获得进入细胞质区室通路的能力。在这方面，词语“增加独立的多肽负荷向细胞质的转导效率”中的表述“向细胞质”旨在指本发明的穿梭剂允许细胞内递送的感兴趣的负荷逃逸内体截留并获得进入细胞质区室的通路的能力。感兴趣的复合获得进入细胞质的通路后，其可随后靶向多种亚细胞区室(例如核、核仁、线粒体、过氧化物酶体)。在一些实施方案中，表述“向细胞质”因此旨在不仅涵盖细胞质递送，还涵盖递送至其他亚细胞区室，这首先需要复合获得进入细胞质区室的通路。

如本文使用的"结构域"或"蛋白结构域"一般指具有特定功能性或功能的蛋白的部分。一些保守的结构域从蛋白质的其余部分分离时保存其功能，因此可以模块的方式使用。通过将来自病毒、细菌或真核来源的不同蛋白的这种结构域组合，根据本说明书成为可能的是不仅能够设计细胞内递送负荷的多结构域的基于多肽的穿梭剂，还允许负荷逃逸内体并达到细胞质区室。许多蛋白结构域的模块化特性就在本发明的穿梭剂内对其替换而言提供了弹性。然而，当在一定位置(例如在n-或c-末端区或其间)与穿梭剂工程化时，一些结构域可能表现地更好。结构域在其内源性蛋白质内的位置有时是结构域应在穿梭剂内何处工程化和应使用何种类型/长度的接头的指示。基于本说明书，标准的重组dna技术可由本领域的技术人员使用以操纵本发明穿梭剂内结构域的替换和/或数目。此外，在穿梭剂的语境中，可使用本文公开的测定以及其他本领域已知的测定评估每个结构域的功能性(例如它们促进穿过质膜的细胞穿透、内体逃避和/或进入细胞质的能力)。因此可以使用标准方法来评估穿梭剂的结构域是否影响待细胞内递送的负荷的活性。在这方面，如本文使用的表述“可操作连接”指在本发明穿梭剂的语境下结构域实施其预期的功能(例如细胞穿透、内体逃逸和/或亚细胞靶向)的能力。为了更清楚起见，表述“可操作连接”意在定义两个或更多个结构域之间的功能连接，而不限于其间的特定顺序或距离。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的最小长度和35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个氨基酸残基的最大长度。在一些实施方案中，较短的合成肽或基于多肽的穿梭剂是特别有利的，这是由于其可通过化学合成的方式更容易地合成并纯化，其可以更适于临床使用(与必须从细胞表达系统纯化的重组蛋白相反)。虽然在本说明书中数字和范围都经常列为5的倍数，本说明书应不限于此。例如，本发明中，本文所述的最大长度可理解为还涵盖36、37、38…51、62等的长度，且本文未列举其长度仅仅是为了简洁起见。同样的推理也适用于本文列举的同一性％(例如86％，87％...93％...)、组氨酸残基的百分比等。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可在生理ph可包含至少+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15的预测的净电荷。这些正电荷一般由带正电的赖氨酸和/或精氨酸残基(与带负电的天冬氨酸和/或谷氨酸残基相反)更多的存在赋予。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂在水性溶液中是可溶的(例如在生理ph)，这促进了其使用在例如细胞培养基中将负荷细胞内递送至活细胞。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含seqidno:57-59,66-72,或82-102的任一项的氨基酸序列或与seqidno:57-59,66-72,或82-102的任一项具有至少至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％,或95％同一性的其功能性变体，或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含如本文定义的合成肽或基于多肽的寡聚体(例如二聚体、三聚体等)。这样的寡聚体可通过共价结合相同或不同类型的穿梭剂单体构建(例如使用二硫桥以连接引入单体序列的半胱氨酸)。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含n-末端和/或c-末端半胱氨酸残基。

内体泄漏结构域(eld)

一些方面，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含用于促进内体逃逸和进入细胞质区室的内体泄漏结构域(eld)。如本文使用，表述“内体泄漏结构域”指赋予内体捕获的大分子获得进入细胞质区室的通路的能力的氨基酸序列。不受理论所限，内体泄漏结构域是短序列(经常源自病毒或细菌肽)，相信其诱导内体膜的不稳定化和体内内容物向细胞质的释放。如本文使用，表述“内体切割肽”旨在指代具有内体膜不稳定特征的该普通种类的肽。因此，在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含为内体切割肽的eld。这种肽的活性可例如使用实施例2中所述的钙黄绿素内体逃逸测定评估。

在一些实施方案中，eld可以是在酸性ph破坏膜的肽，如ph-依赖性膜活性肽(pmap)或ph-依赖性切割肽。例如，肽gala和inf-7是当ph下降改变了它们所含的电荷时形成α螺旋的两亲性肽。更具体的，不受理论所限，表明eld如gala由于ph降低构象改变后通过形成孔和膜脂质的翻转诱导内体泄漏(kakudo,chaki等人,2004,li,nicol等人,2004)。相反地，表明eld如inf-7通过在内体膜积累并使内体膜不稳定化诱导内体泄(el-sayed,futaki等人,2009)。因此，在内体成熟过程中，伴随着ph的下降引起肽构象的变化且其使内体膜不稳定化导致内体内容物的释放。认为相同的原理适用于假单胞菌的毒素a(varkouhi,scholte等人,2011)。ph下降后，毒素转位结构域的构象改变，允许其插入内体膜，其在内体膜上形成孔(london1992,o'keefe1992)。这最终有利于体内体的不稳定化和复合物向内体外的转位。上述eld涵盖在本说明书的eld以及其作用机制未详尽界定的其他内体泄漏机制中。

在一些实施方案中，eld可以是抗微生物肽(amp)如线性阳离子α螺旋抗微生物肽(amp)。由于其与细菌膜强相互作用的能力，这些肽在天然免疫响应中起关键作用。不受理论所限，认为这些肽在水性溶液中呈现无序状态，但在疏水环境中采取α-螺旋二级结构。后者的构象认为有助于其典型的浓度依赖性膜破坏性质。当以某些浓度在内体中积累时，一些抗菌肽可能诱导内体泄漏。

在一些实施方案中，eld可以是抗微生物肽(amp)如杀菌肽-a/蜂毒肽杂交(cm系列)肽。认为这样的肽在具有膜破坏能力的最小和最有效的amp-衍生肽中。杀菌肽是针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有膜扰动能力的抗微生物肽家族。杀菌肽a(ca)，第一种被鉴定的抗菌肽，由具有线性结构的37个氨基酸构成。蜂毒肽(m)，一种26个氨基酸的肽，是在蜜蜂毒液中发现的细胞膜切割因子。杀菌肽-蜂毒肽杂交肽已显示产生短的有效抗生素肽而对于真核细胞无细胞毒性(即非溶血性)，一种在任何抗菌剂中都是理想的性质。这些嵌合肽构建自杀菌肽a亲水n末端结构域与蜂毒肽疏水n末端结构域的多种组合，且已对细菌模型系统进行了测试。2种26聚体，ca(1-13)m(1-13)andca(1-8)m(1-18)(boman等人,1989)已显示证明了广谱和改进的天然杀菌肽a效价而无蜂毒肽的细胞毒性效应。

在产生较短cm系列肽的工作中，andreu等人,1992的作者构建了杂交肽如26聚体(ca(1-8)m(1-18))，且将其与20聚体(ca(1-8)m(1-12))、18聚体(ca(1-8)m(1-10))和6种15聚体((ca(1-7)m(1-8)、ca(1-7)m(2-9)、ca(1-7)m(3-10)、ca(1-7)m(4-11)、ca(1-7)m(5-12)和ca(1-7)m(6-13))进行了比较。20和18聚体相比ca(1-8)m(1-18)维持相似的活性。在6种15聚体中，ca(1-7)m(1-8)显示了第抗菌活性，但其他五种相比26聚体显示了相似的抗生素效价而无溶血作用。因此，在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含为或来自cm系列肽的变体的eld，如上文所述的那些。

在一些实施方案中，eld可以是与蜂毒肽的残基2-12(ygrkkrrqrrr)融合的杀菌肽-a(kwklfkkigavlkvlttg)的残基1-7构成的cm系列肽cm18，[c(1–7)m(2–12)]。当与细胞穿透肽tat融合时，cm18显示独立地穿过质膜并使内体膜不稳定化，允许一些内体捕获的复合释放指细胞质(salomone等人,2012)。然而，在作者的一些实验中，与荧光团融合的cm18-tat11肽的使用对于肽比荧光团的贡献引起了不确定性，这是由于荧光团本身已显示了对内体切割的贡献—例如经由内体膜的光化学破坏(erazo-oliveras等人,2014)。

在一些实施方案中，eld可以是具有内体切割活性的具有seqidno:1的氨基酸序列的cm18，或与seqidno:1具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性的其变体。

在一些实施方案中，eld可以是衍生自流感血凝素(ha)的ha2亚单元的n末端的肽，当在内体中积累时其还可引起内体膜的不稳定化。

在一些实施方案中，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可包含为或来自表a中所述的eld的eld，或具有内体逃逸活性和/或ph依赖的膜破坏活性的其变体。

表a:内体泄漏结构域的实例

在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可包含一个或多个eld或一种或多种类型的eld。更具体地，其可包含至少2、至少3、至少4、至少5或更多个eld。在一些实施方案中，穿梭剂可包含1-10个eld、1-9个eld、1-8个eld、1-7个eld、1-6个eld、1-5个eld、1-4个eld、1-3个eld等。

在一些实施方案中，eld相对本发明穿梭剂内其他结构域的顺序或放置可变化，只要穿梭剂的穿梭能力保留。

在一些实施方案中，eld可以是表a中所列那些并具有内体切割活性的任一种的变体或片段。在一些实施方案中，eld可包含seqidno:1-15、63或64任一种的氨基酸序列，或与seqidno:1-15、63或64任一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％相同的序列，或由其构成，并具有内体切割活性。

细胞穿透结构域(cpd)

一些方面，本发明的穿梭剂可包含细胞穿透结构域(cpd)。如本文使用的表述“细胞穿透结构域”指赋予包含cpd的大分子(例如肽或蛋白)转导入细胞的能力的氨基酸序列。

在一些实施方案中，cpd可以是(或可以来自)细胞穿透肽或细胞穿透肽的蛋白转导结构域。细胞穿透肽可作为载剂发挥作用以成功细胞内递送多种负荷(例如多核苷酸、多肽、小分子化合物或其他大分子/以其他方式不可透过膜的化合物)。细胞穿透肽经常包括富有碱性氨基酸的短肽，其一旦与大分子融合(或以其他方式可操作连接)，介导其内化入细胞(shaw,catchpole等人,2008)。第一种细胞穿透肽通过分析hiv-1转录顺式活化因子(tat)蛋白的细胞穿透能力鉴别(greenandloewenstein1988,vives,brodin等人,1997)。该蛋白包含短亲水氨基酸序列，称为“tat”，其促进其插入质膜内并形成孔。自该发现起，已描述了多种其他细胞穿透肽。在该方面，在一些实施方案中，cpd可以是如表b中所列的细胞穿透肽，或具有细胞穿透肽活性的其变体。

表b：细胞穿透肽的实例

不受理论所限，认为细胞穿透肽通过胞饮作用或内吞作用穿过前与细胞质膜相互作用。在tat肽的情况中，认为其亲水性质和电荷促进其插入质膜内并形成孔(herceandgarcia2007)。疏水肽(如sp)内的α螺旋基序也认为在质膜内形成孔(veach,liu等人,2004)。

在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可包含一个或多个cpd或一种或多种类型的cpd。更具体地，其可包含至少2、至少3、至少4或至少5或多个cpd。在一些实施方案中，穿梭剂可包含1-10个cpd、1-6个cpd、1-5个cpd、1-4个cpd、1-3个cpd等。

在一些实施方案中，cpd可以是具有seqidno:17的氨基酸序列的tat，或与seqidno:17具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性并具有细胞穿透活性的其变体；或具有seqidno:18的氨基酸序列的穿透素，或与seqidno:18具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性并具有细胞穿透活性的其变体。

在一些实施方案中，cpd可以是具有seqidno:65的氨基酸序列的ptd4，或与seqidno:65具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性的其变体。

在一些实施方案中，cpd相对本发明穿梭剂内其他结构域(eld、组氨酸富集结构域)的顺序或放置可变化，只要穿梭剂的穿梭能力保留。

在一些实施方案中，cpd可以是表b中所列那些的任一项并具有细胞穿透活性的变体或片段。在一些实施方案中，cpd可包含seqidno:16-27或65任一项的氨基酸序列，或与seqidno:16-27或65任一项至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％相同并具有细胞穿透活性的序列，或由其组成。

组氨酸富集结构域

一些方面，本发明的穿梭剂可包含组氨酸富集结构域。在其他实施方案中，本发明的穿梭剂可与另一种独立的合成肽组合/一起使用，所述另一种独立的合成肽包含组氨酸富集结构域和cpd(例如但缺乏eld)或基本上由其组成。后一种方式提供额外的优势是允许组氨酸富集结构域的浓度独立于穿梭剂中所含的eld和cpd的浓度有所变化或受控。不受理论所限，组氨酸富集结构域可作为内体中的质子海绵发挥作用，提供了另一种内体膜不稳定化的机制。

在一些实施方案中，组氨酸富集结构域可以是至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6个氨基酸的伸展，其包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的组氨酸残基。在一些实施方案中，组氨酸富集结构域可包含至少2、至少3、至少4至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续的组氨酸残基。不受理论所限，穿梭剂中的组氨酸富集结构域通过其咪唑基团的在内体酸性环境下的质子化作为质子海绵在内体中发挥作用，提供内体膜不稳定化的另一种机制且因此进一步促进内体捕获的负荷获得进入细胞质通路的能力。在一些实施方案中，组氨酸富集结构域可位于合成肽或穿梭剂的n或c末端。在一些实施方案中，组氨酸富集结构域可位于cpd和/或eld的n末端或c末端。

在一些实施方案中，组氨酸富集结构域相对本发明穿梭剂内其他结构域(cpd、eld)的顺序和放置可变化，只要穿梭剂的穿梭能力保留。在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可包含多于一个的组氨酸富集结构域(例如在氨基和羧基末端的组氨酸富集结构域)。

接头

在一些实施方案中，适当的接头(例如柔性多肽接头)可用于可操作地将结构域(cpd、eld或组氨酸富集结构域)与合成肽和本发明穿梭剂背景内的另一种连接。在一些实施方案中，接头可通过添加无旋转能力(如甘氨酸)和极性丝氨酸残基的赋予稳定性和柔性的小疏水氨基酸序列形成。接头可以是柔软的并允许穿梭剂的结构域移动。在一些实施方案中，可以避免脯氨酸，因为其可以增加显著的构象刚性。在一些实施方案中，接头可以是富含丝氨酸/甘氨酸的接头(例如ggs、ggsgggs、ggsgggsgggs等)。在一些实施方案中，使用包括适当接头的穿梭剂对于将独立的多肽负荷递送至悬浮细胞而非贴壁细胞是有利的。

负荷

一些方面，本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可用于将独立的负荷(例如多肽负荷)递送至靶真核细胞的细胞质。在一些实施方案中，多肽负荷可与一个或多个cpd融合以进一步促进细胞内递送。在一些实施方案中，与多肽负荷融合的cpd可以与本发明穿梭剂的cpd相同或不同。这样的融合蛋白可使用标准重组技术构建。在一些实施方案中，独立的多肽负荷可与第二生物活性负荷(例如生物活性多肽或化合物)融合、复合或共价结合。另外或同时，多肽负荷可包含亚细胞靶向结构域。

在一些实施方案中，多肽负荷必须递送至核为其实施其预期的生物效应。一个这样的实例是当负荷是旨在核递送的多肽时(例如转录因子)。在这方面，关于病毒dna的转位机制的研究已使得核定位信号(nls)得以鉴定。nls序列由蛋白(输入蛋白α和β)识别，其作为转运子和穿过核膜的转位调节子发挥作用。nls一般富有带电荷的氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸，赋予正电荷，所述正电荷部分上负责其被输入蛋白所识别。因此，在一些实施方案中，多肽负荷可包含促进核递送的nls，如表c中所列的一种或多种nls，或具有核靶向活性的其变体。

当然，应该理解的是，在一些实施方案中，多肽负荷可包含其天然的nls。

表c:核定位信号

一旦递送到细胞质，重组蛋白暴露于真核细胞的蛋白质运输系统。事实上，所有的蛋白质都是在细胞的细胞质中合成，然后通过由穿梭蛋白识别的基于小氨基酸序列的运输系统重新分配到其最终的亚细胞定位(karniely和pines2005,stojanovski,bohnert等人,2012)。除nls外，其他定位序列在细胞内递送本发明的多肽负荷后可介导对多种细胞器的亚细胞靶向。因此，在一些实施方案中，本发明的多肽负荷可包含用于促进穿梭剂和复合递送至特定细胞器的亚细胞定位信号，如一种或多种如表d中所列举的序列，或具有相应亚细胞靶向活性的其变体。

表d:亚细胞定位信号

在一些实施方案中，负荷可以是生物活性化合物，例如用于细胞内递送的生物活性(重组)多肽(例如转录因子，细胞因子或核酸酶)。如本文所用的表述“生物活性”指化合物在导入靶细胞时介导结构、调节和/或生化功能的能力。

在一些实施方案中，负荷可以是用于核递送的重组多肽，例如转录因子。在一些实施方案中，转录因子可以是hoxb4(lu,feng等人,2007)、nup98-hoxa9(takeda,goolsby等人,2006)、oct3/4、sox2、sox9、klf4、c-myc(takahashiandyamanaka2006)、myod(sung,mun等人,2013)、pdx1、ngn3和mafa(akinci,banga等人,2012)、blimp-1(lin,chou等人,2013)、eomes、t-bet(gordon,chaix等人,2012)、foxo3a(warr,binnewies等人,2013)、nf-ya(dolfini,minuzzo等人,2012)、sall4(aguila,liao等人,2011)、isl1(fonoudi,yeganeh等人,2013)、foxa1(tan,xie等人,2010)、nanog、esrrb、lin28(buganim等人,2014)、hif1-alpha(lord-dufour等人,2009)、hlf、runx1t1、pbx1、lmo2、zfp37、prdm5(riddell等人,2014)或bcl-6(ichii,sakamoto等人,2004)。

在一些实施方案中，负荷可以是用于核递送的重组多肽，例如用于基因组编辑技术的核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶可以是rna导向的核酸内切酶、crispr核酸内切酶、i型crispr核酸内切酶、ii型crispr核酸内切酶、iii型crispr核酸内切酶、iv型crispr核酸内切酶、v型crispr核酸内切酶、vi型crispr核酸内切酶、crispr结合蛋白9(cas9)、cpf1(zetsche等人,2015)、锌指核酸酶(zfn)、转录激活剂样效应核酸酶(talen)(cox等人,2015)、导归核酸内切酶、大范围核酸酶或其任意组合。这里没有明确提及的其他核酸酶可能仍然涵盖在本发明中。在一些实施方案中，核酸酶可以与核定位信号融合(例如cas9-nls；cpf1-nls；zfn-nls；talen-nls)。在一些实施方案中，核酸酶可以与核酸复合(例一种或多种导向rnas、crrna、tracrrnas或crrna和tracrrna二者)。在一些实施方案中，核酸酶可能具有dna或rna结合活性，但可能缺乏切割dna的能力。

在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可用于一种或多种crispr核酸内切酶的细胞内递送(例如核递送)，例如下文所述的一种或多种crispr核酸内切酶。

i型及其亚型a、b、c、d、e、f和i，包括它们各自的cas1、cas2、cas3、cas4、cas6、cas7和cas8蛋白，和这些cas蛋白的标志同系物和亚基包括大肠杆菌中的cse1、cse2、cas7、cas5和cas6e亚基(i-e型)和铜绿假单胞菌中的csy1、csy2、csy3和cas6f(i-f型)(wiedenheft等人,2011；makarovaetal,2011)。ii型及其亚型a、b、c，包括它们各自的cas1、cas2和cas9蛋白，和这些cas蛋白的标志同系物和亚基包括csn复合物(makarovaetal,2011)。iii型及其亚型a、b和mth326样模块，包括它们各自的cas1、cas2、cas6和cas10蛋白，和这些cas蛋白的标志同系物和亚基包括csm和cmr复合物(makarovaetal,2011)。v型代表cas蛋白的csf3家族。这个家族的成员在嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillusferrooxidans)atcc23270、固氮弓菌属(azoarcussp.)(ebn1株)和铁还原红育菌(rhodoferaxferrireducens)(dsm15236/atccbaa-621/t118株)中显现接近的crispr重复。在后两种物种中，在质粒上发现crispr/cas基因座。v型及其亚型最近才被发现，包括cpf1、c2c1和c2c3。vi型包括酶c2c2，报道其与已知序列几乎没有同源性。

在一些实施方案中，本发明的穿梭剂可与一种或多种上文所述的核酸酶、核酸内切酶、rna导向核酸内切酶、crispr核酸内切酶联用用于多种应用，如本文所述的那些。crispr系统与其各自的核酸相互作用，如dna结合、rna结合、解旋酶和核酸酶基序(makarovaetal,2011；barrangou&marraffini,2014)。crispr系统可用于不同的基因组编辑应用，包括:

·进行非同源末端连接(nhej)和/或同源定向重组(hdr)的cas介导的基因组编辑方法(congetal,2013)；

·当与启动子序列、一个或多个grna和rna聚合酶结合时(具有或不具有与其他蛋白质伴侣形成的复合物)催化死亡的cas(dcas)，可抑制和/或激活转录起始(bikardetal,2013)；

·还可以与不同功能蛋白结构域结合的催化死亡的cas(dcas)，作为在基因组特定位点带来酶活性的方法，包括转录抑制、转录激活、染色质重构、荧光报告子、组蛋白修饰、重组酶系统乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、sumo化、核糖基化和瓜氨酸化(gilbertetal,2013)。

本领域的普通技术人员将理解，本发明的穿梭剂虽然在本实施例中以cas9举例说明，但可以与本文所述的其它核酸酶一起使用。因此，本说明书涵盖核酸酶例如cpf1、cas9以及这些核酸酶或其它的变体。应该理解的是，一方面，本说明书可以广泛地涵盖具有核酸酶活性的任何负荷，例如rna导向的核酸内切酶或其变体(例如可以与dna或rna结合，但是已经失去核酸酶活性的那些；或者与转录因子融合的那些)。

在一些实施方案中，多肽负荷可以是细胞因子如趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，多肽负荷可以是激素或生长因子。在一些实施方案中，负荷可以是抗体(例如标记的抗体)。在一些实施方案中，负荷可以是用于细胞内递送(例如出于研究和/或诊断目的)的可检测的标记物(荧光多肽或报告酶)。

在一些实施方案中，负荷可以是球状蛋白质或纤维蛋白质。在一些实施方案中，负荷可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50至约150、200、250、300、350、400、450、500或更多kda中的任一个的分子量。在一些实施方案中，负荷可以具有约20至200kda之间的分子量。

非毒性、可代谢的合成肽和穿梭剂

在一些实施方案中，合成肽和本发明的穿梭剂在直至50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、0.5μm、0.1μm或0.05μm的浓度对预期的靶真核细胞可以是非毒性的。本发明的穿梭剂的细胞毒性可使用任何适当的方法测量。此外，可改变转导方案(例如使用的穿梭剂和/或负荷的浓度、穿梭剂/负荷暴露次数、暴露时血清存在或不存在)以减少或最小化穿梭机的毒性和/或改进/最大化转染效率。

在一些实施方案中，合成肽和本发明的穿梭剂可由预期的靶真核细胞容易地代谢。例如，合成肽和穿梭剂可完全或基本上由靶真核细胞对其具有代谢/降解的细胞机制的肽或多肽组成。实际上，本发明的合成肽和基于多肽的穿梭剂的细胞内半衰期预期远低于外来有机化合物例如荧光团的半衰期。然而，荧光团可能是有毒的且必须在临床上安全使用之前进行研究(alford等人,2009)。在一些实施方案中，合成肽和本发明的穿梭剂可适用于临床使用。在一些实施方案中，合成肽和本发明的穿梭剂可避免使用其毒性不确定或已被排除的结构域或化合物。

鸡尾酒

在一些实施方案中，本发明涉及包含至少2个、至少3个、至少4个、或至少5个不同类型的如本文所定义的合成肽或基于多肽的穿梭剂的鸡尾酒的组合物。在一些实施方案中，结合不同类型的合成肽或基于多肽的穿梭剂(例如包含不同类型的cpd的不同穿梭剂)可以为不同多肽负荷的细胞内递送提供增加的通用性。此外，不受理论所限，组合较低浓度的不同类型的穿梭剂可以帮助减少与使用单一类型的穿梭剂有关的细胞毒性(例如在较高浓度)。

方法、试剂盒、用途和细胞

在一些实施方案中，本发明涉及用于增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质的转导效率的方法。该方法可以包括将靶真核细胞与本文定义的合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物以及多肽负荷接触。在一些实施方案中，在将靶真核细胞暴露于该混合物之前，合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物可以与多肽负荷预温育以形成混合物。在一些实施方案中，cpd的类型可以根据待细胞内递送的多肽负荷的氨基酸序列来选择。在其他实施方案中，可以选择cpd和eld的类型以考虑待细胞内递送的多肽负荷的氨基酸序列、细胞类型、组织类型等。

在一些实施方案中，该方法可以包括用合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物对靶细胞进行多次处理(例如每天1、2、3、4或更多次，和/或按照预定的时间表)。在这种情况下，较低浓度的合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物可能是可取的(例如为减少细胞毒性)。在一些实施方案中，细胞可以是悬浮细胞或贴壁细胞。在一些实施方案中，本领域的技术人员能够使用不同的穿梭剂、结构域、用途和方法的组合改变本发明的教导来满足以预期活力递送多肽负荷至特定细胞的需求。

在一些实施方案中，本发明的方法可适用于在体内将多肽负荷细胞内递送至细胞的方法。这些方法可以通过肠胃外施用或直接注射入组织、器官或系统来完成。

在一些实施方案中，合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物以及多肽负荷可以在存在或不存在血清的情况下暴露于靶细胞。在一些实施方案中，该方法可适用于临床或治疗用途。

在一些实施方案中，本发明涉及用于增加多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的试剂盒。试剂盒可以包含本文所定义的合成肽、基于多肽的穿梭剂或组合物以及适当的容器。

在一些实施方案中，靶真核细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人类细胞。在一些实施方案中，靶真核细胞可以是干细胞(例如胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、外周血干细胞)、原代细胞(例如成肌细胞、成纤维细胞)或免疫细胞(例如t细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞)。在一些实施方案中，本发明涉及包含如本文所定义的合成肽或基于多肽的穿梭剂的分离的细胞。在一些实施方案中，细胞可以是蛋白质诱导的多能干细胞。应该理解的是，对于本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂，通常具有抗性或不适于蛋白质转导的细胞可能是令人感兴趣的候选者。

本发明的其他目的、优点和特征将通过阅读以下其具体实施方案的非限制性说明而变得更加明显，所述实施方案仅参照附图通过实施例的方式给出。

实施例

实施例1:

材料和方法

1.1材料

除非另外表明，全部化学品都购自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa或oakville,on,canada)或为购自自bioshopcanadainc.(mississauga,on,canada)或vwr(villemont-royal,qc,canada)的等同级别。

1.2试剂

表1.1:试剂

1.3细胞系

从americantypeculturecollection(manassas,va,usa)获得hela、hek293a、hek293t、thp-1、cho、nih3t3、ca46、balb3t3和ht2细胞并依照制造商的指导培养。成肌细胞是由j.p.tremblay教授(universitélaval,quebec,canada)馈赠的原代人细胞。

表1.2:细胞系和培养条件

fbs:胎牛血清

1.4蛋白纯化

在标准条件下使用含有t5启动子的异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导型载体在细菌(大肠杆菌bl21de3)中表达融合蛋白。培养基每升含有24克酵母提取物、12g胰蛋白胨、4毫升甘油、2.3gkh2po4和12.5gk2hpo4。细菌培养液在37℃搅拌下与适当的抗生素(例如氨苄青霉素)温育。在光密度(600nm)0.5和0.6之间以1mmiptg终浓度在30℃诱导表达3小时。在5000rpm离心后回收细菌，并将细菌沉淀储存在-20℃。

将细菌沉淀重悬于含有1mm苯基甲基磺酰氟(pmsf)的tris缓冲液(tris25mmph7.5，nacl100mm，咪唑5mm)中，并在1000bar通过匀浆器panda2k^tm3次切割。将溶液以15000rpm，4℃离心30分钟。收集上清液并用0.22μm过滤装置过滤。

使用fplc(aktaexplorer100r)，在预先用5倍柱体积(cv)的tris缓冲液平衡的histrap^tmff柱上装载溶解的蛋白质。用30柱体积(cv)的补充有0.1％triton^tmx-114的tris缓冲液，接着用30cv的具有咪唑40mm的tris缓冲液洗涤管柱。用5cv具有350mm咪唑的tris缓冲液洗脱并收集蛋白。通过标准变性sds-page确定对应于特定蛋白质的收集级分。根据蛋白质的pi将纯化的蛋白质在所需ph下在tris20mm中稀释，并装载到预先用5cv的tris20mm，nacl30mm平衡的合适的离子交换柱(qsepharose^tm或spsepharose^tm)上。用10cv的20mmtris，30mmnacl洗涤柱，用nacl梯度洗脱蛋白质直到15cv上的1m。通过标准变性sds-page确定对应于特定蛋白质的收集级分。然后洗涤纯化的蛋白质并在amiconultra^tm离心过滤器10,000mwco上于pbs1x中浓缩。使用标准bradford测定评估蛋白质浓度。

1.5合成肽和穿梭剂

本研究中使用的所有肽均购自glbiochem(中国上海)，其纯度通过高效液相色谱分析和质谱确认。在一些情况下，合成嵌合肽以含有c-末端半胱氨酸残基以允许制备肽二聚体。这些二聚体肽直接以两个单体的c-末端半胱氨酸之间的二硫键合成。在本实施例中测试的合成肽和穿梭剂中每一种的氨基酸序列和特征总结于表1.3。

表1.3:测试的合成肽和穿梭剂

使用expasy^tmbioinformaticsresourceportal提供的protparam^tm在线工具计算结果(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)

mw:分子量

pi:等电点

电荷:带正(+)和负(-)电荷残基的总数

实施例2:

肽穿梭剂促进内吞捕获的钙黄绿素的逃逸

2.1内体逃逸测定

开发了基于显微镜和基于流式细胞术的荧光测定法来研究内体泄漏，并确定穿梭剂的添加是否促进多肽负荷的内体泄漏。

2.1.1通过显微镜观察内体泄漏

钙黄绿素是一种不透膜的荧光分子，在施用至细胞外介质中时可由细胞容易地内化。其荧光是ph依赖性的且钙黄绿素在较高浓度下自我淬灭。一旦被内化，钙黄绿素在细胞内体中以高浓度封存，并且可以通过荧光显微镜作为点状模式来观察。继内体泄漏，钙黄绿素释放到细胞质，这释放可以通过荧光显微镜以弥散模式观察。

在进行钙黄绿素测定前一天，收集处于指数生长期的哺乳动物细胞(例如hela、hek293a或成肌细胞)并铺在24孔板(每孔80,000个细胞)中。如实施例1所述，通过在适当的生长培养基中温育过夜，使细胞附着。第二天，除了hek293a(250μg/ml，400μm)之外，移除培养基并用300μl无fbs但包含62.5μg/ml(100μm)钙黄绿素的新鲜培养基替换。同时，将待测试的穿梭剂以预定的浓度添加。平板在37℃温育30分钟。细胞用1×pbs(37℃)洗涤并添加含有fbs的新鲜培养基。在37℃温育该平板2.5小时。将细胞洗涤三次，并通过相差显微镜和荧光显微镜观察(ix81^tm,olympus)。

图1a显示了一个典型的结果，其中装载有钙黄绿素(“100μm钙黄绿素”)的未处理的hek293a细胞通过荧光显微镜观察时显示低强度点状荧光模式(左上图)。相反，用促进钙黄绿素(“100μm钙黄绿素+cm18-tat5μm”)的内体逃逸的穿梭剂处理的hela细胞在更大比例的细胞中显示出更高强度、更多弥散的荧光模式(右上图)。

2.1.2通过流式细胞术定量内体渗漏

除显微镜，一旦钙黄绿素释放到细胞质中，流式细胞术允许随着荧光强度信号增加对内体泄漏进行更加定量的分析。与内体酸性环境相比，钙黄绿素荧光在生理ph值是最佳的(例如细胞质中)。

在进行钙黄绿素测定前一天，收集处于指数生长期的哺乳动物细胞(例如hela、hek293或成肌细胞)并铺在96孔板(每孔20,000个细胞)中。如实施例1所述，通过在适当的生长培养基中温育过夜，使细胞附着。第二天，除了hek293a(250μg/ml，400μm)外，移除孔中的培养基并用50μl无血清但含有62.5μg/ml(100μm)钙黄绿素的新鲜培养基替换。同时，将要测试的穿梭剂以预定的浓度添加。板在37℃温育30分钟。细胞用1×pbs(37℃)洗涤并添加含有5-10％血清的新鲜培养基。在37℃温育该平板2.5小时。细胞用1×pbs洗涤并用胰蛋白酶消化分离。通过添加适当的生长培养基终止胰蛋白酶消化，使用流式细胞术定量钙黄绿素荧光(accuric6,becton,dickinsonandcompany(bd))。

使用未处理的钙黄绿素装载的细胞作为对照以将由于内体捕获的钙黄绿素而具有基线荧光的细胞与由于钙黄绿素从内体释放而具有增加的荧光的细胞。分析荧光信号平均值(“平均计数”)用于定量内体逃逸。在一些情况下，计算“平均因子”，其对应于平均计数相对于对照(未处理的钙黄绿素装载的细胞)的倍增。另外，分析与细胞(大小和粒度)相对应的流式细胞术扫描的事件。在扫描的总事件中用细胞百分比监测细胞死亡率。当其变得低于对照时，认为细胞碎片的数量由于毒性而增加，并放弃该测定。图1b显示了一个典型的结果，其中与未处理的钙黄绿素装载的hela细胞(“钙黄绿素100μm”，左图)相比较，对于用促进内体逃逸的穿梭剂处理的钙黄绿素装载的hela细胞观察到荧光强度的增加(右移)(“钙黄绿素100μm+cm18-tat5μm”，右图)。钙黄绿素荧光的增加是由钙黄绿素从内体(酸性)释放到细胞质(生理)相关的ph的增加引起的。

2.2内体逃逸测定的结果

2.2.1hela细胞

培养hela细胞并在内体逃逸测定中如实施例2.1所述测试。流式细胞术分析的结果总结如下。在每种情况下，流式细胞术结果也通过荧光显微镜确认(数据未显示)。

表2.1:hela细胞中cm18-穿膜肽-cys比对照

表2.2:hela细胞中cm18-tat-cys比对照

表2.1和表2.2中的结果表明，相比以仅单独使用的单结构域肽(cm18、tat-cys、穿膜肽-cys)或一起使用的单结构域肽(cm18+tat-cys、cm18+穿膜肽-cys)的未处理的对照，用穿梭剂cm18-穿膜肽-cys和cm18-tat-cys(具有结构域结构eld-cpd)处理钙黄绿素装载的hela细胞导致平均细胞钙黄绿素荧光强度的增加。这些结果表明，cm18-穿膜肽-cys和cm18-tat-cys促进了内体捕获的钙黄绿素的逃逸，但单结构域肽(单独或一起使用)不能。

表2.3:hela细胞中cm18-tat-cys的剂量响应，数据来自图2

表2.4:hela细胞中cm18-tat-cys的剂量响应

表2.5:hela细胞中cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys的剂量响应，数据来自图3

表2.3(图2)，2.4和2.5(图3)中的结果表明cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys以剂量依赖性的方式促进hela细胞中的内体捕获的钙黄绿素的逃逸。在一些情况下，高于10μm的cm18-tat-cys或cm18-穿膜肽-cys的浓度与hela细胞中细胞毒性的增加相关。

表2.6:hela细胞中cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys的二聚体比单体

表2.7:hela细胞中cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys的单体比二聚体

表2.6和2.7中的结果表明，穿梭肽二聚体(其为包含多于一种eld和cpd的分子)能够促进与相应单体相当的钙黄绿素内体逃逸水平。

2.2.3hek293a细胞

为了检查穿梭剂对不同细胞系的影响，如实施例2.1所述，培养hek293a细胞并在内体逃逸测定中进行测试。流式细胞分析的结果总结如下表2.8和图1b。

表2.8:hek293a细胞中的cm18-tat-cys

表2.8和图1b的结果表明，与未处理的对照细胞相比，用穿梭剂cm18-tat-cys处理钙黄绿素装载的hek293a细胞导致平均细胞钙黄绿素荧光强度增加。

2.2.2成肌细胞

为了检测穿梭剂对原代细胞的影响，在实施例2.1中描述了原代成肌细胞在内体逃逸实验中的培养和测试。流式细胞术分析的结果总结如下表2.9和2.10以及图4。在每种情况下，流式细胞术结果也通过荧光显微镜确认。

表2.9:原代成肌细胞中cm18-tat-cys的剂量响应，数据来自图4

表2.10:原代成肌细胞中cm18-tat-cys的剂量响应

表2.9(图4中显示)和表2.10中的结果表明，cm18-tat-cys在原代成肌细胞中以剂量依赖性的方式促进了内体捕获的钙黄绿素的逃逸。高于10μm的cm18-tat-cys浓度与成肌细胞中细胞毒性的增加相关，如对于hela细胞。

表2.11:原代成肌细胞中cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys的单体比二聚体

表2.11中的结果表明穿梭肽二聚体能够促进钙黄绿素内体逃逸水平，其与原代成肌细胞中的相应单体相当。

实施例3:

肽穿梭剂增加gfp转导效率

3.1蛋白质转导测定

在进行转导测定的前一天，收获处于指数生长期的哺乳动物细胞(例如hek293、cho、hela、thp-1和成肌细胞)并铺板于96孔板(每孔20,000个细胞)中。将细胞在含有fbs的适当生长培养基中温育过夜(参见实施例1)。第二天，在分开的无菌1.5ml管中，将0.5-10μm的负荷蛋白(gfp、tat-gfp、gfp-nls或fitc标记的抗微管蛋白抗体)与穿梭剂(0.5至5μm)在50μl不含血清的新鲜培养基中(除非另有说明)在37℃预混合(预温育)10分钟。gfp、gfp-nls和tat-gfp是由feldan开发和生产的重组蛋白(参见下面的实施例3.4)。fitc标记的抗微管蛋白抗体购自abcam(ab64503)。移除孔中的培养基，用预先在37℃加热的新鲜制备的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞三次。将细胞与负荷蛋白/穿梭剂混合物在37℃温育5或60分钟。温育后，将细胞用预先在37℃加热的新鲜制备的pbs和/或肝素(0.5mg/ml)迅速洗涤三次。在随后的分析(显微镜和流式细胞术)中，人thp-1血细胞需要以肝素洗涤以避免不需要的细胞膜结合蛋白背景。在分析之前，在37℃将细胞最终温育在50μl具有血清的新鲜培养基中。

3.2荧光显微镜分析

使用装有荧光灯(型号u-lh100hgapo)和不同过滤器的olympusix70^tm显微镜(日本)观察细胞质和核细胞区室内荧光蛋白负荷的递送。使用olympus过滤器u-mf2^tm(c54942-exc495/em510)观察gfp和fitc标记的抗体荧光信号。使用olympus过滤器hq-tr^tm(v-n41004-exc555-60/em645-75)观察mcherry^tm和gfp抗体荧光信号。olympus过滤器u-mwu2^tm(exc330/em385)用于观察dapi或bluehoechst荧光信号。通过显微镜(明场和荧光)在不同的功率场(4x到40x)直接观察在50μl新鲜培养基中温育的细胞。使用coolsnap-pro^tm相机(系列a02d874021)观察细胞，使用image-proplus^tm软件获取图像。

3.2a细胞免疫标记

在24孔板中将贴壁细胞铺在无菌玻璃带上，每孔1.5×105个细胞，37℃温育过夜。为了固定，将细胞在室温下以500μl/孔的甲醛(3.7％v/v)温育15分钟，并用pbs洗涤3次5分钟。为了透化，将细胞在室温下以500μl/孔的triton^tmx-100(0.2％)温育10分钟，并用pbs洗涤3次5分钟。为了阻断，将细胞在室温下以每孔500μl含有1％bsa(pbs/bsa)的pbs温育60分钟。用pbs/bsa(1％)稀释原代小鼠单克隆抗体。于4℃在30μl一抗中过夜温育细胞。用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟。在pbs/bsa(1％)中稀释二抗。将细胞在250μl二抗中在室温避光温育30分钟。用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟。将含有细胞的玻璃条安装在带有10μl具有dapi的固定培养基fluoroshield^tm的显微镜载玻片上。

3.3流式细胞术分析：

使用流式细胞术(accuric6,becton,dickinsonandcompany(bd))定量gfp的荧光。使用未处理的细胞建立基线以定量由于处理的细胞中的荧光蛋白的内化而增加的荧光。具有高于未处理细胞最大荧光的荧光信号的细胞百分比，“平均％”或“阳性细胞(％)”用于鉴定阳性荧光细胞。“相对荧光强度

(fl1-a)”对应于用穿梭剂递送荧光蛋白后来自具有荧光信号的每个细胞的所有荧光强度的平均值。另外，分析与细胞(大小和粒度)相对应的流式细胞术扫描的事件。监测细胞毒性(％细胞活力)，比较处理的细胞相对于未处理的细胞扫描的总事件中细胞的百分比。

3.3a活力分析

用rezazurine测试评估细胞的活力。rezazurine是一种钠盐着色剂，通过代谢活性细胞中的线粒体酶由蓝色转变为粉色。这种仅在活细胞中发生的比色转换可以通过光谱分析来测量，以量化活细胞的百分比。以1mg/100ml在水中制备rezazurine储液并在4℃保存。在96孔板的各孔中加入25μl的储液，在光谱分析前将细胞在37℃下温育1小时。用于rezazurine酶促反应的温育时间取决于细胞的数量和孔中使用的培养基的体积。

3.4gfp的构建及氨基酸序列

将编码gfp的基因克隆到t5细菌表达载体中，以表达在n末端含有6x组氨酸标签和富含丝氨酸/甘氨酸的接头和在c末端含有富含丝氨酸/甘氨酸的接头和终止密码子(-)的gfp蛋白。如实施例1.4所述纯化重组gfp蛋白。gfp构建体的序列是：

(mw＝31.46kda；pi＝6.19)

富含丝氨酸/甘氨酸的接头用黑体标出

gfp序列加下划线

3.5hela细胞通过cm18-tat-cys转导gfp:荧光显微镜

hela细胞如实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将gfp重组蛋白与0、3或5μm的cm18-tat共温育，然后暴露于hela细胞1小时。如实施例3.2所述，通过明场和荧光显微镜观察细胞。图5中给出的结果显示gfp在穿梭剂cm18-tat的存在下细胞内递送至hela细胞。

3.6hela细胞中通过穿梭剂的gfp转导：剂量响应(cm18-tat-cys、dcm18-tat-cys、gfp)和细胞活力剂量响应

hela细胞在实施例3.1-3.3中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将gfp重组蛋白与不同浓度的cm18-tat-cys或二聚化的cm18-tat-cys(dcm18-tat-cys)共温育，然后暴露于hela细胞1小时。结果如表3.1和图6所示。

表3.1:剂量响应(cm18-tat)和细胞活力，数据来自图6a和6b

表3.1和图6a显示了用gfp(5μm)转导的hela细胞的荧光强度的流式细胞术分析的结果，所述gfp(5μm)具有或不具有5、3、1和0.5μm的cm18-tat-cys。相应的细胞毒性数据见表3.1和图6b。这些结果表明穿梭剂cm18-tat-cys以剂量依赖性方式增加gfp的转导效率。

表3.2:剂量响应(gfp)，数据来自图7a和7b

表3.2和图7显示了用不同浓度的gfp(1-10μm)转导的hela细胞的荧光强度的流式细胞术分析结果，所述gfp(1-10μm)具有或不具有5μm的cm18-tat-cys(图7a)或2.5μm的dcm18-tat-cys(图7b)。

3.7hela细胞中gfp的转导：cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys及其二聚体的剂量响应

hela细胞如实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将gfp重组蛋白(5μm)与不同浓度的cm18-tat-cys、cm18-穿膜肽-cys和各自的二聚体(dcm18-tat-cys、dcm18-穿膜肽-cys)共温育，然后暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果显示在表3.3和图8以及表3.4和图9中。

表3.3:图8中的数据

表3.3和图8的结果表明，使用穿梭剂cm18-tat-cys和dcm18-tat-cys，在hela细胞中gfp的转导效率增加(参见图8中的柱状图“1”和“2”)。尽管单独使用cm18-穿膜肽-cys或dcm18-穿膜肽-cys观察不到gfp细胞内递送(参见图8中的柱状图“3”或“4”)，但cm18-tat-cys与cm18-穿膜肽-cys(单体或二聚体)的组合改进了gfp蛋白的递送(参见图8中四个最右侧的柱状图)。

表3.4:图9中的数据

表3.4和图9的结果表明，使用穿梭剂cm18-tat-cys和dcm18-tat-cys，在hela细胞中gfp的转导效率增加(参见图9中的柱状图“1”和“2”)。尽管单独使用cm18-穿膜肽-cys或dcm18-穿膜肽-cys观察不到gfp细胞内递送(参见图9中的柱状图“3”或“4”)，但cm18-tat-cys与cm18-穿膜肽-cys(单体或二聚体)的组合改进了gfp蛋白的递送(参见图9中四个最右侧的柱状图)。

3.8在hela细胞中通过穿梭剂的gfp转导：对照

hela细胞如实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简而言之，将gfp重组蛋白(5μm)与5μm各种下列肽共温育：tat-cys；cm18；穿膜肽-cys；tat-cys+cm18；穿膜肽-cys+cm18和cm18-tat-cys，然后暴露于hela细胞1小时。通过明场和荧光显微镜观察gfp荧光。显微镜检查结果(数据未显示)显示使用cm18-tat-cys在细胞内成功地递送gfp。然而，使用单独使用单结构域肽(cm18、tat-cys、穿膜肽-cys)或一起使用(cm18+tat-cys、cm18+穿膜肽-cys)，gfp不能成功地在细胞内递送。这些结果与表2.1和2.2中关于钙黄绿素内体逃逸测定法所提供的结果一致。

实施例4:肽穿梭剂增加tat-gfp转导效率

实施例3中的实验显示穿梭剂在细胞内递送gfp的能力。本实施例提供的实验表明穿梭剂还可以增加与cpd融合的gfp负荷蛋白(tat-gfp)的细胞内递送。

4.1tat-gfp的构建和氨基酸序列

除了在6x组氨酸标签和gfp序列之间克隆tat序列外，如实施例3.4所述进行构建。6x组氨酸标签、tat、gfp和终止密码子(-)由富含丝氨酸/甘氨酸的接头分开。如实施例1.4所述纯化重组tat-gfp蛋白。tat-gfp构建体的序列是：

(mw＝34.06kda；pi＝8.36)

tat序列加下划线

富含丝氨酸/甘氨酸的接头用黑体标出

4.2在hela细胞中通过cm18-tat-cys转导tat-gfp：通过荧光显微镜观察

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将tat-gfp重组蛋白(5μm)与3μm的cm18-tat-cys共温育，然后暴露于hela细胞1小时，在10xand40x的放大倍数通过明场和荧光显微镜观察到细胞和gfp荧光(如实施例3.2所述)，样品结果如图10所示。显微镜结果显示，在cm18-tat-cys不存在的情况下，tat-gfp显示如文献中报道的低强度内体分布。相反，tat-gfp在穿梭剂cm18-tat-cys的存在下被递送至细胞质和细胞核。不受理论所限，tat肽本身可以作为核定位信号(nls)，解释tat-gfp的核定位。这些结果表明，cm18-tat-cys能够增加tat-gfp的转导效率，并允许内体捕获的tat-gfp获得进入细胞质和细胞核区室的通路。

4.3在hela细胞中通过cm18-tat-cys的tat-gfp转导：转导的细胞的剂量响应和活力

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将tat-gfp-cys重组蛋白(5μm)与不同浓度的cm18-tat-cys(0、0.5、1、3或5μm)共温育，然后暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果如表4.3和图11a所示。图11b给出了相应的细胞毒性数据。

表4.3:来自图11a和11b的数据

¹如荧光显微镜证实，荧光主要是内体的。

²如荧光显微镜证实，荧光更弥散并且也是核的。

实施例5:肽穿梭剂增加gfp-nls转导效率和核定位

实施例3和4中的实验显示穿梭剂在细胞内递送gfp和tat-gfp的能力。本实施例提供的实验表明，穿梭剂可以促进与核定位信号(nls)融合的gfp蛋白负荷的核递送。

5.1gfp-nls的构建和氨基酸序列

除了将优化的nls序列克隆在gfp序列和终止密码子(-)之间之外，如实施例3.4中所述进行构建。nls序列与gfp序列和终止密码子通过两个富含丝氨酸/甘氨酸的接头分开。如实施例1.4所述纯化重组gfp-nls蛋白质。gfp-nls构建体的序列是：

(mw＝34.85kda；pi＝6.46)

nls序列加下划线

富含丝氨酸/甘氨酸的接头用黑体标出

5.25分钟内在hela细胞中通过cm18-tat-cys核递送gfp-nls：通过荧光显微镜观察

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm)与5μm的cm18-tat-cys共温育，然后暴露于hela细胞。5分钟后，在10x、20x和40x的放大倍数，通过明视场和荧光显微镜观察gfp荧光(如实施例3.2所述)，样品结果示于图12。显微镜结果显示gfp-nls在穿梭剂cm18-tat-cys存在下仅在温育5分钟后被有效递送至细胞核。

5.3在hela细胞中通过cm18-tat-cys的gfp-nls转导：转染的细胞的剂量响应和活力

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。将gfp-nls重组蛋白(5μm)与0、0.5、1、3或5μm的cm18-tat-cys共温育，然后暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果见表5.1和图13a。相应的细胞毒性数据见图13b。

表5.1:来自图13a和13b的数据

这些结果表明cm18-tat-cys能够以剂量依赖性的方式增加hela细胞中的gfp-nls转导效率。

5.4通过cm18-tat-cys、cm18-穿膜肽-cys及其二聚体在hela细胞中的gfp-nls转导

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。将gfp-nls重组蛋白(5μm)与不同浓度的cm18-tat-cys、cm18-穿膜肽-cys和各自的二聚体(dcm18-tat-cys、dcm18-穿膜肽-cys)共温育，然后暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果显示在表5.2和5.3以及图14和15中。

表5.2:图14中的数据

表5.3:图15中的数据

表5.2和5.3以及图14和15中的结果显示使用穿梭剂cm18-tat-cys和dcm18-tat-cys在hela细胞中增加gfp-nls的转导效率(参见图14和15中的柱状图“1”和“2”)。尽管单独使用cm18-穿膜肽-cys或dcm18-穿膜肽-cys未观察到gfp-nls的细胞内递送(参见图14和15中的柱状图“3”和“4”)，但是cm18-tat-cys与cm18-穿膜肽-cys(单体或二聚体)的组合改进了gfp-nls的细胞内递送(参见图14和15中的四个最右侧的柱状图)。

5.5在hela细胞中通过穿梭剂的gfp-nls转导：温育5分钟比1小时；有或没有fbs

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。将gfp-nls重组蛋白(5μm)与单独的cm18-tat-cys(3.5μm)或与dcm18-穿膜肽-cys(1μm)共温育。在进行实施例3.3中所述的流式细胞术分析之前，将细胞在纯dmem培养基(“dmem”)或含有10％fbs(“fbs”)的dmem中温育5分钟或1小时。结果显示在表5.4和图16中。未用穿梭剂或gfp-nls(“对照”)处理的细胞和用gfp-nls处理而无穿梭剂处理的细胞(“gfp-nls5μm”)用作对照。

表5.4:图16中的数据

表5.4和图16中的结果表明，即使向cm18-tat-cys单体添加相对低量的二聚体dcm18-穿膜肽-cys(1μm；“dcm18pen”)，也改善了gfp-nls转导效率。有趣的是，细胞内gfp-nls递送在少至5分钟的温育中实现，并且在fbs存在下递送仍然可实现(尽管减少)。

5.6通过穿梭剂在thp-1悬浮细胞中的gfp-nls转导

在thp-1细胞中测试穿梭剂在细胞内递送gfp-nls的能力，thp-1细胞是悬浮生长的急性单核细胞白血病细胞系。培养thp-1细胞(参见实施例1)，并在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中进行测试。将gfp-nls重组蛋白(5μm)与或不与1μmcm18-tat-cys共温育，并暴露于thp-1细胞5分钟，然后进行如实施例3.3所述流式细胞术分析。结果示于表5.5和图17a。相应的细胞毒性数据见图17b。

表5.5:图17a和17b中的数据

表5.5和图17中的结果表明穿梭剂将蛋白负荷细胞内递送到悬浮生长的人单核细胞系中的能力。

实施例6:肽穿梭剂增加了fitc标记的抗微管蛋白抗体的转导效率

实施例3-5中的实验显示穿梭剂提高gfp、tat-gfp和gfp-nls的转导效率的能力。本实施例提供的实验表明穿梭剂还可以递送更大的蛋白质负荷：fitc标记的抗微管蛋白抗体。fitc标记的抗微管蛋白抗体购自(abcam，ab64503)，估计分子量为150kda。实施例3中描述了递送和显微镜方案。

6.1在hela细胞中通过cm18-tat-cys转导功能性抗体：显微镜观察

将fitc标记的抗微管蛋白抗体(0.5μm)与5μm的cm18-tat-cys共温育并暴露于hela细胞1小时。通过明场(20x)和荧光显微镜(20x和40x)观察抗体递送。如图18所示，可见细胞质中的荧光微管蛋白纤维，证明了细胞内抗体的功能性。

6.2在hela中通过cm18-tat-cys、cm18-穿膜肽-cys和二聚体转导功能性抗体：流式细胞术

hela细胞在实施例3.1中所述的蛋白质转导测定中培养和测试。将fitc标记的抗微管蛋白抗体(0.5μm)与3.5μm的cm18-tat-cys、cm18-穿膜肽-cys或dcm18-穿膜肽-cys或3.5μm的cm18-tat-cys和0.5μ的dcm18-穿膜肽-cys的组合共温育，并暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果如表6.1和图19a所示。相应的细胞毒性数据见图19b。

表6.1:来自图19a和19b中的数据

表6.1和图18和19中的结果显示，cm18-tat-cys和cm18-穿膜肽-cys促进fitc标记的抗微管蛋白抗体的细胞内递送。与实施例3-5中的gfp、tat-gfp和gfp-nls的结果相比，cm18-穿膜肽-cys在单独使用时(无cm18-tat-cys)能够细胞内递送负荷。然而，与单独使用cm18-tat-cys相比，cm18-tat-cys和dcm18-穿膜肽-cys的组合允许更高的细胞内递送，并且与cm18-穿膜肽-cys和dcm18-穿膜肽-cys相比具有较少的细胞毒性(参见图19a和19b)。

实施例7:cm18-tat-cys允许细胞内质粒dna递送，但质粒表达差

本实施例中在hek293a细胞上使用编码gfp的质粒测试了cm18-tat-cys穿梭剂细胞内递送质粒dna的能力。

7.1hek293a细胞中的转染测定

在进行转染测定前一天，收获处于指数生长期的哺乳动物细胞(hek293a)并接种于24孔板(每孔50,000个细胞)中。将细胞在含有fbs的适当生长培养基中温育过夜。第二天，在分开的无菌1.5ml管中，将用cy5^tm荧光染料标记的pegfp与cm18-tat-cys(0.05、0.5或5μm)在新鲜pbs中在37℃以最终100μl体积混合10分钟。移除孔中的培养基，用pbs迅速洗涤细胞三次，加入500μl不含fbs的温热培养基。将pegfp和cm18-tat-cys溶液加入到细胞中并在37℃下温育4小时。温育后，将细胞用pbs洗涤，加入含fbs的新鲜培养基。细胞在37℃温育，然后进行流式细胞术分析，如实施例3所述。

7.2用cm18-tat-cys进行质粒dna递送

按照制造商的说明书(mirusbiollc)，用cy5^tm染料标记质粒dna(pegfp)。与使用标准转染方案的未标记质粒相比，cy5^tmmoiety不影响转染效率(数据未显示)。对应于dna细胞内递送和gfp发射、对应于成功的核递送、dna转录和蛋白质表达，流式细胞术分析允许定量cy5^tm发射。结果如表7.1和图20所示。

表7.1:来自图20中的数据

表7.1和图20中显示的结果显示，与仅用dna温育的细胞相比，当以0.05、0.5和5μm浓度使用时，cm18-tat-cys能够增加质粒dna的细胞内递送(“pegfp-cy5”)。然而，在细胞中没有检测到gfp的表达，这表明很少的质粒dna获得进入细胞质区室的通路，允许核定位。不受理论所限，质粒dna可能在大量封存在内体中，防止逃逸到细胞质区室。salomone等人，2013报道了使用cm18-tat11杂交肽在细胞内传递质粒dna。他们使用萤光素酶报告基因测定来评估转染效率，这对于定量细胞质/核输送的效率可能不是理想的，因为从内体成功释放并递送到核的质粒dna的比例由于萤光素酶的有效活性可能被高估。在这方面，salomone等人，2013年的作者甚至指出，萤光素酶的表达与大量的(裸)dna分子在囊泡中的大量捕获同时发生，这与表7.1和图20所示的结果一致。

实施例8:穿梭剂中添加组氨酸富集结构域可进一步改进gfp-nls转导效率

8.1在hela细胞中通过his-cm18-tat-cys转导gfp-nls：显微镜观察

将gfp-nls(5μm；参见实施例5)与5μm的cm18-tat-cys或his-cm18-tat共温育，并暴露于hela细胞1小时。通过荧光显微镜证实细胞内递送的gfp-nls的核荧光(数据未显示)，表明gfp-nls成功递送至核。

8.2在hela细胞中通过his-cm18-tat转导gfp-nls：流式细胞术

hela细胞在实施例3.1中描述的蛋白质转导测定中培养和测试。将gfp-nls(5μm)与0、1、3或5μm的cm18-tat-cys或his-cm18-tat共温育，并暴露于hela细胞1小时。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果如表8.1和图21a所示。相应的细胞毒性数据如图21b所示。

表8.1:来自图21a和21b中的数据

令人惊讶的是，表8.1和图21中的结果显示与cm18-tat-cys相比，his-cm18-tat能够在3μm和5μm浓度下将gfp-nls蛋白转导效率增加约2倍。这些结果表明，将组氨酸富集结构域添加到包含eld和cpd的穿梭剂中可显著增加肽负荷转导效率。或者或平行地，将穿梭剂与含有与cpd(但缺乏eld)融合的组氨酸富集结构域的另一独立合成肽组合，可为蛋白质转导提供类似的优点，具有的优势是允许组氨酸富集结构域的浓度独立于穿梭剂的浓度而改变或受控。不受理论限制，组氨酸富集结构域可能在内体中起到质子海绵的作用，提供内体膜不稳定化的另一种机制。

实施例9:his-cm18-ptd4增加gfp-nls、mcherry^tm-nls和fitc标记的抗微管蛋白的转导效率和核递送

9.1蛋白质转导方案

方案a：在细胞培养基中递送的蛋白质转导测定

在进行转导测定前一天，收获指数生长期的细胞并铺在96孔板(每孔20,000个细胞)中。将细胞在含有fbs的适当生长培养基中温育过夜(参见实施例1)。第二天，在分开的无菌1.5-ml管中，将所需浓度的负荷蛋白在37℃与预期浓度的穿梭剂在50μl新鲜无血清培养基中预混合(预温育)10分钟(除非另外表明)。移除孔中的培养基，并用预先在37℃加热的pbs洗涤细胞1-3次(取决于使用的细胞的类型)。将细胞与负荷蛋白/穿梭剂混合物在37℃温育所需的时间。温育后，将细胞用预先在37℃加热的pbs和/或肝素(0.5mg/ml)洗涤三次。在随后的分析(显微镜和流式细胞术)中，将使用肝素的洗涤用于人thp-1血细胞以避免不希望的细胞膜结合蛋白背景。在分析之前，将细胞最终在37℃具有血清的50μl新鲜培养基中温育。

方案b：在pbs中贴壁细胞的蛋白转导测定

在进行转导测定前一天，收获指数生长期的细胞并铺在96孔板(每孔20,000个细胞)中。将细胞在含有血清的适当生长培养基中温育过夜(参见实施例1)。第二天，在分开的无菌1.5-ml管中，穿梭剂在室温下用无菌蒸馏水稀释(如果负荷是或包含核酸，则使用无核酸酶的水)。然后将负荷蛋白添加至穿梭剂，如果需要的话，加入无菌pbs以获得预期的在足够覆盖细胞的最终体积(例如，对于96孔板，每孔10至100μl)中的穿梭剂和负荷的浓度。然后立即将穿梭剂/负荷混合物用于实验。每个实验至少包括三个对照，包括：(1)单独的穿梭剂(例如在测试的最高浓度)；(2)单独的负荷；和(3)没有任何负荷或穿梭剂。移除孔中的培养基，用先前在37℃加热的pbs洗涤细胞一次，然后添加穿梭剂/负荷混合物以覆盖所有细胞达所需的时间长度。移除孔中的穿梭剂/负荷混合物，用pbs洗涤细胞一次，添加新鲜的完全培养基。分析前，用pbs洗涤细胞一次并添加新鲜的完全培养基。

方案c：pbs中悬浮细胞的蛋白质转导测定

在进行转导测定之前一天，收获指数生长期的悬浮细胞并铺在96孔板(每孔20,000个细胞)中。将细胞在含有血清的适当生长培养基中温育过夜(参见实施例1)。第二天，在分开的无菌1.5-ml管中，在室温下用无菌蒸馏水稀释穿梭剂(如果负荷是或包含核酸，则使用无核酸酶的水)。然后将负荷蛋白添加至穿梭剂，如果需要，添加无菌pbs或细胞培养基(不含血清)获得预期的在足够重悬细胞的最终体积(例如，对于96孔板，每孔10至100μl)中的穿梭剂和负荷的浓度。随后立即将穿梭剂/负荷混合物用于实验。每个实验至少包括三个对照，包括：单独的穿梭剂(例如在测试的最高浓度)；(2)单独的负荷；和(3)没有任何负荷或穿梭剂。将细胞在400g下离心2分钟，然后移除培养基，将细胞再悬浮于预先在37℃加热的pbs中。将细胞在400g下再离心2分钟，除去pbs，并将细胞重悬于穿梭剂/负荷混合物中。在所需的温育时间之后，将100μl完全培养基直接添加到细胞上。将细胞以400g离心2分钟并移除培养基。重悬沉淀，并在预先加热到37℃的200μlpbs中洗涤。再次离心后，移除pbs，将细胞重悬于100μl完全培养基中。分析前重复最后两步一次。

9.2使用方案a或b在hela细胞中通过his-cm18-ptd4转导gfp-nls：流式细胞术

为了比较不同方案对穿梭剂转导效率的影响，将hela细胞在实施例9.1中描述的方案a或b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)使用方案a与10μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于hela细胞1小时，或使用方案b与35μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于hela细胞10秒。如实施例3.3中所述对细胞进行流式细胞术分析。结果如表9.1和图22a所示。(“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的细胞的百分比)。

表9.1:蛋白质转导方案a和b的比较：来自图22a的数据

上述结果表明，与方案a相比，使用方案b获得了使用穿梭剂his-cm18-ptd4的负荷gfp-nls的更高的蛋白质转导效率。

9.3使用方案b在hela细胞中通过his-cm18-ptd4的gfp-nls转导：流式细胞术

进行剂量响应实验以评估his-cm18-ptd4浓度对蛋白质转导效率的影响。hela细胞在实施例9.1的方案b所述的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简而言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与0、50、35、25或10μm的his-cm18-ptd4共温育，然后暴露于hela细胞10秒钟。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果见表9.2和图22b。

表9.2:使用方案b的穿梭剂的剂量响应：图22b的数据

上述结果表明，his-cm18-ptd4能够以剂量依赖性的方式增加hela细胞中的gfp-nls转导效率。

9.4使用方案b在hela细胞中通过his-cm18-ptd4的gfp-nls转导：通过显微镜观察

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与35μm的his-cm18-ptd4共温育，然后如实施例9.1中所述使用方案b暴露于hela细胞10秒钟。然后如实施例3.2和3.2a中所述对细胞进行荧光显微镜分析。

对于图23和图24所示的样品结果，在最终洗涤步骤后hela细胞的gfp荧光立即通过明场和荧光显微镜于4x，20x和40x放大倍数下观察。

在图23中，a、b和c的上图分别显示放大倍数为4x，20x和40x的核标记(dapi)，而下图显示对应的gfp-nls荧光。在图c中，白色三角窗指示核(dapi)和gfp-nls信号之间共标记的区域的实例。在图d中，上图和下图显示了hela细胞的样品明场图像，中图显示了相应的facs分析的结果(如实施例3.3中所述进行)，其指示96孔板中具有gfp信号的细胞百分比。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂的暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的gfp荧光。

图24显示明视场(图a)和荧光图像(图b)。图b的插图显示了相应的facs分析的结果(按照实施例3.3中所述进行)，其显示具有gfp信号的96孔板中细胞的百分比。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂的暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的gfp荧光。

对于图25所示的样品结果，如实施例3.2中所述用荧光显微镜观察前，将hela细胞如实施例3.2a所述固定、透化并进行免疫标记。使用原代小鼠单克隆抗gfp抗体(feldan，#a017)和山羊抗小鼠alexa^tm-594二抗(abcam#150116)标记gfp-nls。图25中的上图显示了核标记(dapi)，下图显示了gfp-nls的相应标记。图a和b分别以20x和40x放大倍数显示样品图像。白色三角形窗口表示核与gfp-nls之间共标记区域的实例。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的gfp-nls标记。

图26显示在63倍放大倍数下用共聚焦显微镜拍摄的活细胞的样品图像。图26的图a显示明场图像，而图b显示相应的荧光gfp-nls。图c是图a和图b之间的图像之间的重叠。在阴性对照样品(即暴露于没有穿梭剂的gfp-nls的细胞；数据未显示)中没有观察到显著的gfp-nls荧光。

9.4a使用方案b在hela细胞中通过his-cm18-ptd4的ftic标记的抗微管蛋白抗体转导：通过显微镜观察

将fitc标记的抗微管蛋白抗体(0.5μm；abcam，ab64503)与50μm的his-cm18-ptd4共温育，然后如实施例9.1中所述使用方案b将其暴露于hela细胞10秒钟。然后如实施例3.2和3.2a所述对细胞进行荧光显微镜分析，其中在最终洗涤步骤之后，通过明视场和荧光显微镜在20x放大倍数下立即使hela细胞中的抗微管蛋白抗体的fitc荧光可视化。样品结果显示在图24c和24d中。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂暴露于fitc标记的抗微管蛋白抗体的细胞；数据未显示)中未观察到显著的fitc荧光。

总的来说，实施例9.4和9.4a的结果显示gfp-nls和fitc标记的抗微管蛋白抗体负荷在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下成功转导并递送至hela细胞的细胞核和/或细胞质。

9.5在hela细胞中通过his-cm18-ptd4的gfp-nls动力学转导：显微镜观察

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与50μm的his-cm18-ptd4共温育，然后如实施例9.1中所述使用方案b暴露于hela细胞10秒钟。洗涤步骤后，不同的时间间隔后hela细胞的gfp荧光立即通过荧光显微镜(实施例3.2)在20x放大倍数观察。典型的结果显示在图27中，其中荧光显微镜图像在45、75、100和120秒后被捕获(分别参见图a、b、c和d)。

如图27a所示，在45秒后通常观察到弥散的细胞gfp荧光，伴随许多细胞中核内的gfp荧光较低的区域。这些结果表明在45秒后经由穿梭剂细胞内递送的gpf-nls主要是细胞质的和低核分布。图27b-27d显示在暴露于his-cm18-ptd4穿梭剂和gfp-gfp负荷后，在75秒(图b)、100秒(图c)和120秒(图d)，gfp荧光向细胞核的逐渐再分布至细胞核。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp荧光。

实施例9.5的结果表明gfp-nls在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下2分钟成功递送至hela细胞的核。

9.6在hela细胞中通过his-cm18-ptd4的gfp-nls和mcherry^tm-nls的共转导：显微镜观察

如实施例1.4所述，从细菌表达系统构建、表达和纯化mcherry^tm-nls重组蛋白。mcherry^tm-nls重组蛋白的序列为：

(mw＝34.71kda；pi＝6.68)

nls序列加下划线

富含丝氨酸/甘氨酸的接头用黑体标出

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)和mcherry^tm-nls重组蛋白(5μm)与35μm的his-cm18-ptd4共温育，然后使用如实施例9.1所述的方案b暴露于hela细胞10秒。洗涤步骤后，如实施例3.2所述，通过明视场和荧光显微镜以20x放大倍数立即观察细胞。样品结果显示在图28中，其中显示了显示明场(图a)、dapi荧光(图b)、gfp-nls荧光(图c)和mmcherry^tm-nls荧光(图d)的相应图像。白色三角窗指示细胞核中gfp-nls和mcherry^tm荧光信号之间共标记的区域的实例。在阴性对照样品(即没有任何穿梭剂暴露于gfp-nls或mcherry^tm的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp或mcherry^tm荧光。

这些结果表明gfp-nls和mcherry^tm-nls在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下成功地一起递送到hela细胞的细胞核中。

9.7在thp-1悬浮细胞中通过his-cm18-ptd4转导gfp-nls：流式细胞术

使用thp-1细胞测试his-cm18-ptd4在悬浮细胞的核中递送gfp-nls的能力。thp-1细胞在实施例9.1所述的蛋白质转导测定中使用方案a和c进行培养和测试。将gfp-nls(5μm；参见实施例5.1)与1μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于thp-1细胞1小时(方案a)，或者与5μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于thp-1细胞15秒(方案c)。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果见表9.3和图31。

表9.3:来自图31的数据

9.8在thp-1细胞中通过his-cm18-ptd4的gfp-nls转导：显微镜观察

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与5μm的his-cm18-ptd4共温育，然后如实施例9.1中所述使用方案c暴露于thp-1细胞15秒。如实施例3.2所述将细胞进行显微镜观察。

对于图32中所示的样品结果，在最终洗涤步骤后立即通过4x，10x和40x放大倍数(分别为图a-c)的明场(上图)和荧光(下图)显微镜观察hela细胞的gfp荧光。图c中的白色三角形窗口指示明场和荧光图像之间共标记的区域的实例。图d显示了相应的facs分析的典型结果(如实施例3.3所述进行)，其表示96孔板中具有gfp信号的细胞的百分比。其他结果如图33所示，其中图a和b显示明场图像，图c和d显示相应的荧光图像。白色三角形窗口指示了图a和图c以及图b和图d之间的共标记的区域的实例。最右侧的图显示了相应的facs分析的典型结果(如实施例3.3中所述进行)，其指示在96孔板中具有gfp信号的细胞的百分比。

在阴性对照样品(即无任何穿梭剂暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp荧光。

本实施例的结果表明gfp-nls在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下在thp-1中成功地细胞内递送。

实施例10:不同的多结构域穿梭剂(而不是单结构域肽)在hela和thp-1细胞中成功转导gfp-nls

10.1在hela细胞中通过不同穿梭剂的gfp-nls转导：流式细胞术

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简而言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与50μm不同的穿梭剂共温育并暴露于hela细胞10秒钟。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果见表10.1和图29a。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂一起温育的细胞。

表10.1:来自图29a的数据

10.2在hela中通过不同穿梭剂使用不同温育时间的gfp-nls转导：流式细胞术

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与10μm的tat-kala、his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4共温育1、2或5分钟。在最后的洗涤步骤后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。结果如表10.2和图29b所示。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂共温育的细胞。

表10.2:来自图29b的数据

10.3通过在hela中通过tat-kala、his-cm18-ptd4和his-c(llkk)3c-ptd4使用不同温育时间的gfp-nls的转导：流式细胞术

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案c的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与5μm的tat-kala、his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4共温育1、2或5分钟。在最后的洗涤步骤之后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。结果如表10.3和图29c所示。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂一起温育的细胞。

表10.3:来自图29c的数据

10.4在hela细胞中通过不同穿梭剂的gfp-nls转导：流式细胞术

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简而言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与50μm不同的穿梭剂(氨基酸序列和性质参见表1.3)共温育并暴露于hela细胞10秒钟。如实施例3.3所述将细胞进行流式细胞术分析。结果显示在表10.3a和10.3b以及图29e和29f中。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂共温育的细胞。

表10.3a:来自图29e的数据

*图29e中未显示

表10.3b:来自图29f的数据

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与10μm的tat-kala、his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4共温育1、2或5分钟。在最后的洗涤步骤之后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。结果显示在表10.3c和10.3b以及图29g和29h中。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂一起温育的细胞。

表10.3c:来自图29g的数据

表10.3d:来自图29h的数据

将穿梭剂cm18-ptd4用作模型来证明单个蛋白质结构域的模块性质以及它们被修饰的能力。更具体地，研究了n-末端半胱氨酸残基(“cys”)的存在或不存在；eld和cpd结构域间的不同柔性接头(“l1”:ggs；“l2”:ggsgggs；and“l3”:ggsgggsgggs)和不同长度、位置和组氨酸富的集结构域变体。

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简而言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与20μm的穿梭剂his-cm18-ptd4的不同穿梭肽变体(氨基酸序列和性质参见表1.3)共温育1分钟。在最后的洗涤步骤之后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。结果见表10.3e和图29i。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而没有任何穿梭剂一起温育的细胞。

表10.3e:来自图29i的数据

这些结果表明，给定穿梭剂(例如cm18-ptd4)的变化可以用于调节给定穿梭剂的转导效率和细胞活力的程度。更具体地，向cm18-ptd4(参见cys-cm18-ptd4)添加n-末端半胱氨酸残基使gfp-nls转导效率降低了11％(从47.6％降至36.6％)，但是使细胞活力从33.9％增加至78.7％。在cm18和ptd4结构域之间引入不同长度的柔性接头结构域(l1、l2和l3)并没有导致转导效率的显著损失，而是增加了细胞活力(参见cm18-l1-ptd4、cm18-l2-ptd4和cm18-l3-ptd4)。最后，组氨酸富集结构域的氨基酸序列和/或位置的变化没有导致his-cm18-ptd4的转导效率和细胞活性完全丧失(参见3his-cm18-ptd4、12his-cm18-ptd4、ha-cm18-ptd4、3ha-cm18-ptd4、cm18-his-ptd4和his-cm18-ptd4-his)。值得注意的是，在his-cm18-ptd4(即his-cm18-ptd4-his)的c末端添加第二个组氨酸富集结构域，转导效率从60％增加到68％，细胞活力相似。

10.5在hela细胞中通过单结构域肽或his-cpd肽的gfp-nls转导的缺乏：流式细胞术

hela细胞在实施例9.1中描述的使用方案b的蛋白质转导测定中进行培养和测试。简言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与50μm不同的单结构域肽(tat；ptd4；穿膜肽；cm18；c(llkk)3c；kala)或双结构域肽his-ptd4(缺乏eld)共温育，并暴露于hela细胞10秒钟。在最后的洗涤步骤之后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。结果如表10.4和图29d所示。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何单结构域肽或穿梭剂一起温育的细胞。

表10.4:来自图29d的数据

这些结果显示，单结构域肽tat、ptd4、穿膜肽、cm18、c(llkk)3c、kala或双结构域肽his-ptd4(缺乏eld)在hela细胞中不能成功转导gfp-nls。

10.6在hela细胞中通过tat-kala、his-cm18-ptd4、his-c(llkk)3c-ptd4、ptd4-kala、eb1-ptd4和his-cm18-ptd4-his转导gfp-nls：通过显微镜观察

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与50μm穿梭剂共温育，然后如实施例9.1中所述使用方案b暴露于hela细胞10秒钟。如实施例3.2中所述，在2分钟的温育时间后，通过显微镜观察细胞。

对于图30所示的样品结果，在最终洗涤步骤后hela细胞的gfp荧光通过在20x或40x放大倍数的明场(下行图)和荧光(上和中行图)显微镜立即观察。穿梭剂tat-kala、his-cm18-ptd4和his-c(llkk)3c-ptd4的结果分别显示在图a、b和c中。穿梭剂ptd4-kala、eb1-ptd4和his-cm18-ptd4-his的结果分别显示在图d、e和f中。最下面一排中的插图显示了相应的facs分析的结果(按照实施例3.3中的描述进行)，其表示96孔板中具有gfp信号的细胞的百分比。在阴性对照样品(即无任何穿梭剂的暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp荧光。

10.7在thp-1细胞中使用不同温育时间通过tat-kala、his-cm18-ptd4和his-c(llkk)3c-ptd4转导gfp-nls细胞：流式细胞术

thp-1细胞在实施例9.1所述的使用方案c的蛋白质转导测定中培养和测试。简而言之，将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与1μm的tat-kala、his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4共温育15、30、60、或120秒。在最终的洗涤步骤之后，如实施例3.3所述对细胞进行流式细胞术分析。细胞发出gfp信号的平均百分比(“阳性细胞(％)”)见表10.4a和图34a。平均荧光强度见表10.5和图34b。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂一起温育的细胞。

表10.4a:来自图34a的数据

表10.5:来自图34b的数据

实施例11:血清存在下使用低浓度穿梭剂每日重复处理导致thp-1细胞中的gfp-nls转导

11.1在thp-1细胞中使用his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4转导gfp-nls：流式细胞术

thp-1细胞在实施例9.1中所述的使用方案a的蛋白质转导测定中培养和测试，但进行了以下修改。将gfp-nls重组蛋白(5、2.5或1μm；参见实施例5.1)与0.5或0.8μm的his-cm18-ptd4或与0.8μm的his-c(llkk)3c-ptd4共温育，然后在含有血清的细胞培养基存在下每天暴露于thp-1细胞150分钟。反复暴露于穿梭剂/负荷1或3天后，洗涤细胞并如实施例3.3所述进行流式细胞术分析。结果显示在表11.1和图35a、b、c和f中。阴性对照(“对照”)对应于与gfp-nls重组蛋白(5μm)而无任何穿梭剂一起温育的细胞。

表11.1:来自图35a、b、c和f的数据

如实施例3.3a所述确定重复暴露于his-cm18-ptd4和gfp-nls的thp-1细胞的活力。结果显示在表11.2和11.3以及图35d和35e中。表11.2和图35d的结果显示thp-1细胞在1、2、4和24h后的代谢活性指数，表11.3和图35e中的结果显示1至4天后thp-1细胞的代谢活性指数。

表11.2:来自图35d的数据

表11.3:来自图35e的数据

实施例11中的结果表明，血清存在下用相对低浓度的his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4反复每日(或长期)处理导致gfp-nls在thp-1细胞中的细胞内递送。结果还表明穿梭剂和负荷的剂量可以独立调节以改进负荷的转运效率和/或细胞活力。

实施例12:his-cm18-ptd4增加多种细胞系中gfp-nls的转导效率和核递送

12.1在不同贴壁&悬浮细胞中使用his-cm18-ptd4转导gfp-nls：流式细胞术

如实施例9.1所述使用方案b(贴壁细胞)或c(悬浮细胞)检查了穿梭剂his-cm18-ptd4将gfp-nls递送至不同贴壁细胞和悬浮细胞的核的能力。测试的细胞系包括：hela、balb3t3、hek293t、cho、nih3t3、成肌细胞、jurkat、thp-1、ca46和ht2细胞，如实施例1所述进行培养。将gfp-nls(5μm；参见实施例5.1)与35μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于贴壁细胞10秒钟(方案b)，或者与5μm的his-cm18-ptd4共温育并暴露于悬浮细胞悬液15秒(方案c)。洗涤细胞并如实施例3.3所述进行流式细胞术分析。结果如表12.1和图36所示。“阳性细胞(％)”是发出gfp信号的所有细胞的平均百分比。

表12.1:来自图36的数据

12.2在数种贴壁和悬浮细胞中使用his-cm18-ptd4转导gfp-nls：显微镜观察

将gfp-nls重组蛋白(5μm；参见实施例5.1)与35μm的his-cm18-ptd4共温育，并使用方案a暴露于贴壁细胞10秒，或者与5μm的his-cm18-ptd4共温育，并如实施例9.1所述用方案b暴露于悬浮细胞15秒。洗涤细胞后，通过明场和荧光显微镜观察gfp荧光。图37显示了在10x放大倍数捕获的(a)293t、(b)balb3t3、(c)cho、(d)成肌细胞、(e)jurkat、(f)ca46、(g)ht2和(h)nih3t3细胞显示gfp荧光的样品图像。插图显示如实施例3.3所述进行的相应的流式细胞术结果，表明gfp-nls阳性细胞的百分比。在阴性对照样品(即无任何穿梭剂暴露于gfp-nls的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp荧光。

如实施例3.2a所述，使用细胞免疫标记在固定和透化的成肌细胞中进一步证实了gfp-nls的核定位。使用原代小鼠单克隆抗gfp抗体(feldan，#a017)和山羊抗小鼠alexa^tm-594二抗(abcam#150116)标记gfp-nls。核用dapi标记。原代人成肌细胞的样品结果显示在图38中，其中gfp免疫标记显示在图a中，gfp免疫标记和dapi标记的重叠显示在图b中。在阴性对照样品中没有观察到显著的细胞gfp标记(即暴露于gfp-nls而无穿梭剂的细胞；数据未显示)。

显微镜检查结果显示，使用穿梭剂his-cm18-ptd4将gfp-nls成功递送至所有测试细胞的核。

实施例13:

his-cm18-ptd4允许在hela细胞中转导crispr/cas9-nls系统和基因组编辑

13.1cas9-nls重组蛋白

如实施例1.4所述，从细菌表达系统构建、表达和纯化cas9-nls重组蛋白。产生的cas9-nls重组蛋白的序列是：

(mw＝162.9kda；pi＝9.05)

nls序列加下划线

富含丝氨酸/甘氨酸的接头用黑体标出

13.2转染质粒替代测定

该测定允许目测鉴定已成功递送活性crispr/cas9复合物的细胞。如图39a所示，该测定涉及用编码荧光蛋白mcherry^tm和gfp(用终止密码子分离它们的两个开放阅读框)的表达质粒dna转染细胞。用表达质粒转染细胞导致mcherry^tm表达，但没有gfp表达(图39b)。然后将已设计/程序化以在终止密码子处切割质粒dna的crispr/cas9复合物细胞内递送至转染的表达mcherry^tm的细胞(图39d)。成功转导活性crispr/cas9复合物导致crispr/cas9复合物在终止密码子处切割质粒dna(图39c)。在细胞的一部分中，发生切割的质粒的随机非同源dna修复，并导致终止密码子的移除，从而导致gfp的表达和荧光(图39e)。

在转染质粒替代测定的第1天，将用于不同实验条件(250ng)的dna质粒在单独的无菌1.5-ml管中的dmem(50μl)中稀释，涡旋并短暂离心。在单独的无菌1.5-ml管中，将fastfect^tm转染试剂在不含血清且不含抗生素的dmem(50μl)中以3:1的比例(3μl的fastfect^tm转染试剂对应1μg的dna)稀释，然后快速涡旋并短暂离心。然后将fastfect^tm/dmem混合物添加到dna混合物中并快速涡旋并短暂离心。然后将fastfect^tm/dmem/dna混合物在室温温育15-20分钟，然后添加至细胞(每孔100μl)。然后将细胞在37℃和5％co2下温育5小时。然后将培养基更换为完全培养基(含血清)，并进一步在37℃和5％co2温育24-48小时。然后在荧光显微镜下观察细胞，以观察mcherry^tm信号。

13.3his-cm18-ptd4介导的crispr/cas9-nls系统递送和质粒dna的切割

设计rna(crrna和tracrrna)以靶向emx1基因的核苷酸序列，在实施例13.2的质粒中的mcherry^tm和gfp编码序列之间含有终止密码子。

使用的crrna和tracrrna的序列如下：

-crrna[seqidno:75]:

5′-gaguccgagcagaagaagaaguuuuagagcuaugcuguuuug-3′

-tracrrna[seqidno:76]:

5′-aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu-3′

培养hela细胞，并按照实施例13.2所述进行转染质粒替代测定。在第1天，如图39a所示，用编码mcherry^tm蛋白质的质粒替代物转染hela细胞。在第2天，将cas9-nls重组蛋白(2μm；参见实施例13.1)和rna(crrna和tracrrna；2μm；参见上文)的混合物与50μm的his-cm18-ptd4共温育，并如实施例9.1所述使用方案b将混合物(crispr/cas9复合物)暴露于hela细胞10秒钟。通过crispr/cas9复合物在mcherry^tm和gfp编码序列之间的终止密码子处切割双链质粒dna(图39b)，并且随后通过细胞的非同源修复在一些情况下导致stop密码子的移除(图39c)，从而允许mcherry^tm和gfp荧光蛋白在第3天在同一细胞中的表达(图39d-e)。图d和e中的白色三角形窗口指示mcherry^tm和gfp之间的共标记区域的实例。

作为crispr/cas9-nls系统的阳性对照，培养hela细胞并使用三种质粒共转染：质粒替代物(如实施例13.2中所述)和编码cas9-nls蛋白质的其他表达质粒(实施例13.1)和crrna/tracrrna(实施例13.3)。典型的荧光显微镜结果如图40a-d所示。图a和b显示转染后24小时的细胞，而图c和d显示转染后72小时的细胞。

图40e-h显示了使用35μm穿梭剂his-cm18-ptd4进行的平行转染质粒替代测定的结果，如图39所述。图e和f显示转导后24小时的细胞，而图g和h显示转导后48小时的细胞。图e和g显示mcherry^tm荧光，图f和h显示gfp荧光，后者由转导的crispr/cas9-nls复合物去除终止密码子并随后由细胞非同源修复而产生。在阴性对照样品(即无任何穿梭剂暴露于crispr/cas9-nls复合物的细胞；数据未显示)中未观察到显著的细胞gfp荧光。

13.4t7e1测定

用edit-r^tm合成crrna阳性对照(dharmacon#u-007000-05)和t7核酸内切酶i(neb，cat#m0302s)进行t7e1测定。在crispr/cas9复合物递送之后，将细胞在100μl具有添加剂的phusion^tm高保真dna聚合酶(neb#m0530s)实验室中切割。将细胞在56℃温育15-30分钟，然后在96℃下失活5分钟。将平板短暂离心以收集孔底部的液体。为每个待分析样品设置50μlpcr样品。将pcr样品加热至95℃10分钟，然后缓慢(>15分钟)冷却至室温。然后在琼脂糖凝胶(2％)上分离pcr产物(～5μl)以确认扩增。将15μl各反应物与t7e1核酸酶在37℃温育25分钟。立即用琼脂糖凝胶(2％)上合适的凝胶上样缓冲液运行整个反应体积。

13.5his-cm18-ptd4和his-c(llkk)3c-ptd4介导的crispr/cas9-nls系统递送和基因组ppib序列的切割

由靶向ppib基因核苷酸序列的cas9-nls重组蛋白(25nm；实施例13.1)和crrna/tracrrna(50nm；参见下文)组成的混合物与10μm的his-cm18-ptd4或his-c(llkk)3c-ptd4共温育，并与hela细胞在没有血清的培养基中如实施例9.1中所述的方案a温育16小时。

构建的crrna和tracrrna的序列及其靶标为：

-feldantracrrna[seqidno:77]:

5′-aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu-3′

-ppibcrrna[seqidno:78]:

5’-guguauuuugaccuacgaauguuuuagagcuaugcuguuuug-3’

-dharmacontracrrna[seqidno:79]:

5′-aacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3′

16小时后，用pbs洗涤hela细胞，并在具有血清的培养基中温育48小时。收获hela细胞以进行t7e1方案测定，如实施例13.4所述。

图41a显示pcr扩增后具有ppibdna序列的琼脂糖凝胶。泳道a显示hela细胞中扩增的ppibdna序列，没有任何处理(即没有穿梭或cas9/rna复合物)。泳道b：白框#1中所框的两条带是在用穿梭剂his-c(llkk)3c-ptd4递送复合物之后通过cripr/cas9复合物的ppibdna序列的切割产物。泳道c：这些条带显示hela细胞与cas9/rnas复合物在没有穿梭剂(阴性对照)的情况下温育后的扩增的ppibdna序列。泳道d：在白框#2中所框条带显示hela细胞与cas9/rnas复合物在脂质转染剂(dharmafect^tm转染试剂#t-20xx-01)(阳性对照)存在下温育后扩增的ppibdna序列。使用穿梭剂his-cm18-ptd4获得了类似的结果(数据未显示)。

图41b显示了pcr扩增后的具有ppibdna序列的琼脂糖凝胶。左图显示在hela细胞中用穿梭剂his-cm18-ptd4递送复合物之后通过cripr/cas9复合物扩增的ppibdna序列的切割产物。右图显示在t7e1消化步骤之前扩增的dna序列作为阴性对照。

图41c显示了pcr扩增后具有ppibdna序列的琼脂糖凝胶。左图显示hela细胞与cas9/rna复合物在脂质转染剂(dharmafect^tm转染试剂#t-20xx-01)(阳性对照)存在下温育后的扩增的ppibdna序列。右图显示在t7e1消化步骤之前扩增的dna序列作为阴性对照。

这些结果表明穿梭剂his-cm18-ptd4和his-c(llkk)3c-ptd4成功地将功能性crispr/cas9复合物递送到hela细胞的核，并且该递送导致crispr/cas9-介导的基因组dna的切割。

13.6通过不同穿梭剂的crispr/cas9-nls系统递送，以及hela和jurkat细胞中基因组hptr序列的切割

将靶向hptr基因的核苷酸序列的由cas9-nls重组蛋白(2.5μm；实施例13.1)和crrna/tracrrna(2μm；参见下文)组成的混合物与35μm的his-cm18-ptd4、his-cm18-ptd4-his、his-c(llkk)3c-ptd4或eb1-ptd4共温育，并与hela或jurkat细胞在pbs中如实施例9.1所述使用方案b温育2分钟。

构建的crrna和tracrrna的序列及其靶标为：

-feldantracrrna[seqidno:77]:

5′-aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu-3′

-hprtcrrna[seqidno:103]:

5’-aauuauggggauuacuaggaguuuuagagcuaugcu-3’

2分钟后，用pbs洗涤细胞，并在具有血清的培养基中温育48小时。收获细胞以如实施例13.4所述进行t7e1方案测定。图46显示了pcr扩增后具有hptrdna序列的琼脂糖凝胶和在用不同穿梭剂递送复合物之后通过crispr/cas9复合物的扩增的hptrdna序列的切割产物。图a显示hela细胞中使用下述穿梭剂的结果：his-cm18-ptd4，his-cm18-ptd4-his和his-c(llkk)3c-ptd4。图b显示了jurkat细胞中使用his-cm18-ptd4和his-cm18-l2-ptd4的结果。在不存在穿梭剂的情况下，将细胞与crispr/cas9复合物温育后，阴性对照(泳道4)显示扩增的hptrdna序列。在脂质转染剂(rnaimax^tm转染试剂thermofisher产品号13778100)存在下，将细胞与cas9/rna复合物温育后，阳性对照(图a和b中的泳道5)显示扩增的hptrdna序列。

这些结果表明，本发明的不同多肽穿梭剂可以成功地将功能性crispr/cas9复合物递送到hela和jurkat细胞的核，并且该递送导致crispr/cas9介导的基因组dna的切割。

实施例14:his-cm18-ptd4允许thp-1细胞中的转录因子hoxb4的转导

14.1hoxb4-wt重组蛋白

如实施例1.4所述，从细菌表达系统构建、表达和纯化人hoxb4重组蛋白质。产生的hoxb4-wt重组蛋白的序列是：

(mw＝28.54kda；pi＝9.89)

起始甲硫氨酸和6x组氨酸标签以黑体显示。

14.2实时聚合酶链式反应(rt-pcr)

将对照和处理的细胞转移到不同的无菌1.5-ml管中，并在300g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于合适的缓冲液中以裂解细胞。然后加入无rna酶的70％乙醇，随后通过移液混合。将裂解物转移至rneasy^tmmini离心柱，并在13000rpm离心30秒。用适当的缓冲液和离心步骤洗涤几次后，将洗脱液收集在冰上的无菌1.5-ml试管中，然后用分光光度计定量每个试管中的rna量。对于dna酶处理，将2μg的rna在15μl无rna酶的水中稀释。然后加入1.75μl的10xdna酶缓冲液和0.75μl的dna酶，随后在37℃温育15分钟。对于逆转录酶处理，加入0.88μl的edta(50nm)，然后在75℃温育5分钟。在pcr管中，将0.5μg的dna酶处理的rna与4μl的iscript^tm逆转录超混合物(5x)和20μl无核酸酶的水混合。混合物在pcr仪中用以下程序温育：在25℃5分钟，在42℃30分钟和在85℃5分钟。将新合成的cdna转移到无菌1.5-ml管中并用2μl无核酸酶的水稀释。然后将每孔18μl的qpcr仪(cfx-96^tm)混合物加入到pcr板中用于分析。

14.3thp-1细胞中通过his-cm18-ptd4的hoxb4-wt转导：剂量响应和活力

thp-1细胞在实施例9.1描述的使用方案a的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，thp-1细胞在转导前一天以30000个细胞/孔接种。将hoxb4-wt重组蛋白(0.3、0.9或1.5μm；实施例14.1)与不同浓度的his-cm18-ptd4(0、0.5、7.5、0.8或1μm)共温育，然后在血清存在下暴露于thp-1细胞2.5小时。如实施例14.2所述的方法对细胞进行实时pcr分析以测量作为hoxb4活性标记物的靶基因的mrna水平，然后将其标准化为在阴性对照细胞中检测到的靶基因mrna水平(无治疗)，以获得“超过对照的倍数”的值。总rna水平(ng/μl)也作为细胞存活力的标记进行测量。结果见表14.1和图42。

表14.1:来自图42的数据

这些结果表明，在血清存在下将thp-1细胞暴露于穿梭剂his-cm18-ptd4和转录因子hoxb4-wt的混合物2.5小时导致靶基因的mrna转录的剂量依赖性增加。这些结果表明，hoxb4-wt以活性形式成功递送至thp-1细胞的核，其在核中可介导转录激活。

14.4通过his-cm18-ptd4在thp-1细胞中的hoxb4-wt转导：时程和活力(0至48小时)

thp-1细胞在实施例9.1所述的使用方案a的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，thp-1细胞在第一次时程实验前一天以30000个细胞/孔接种。将hoxb4-wt重组蛋白(1.5μm；实施例14.1)与his-cm18-ptd4(0.8μm)共温育，然后在血清存在下暴露于thp-1细胞0、2.5、4、24或48小时。如实施例14.2所述对细胞进行实时pcr分析以测量作为hoxb4活性的标记物的靶基因的mrna水平，然后将其标准化为在阴性对照细胞中检测到的靶基因mrna水平(无处理)，以获得“超过对照的倍数”的值。总rna水平(ng/μl)也作为细胞存活力的标记进行测量。结果如表14.2和图43所示。

表14.2:来自图43的数据

14.5通过his-cm18-ptd4在thp-1细胞中的hoxb4-wt转导：时程和活力(0-4小时)

thp-1细胞在实施例9.1所述的使用方案a的蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，thp-1细胞在第一次时程实验前一天以30000个细胞/孔接种。将hoxb4-wt重组蛋白(1.5μm；实施例14.1)与his-cm18-ptd4(0.8μm)共温育，然后在血清存在下暴露于thp-1细胞0、0.5,、1、2、2.53或4小时。如实施例14.2所述对细胞进行实时pcr分析以测量作为hoxb4活性的标记物的靶基因的mrna水平，然后将其标准化为在阴性对照细胞中检测到的靶基因mrna水平(无处理)，以获得“超过对照的倍数”的值。总rna水平(ng/μl)也作为细胞存活力的标记进行测量。结果见表14.3和图44。

表14.3:来自图44的数据

14.6通过his-cm18-ptd4在hela细胞中的hoxb4-wt转导：免疫标记和显微镜观察

如实施例9.1中所述，使用方案b将重组hoxb4-wt转录因子(25μm；实施例14.1)与35μm的his-cm18-ptd4共温育并使用方案b暴露于hela细胞10秒钟。30分钟的温育以使转导的hoxb4-wt在核中积累后，如实施例3.2a所述将细胞固定、透化和免疫标记。用1/500稀释的小鼠抗hoxb4单克隆一抗(novusbio#nbp2-37257)和1/1000稀释的抗小鼠二抗alexa^tm-594(abcam#150116)标记hoxb4-wt。核用dapi标记。如实施例3.2所述，通过明场和荧光显微镜以20x和40x的放大倍数观察细胞，并且样品结果显示在图45中。在核标记(图a和c)和hoxb4-wt标记(图b和d)之间观察到共定位，表明hoxb4-wt在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下30分钟后成功递送至核。白色三角窗显示细胞核(dapi)和hoxb4-wt免疫标记之间共定位区域的实例。

14.7通过不同穿梭剂在thp-1细胞中的hoxb4-wt转导：剂量响应和活力

thp-1细胞如实施例9.1中所述使用方案a在蛋白质转导测定中培养和测试。简言之，thp-1细胞在第一次时程实验前一天以30000个细胞/孔接种。hoxb4-wt重组蛋白(1.5μm；实施例14.1)与穿梭剂his-cm18-ptd4、tat-kala、eb1-ptd4、his-c(llkk)3c-ptd4和his-cm18-ptd4-his以0.8μm共温育，然后在血清存在下暴露于thp-1细胞2.5小时。如实施例14.2所述对细胞进行实时pcr分析以测量作为hoxb4活性标记物的靶基因的mrna水平，然后将其标准化为在阴性对照细胞中检测到的靶基因mrna水平(无处理)，以获得“超过对照的倍数”的值。总rna水平(ng/μl)也作为细胞存活力的标记进行测量。结果如表14.4和图47所示。

表14.4:来自图47的数据

实施例15:通过his-cm18-ptd4在大鼠顶叶皮层中体内递送gfp-nls

测试了穿梭剂his-cm18-ptd4在大鼠脑细胞的核中体内递送gfp-nls的能力。

在单独的无菌1.5-ml管中，穿梭剂his-cm18-ptd4在室温下在无菌蒸馏水中稀释。然后将用作负荷蛋白的gfp-nls加入穿梭剂中，并且如果需要，加入无菌pbs以获得在足以用于在大鼠脑中注射的最终体积(例如5μl每个脑注射位点)中的预期浓度的穿梭剂和负荷。穿梭剂/负荷混合物立即用于实验。实验中包括一个阴性对照，其对应于单独的gfp-nls的注射。

在三只大鼠的顶叶皮层中进行双侧注射。在左侧顶叶皮层(同侧)，注射由穿梭剂(20μm)和gfp-nls(20μm)组成的混合物，而在右顶叶皮层(对侧)仅注射gfp-nls(20μm)作为阴性对照。对于外科手术，将小鼠用异氟烷麻醉。然后将动物置于立体框架中，暴露颅骨表面。在适当的位点钻两个孔，以允许使用5μl汉密尔顿注射器双侧输注穿梭剂/负荷混合物或单独的gfp-nls(20μm)。前-后(ap)，侧(l)和背-腹(dv)坐标相对于前囟：(a)ap+0.48mm,l±3mm,v–5mm；(b)ap–2mm,l±1.3mm,v–1.5mm；(c)ap–2.6mm,l±1.5mm,v–1.5mm。穿梭/负荷混合物或单独的负荷的注入量为每个注射部位5μl，注射进行10分钟。之后，实验者等待1分钟，然后从脑中取出针。所有的措施都是在手术前、手术过程中和手术后进行的，以减少动物的疼痛和不适。手术后2h通过灌注多聚甲醛(4％)处死动物，收集脑并制备用于显微镜分析。实验流程由动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会的指导方针批准。

收集腹背-侧大鼠脑切片并通过荧光显微镜分析，结果如图48在(a)4x，(c)10x和(d)20x放大倍数所示。注射部位位于顶叶皮层(pcx)的最深层。穿梭剂his-cm18-ptd4存在情况下，gfp-nls在pcx、胼胝体(cc)和纹状体(str)的细胞核中扩散(白色曲线意指脑结构之间的限制)。图b显示来自franklin和paxinos的大鼠脑图谱的注射部位(黑色箭头)的立体坐标。在his-cm18-ptd4存在下注射gfp-nls在大脑左侧部分进行，阴性对照(仅注射gfp-nls)在对侧部位进行。图b上的黑色圆圈和黑色连线显示在荧光照片(a、c和d)中观察到的区域。

该实验证明负载gfp-nls在穿梭剂his-cm18-ptd4存在下在其大鼠顶叶皮质中立体定位注射后的细胞递送。结果显示gfp-nls在从顶层皮层(注射部位)的深层到胼胝体以及纹状体(壳核)的细胞核中的递送。相反，阴性对照中gfp-nls仅在注射部位周围局部检测到。这个实验表明，穿梭剂诱导了注射部位(顶叶皮质)负荷的核递送，并通过邻近的脑区(胼胝体和纹状体大鼠脑)扩散。

参考文献

andreu,d.,ubach,j.,boman,a.,wahlin,b.,wade,d.,merrifield,r.b.,andboman,h.g.(1992)shortenedcecropina-melittinhybrids.significantsizereductionretainspotentantibioticactivity.febsletters296,190-194

aguila,j.r.,w.liao,j.yang,c.avila,n.hagag,l.senzelandy.ma(2011)."sall4isarobuststimulatorfortheexpansionofhematopoieticstemcells."blood118(3):576-585.

akinci,e.,a.banga,l.v.greder,j.r.duttonandj.m.slack(2012)."reprogrammingofpancreaticexocrinecellstowardsabeta(beta)cellcharacterusingpdx1,ngn3andmafa."biochemj442(3):539-550.alfordetal.,(2009).“toxicityoforganicfluorophoresusedinmolecularimaging:literaturereview.”molimaging.8(6):341-54.

amand,h.l.,b.nordenandk.fant(2012)."functionalizationwithc-terminalcysteineenhancestransfectionefficiencyofcell-penetratingpeptidesthroughdimerformation."biochembiophysrescommun418(3):469-474.

bejarano,l.a.andc.gonzalez(1999)."motiftrap:arapidmethodtoclonemotifsthatcantargetproteinstodefinedsubcellularlocalisations."jcellsci112(pt23):4207-4211.

bikardetal.,programmablerepressionandactivationofbacterialgeneexpressionusinganengineeredcrispr-cassystem.nucleicacidsres.41,7429–7437.

boman,h.g.,wade,d.,boman,i.a.,wahlin,b.,andmerrifield,r.b.(1989)antibacterialandantimalarialpropertiesofpeptidesthatarececropin-melittinhybrids.febsletters259,103-106.

buganimetal.,(2014)“thedevelopmentalpotentialofipscsisgreatlyinfluencedbyreprogrammingfactorselection”.cellstemcell.15,295-309.

chan,c.k.andd.a.jans(1999)."enhancementofpolylysine-mediatedtransferrinfectionbynuclearlocalizationsequences:polylysinedoesnotfunctionasanuclearlocalizationsequence."humgenether10(10):1695-1702.

chan,c.k.andd.a.jans(2001)."enhancementofmshreceptor-andgal4-mediatedgenetransferbyswitchingthenuclearimportpathway."genether8(2):166-171.

congetal.,(2013).multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science339,819–823.

coxetal.(2015).“therapeuticgenomeediting:prospectsandchallenges”.naturemedicine,21:121-131.

dolfini,d.,m.minuzzo,g.pavesiandr.mantovani(2012)."theshortisoformofnf-yabelongstotheembryonicstemcelltranscriptionfactorcircuitry."stemcells30(11):2450-2459.

drin,g.,s.cottin,e.blanc,a.r.reesandj.temsamani(2003)."studiesontheinternalizationmechanismofcationiccell-penetratingpeptides."jbiolchem278(33):31192-31201.

el-andaloussi,s.,h.j.johansson,t.holmandu.langel(2007)."anovelcell-penetratingpeptide,m918,forefficientdeliveryofproteinsandpeptidenucleicacids."molther15(10):1820-1826.

el-sayed,a.,s.futakiandh.harashima(2009)."deliveryofmacromoleculesusingarginine-richcell-penetratingpeptides:waystoovercomeendosomalentrapment."aapsj11(1):13-22.

elmquist,a.,m.lindgren,t.bartfaiandu.langel(2001)."ve-cadherin-derivedcell-penetratingpeptide,pvec,withcarrierfunctions."expcellres269(2):237-244.

erazo-oliverasetal.,(2014)“proteindeliveryintolivecellsbyincubationwithanendosomolyticagent.”natmethods.(8):861-7.

fanara,p.,m.r.hodel,a.h.corbettanda.e.hodel(2000)."quantitativeanalysisofnuclearlocalizationsignal(nls)-importinalphainteractionthroughfluorescencedepolarization.evidenceforauto-inhibitoryregulationofnlsbinding."jbiolchem275(28):21218-21223.

fasoliaetal.,(2014)“mechanisticinsightintocm18-tat11peptidemembrane-perturbingactionbywhole-cellpatch-clamprecording.”molecules.19(7):9228-39.

fawell,s.,j.seery,y.daikh,c.moore,l.l.chen,b.pepinskyandj.barsoum(1994)."tat-mediateddeliveryofheterologousproteinsintocells."procnatlacadsciusa91(2):664-668.

fominaya,j.,c.uherekandw.wels(1998)."achimericfusionproteincontainingtransforminggrowthfactor-alphamediatesgenetransferviabindingtotheegfreceptor."genether5(4):521-530.

fominaya,j.andw.wels(1996)."targetcell-specificdnatransfermediatedbyachimericmultidomainprotein.novelnon-viralgenedeliverysystem."jbiolchem271(18):10560-10568.

fonoudi,h.,m.yeganeh,f.fattahi,z.ghazizadeh,h.rassouli,m.alikhani,b.a.mojarad,h.baharvand,g.h.salekdehandn.aghdami(2013)."isl1proteintransductionpromotescardiomyocytedifferentiationfromhumanembryonicstemcells."plosone8(1):e55577.

gilbertetal.,crispr-mediatedmodularrna-guidedregulationoftranscriptionineukaryotes.cell154,442–451.

gilmore,t.d.andh.m.temin(1988)."v-reloncoproteinsinthenucleusandinthecytoplasmtransformchickenspleencells."jvirol62(3):703-714.

glover,d.j.,s.m.ng,a.mechler,l.l.martinandd.a.jans(2009)."multifunctionalproteinnanocarriersfortargetednucleargenedeliveryinnondividingcells."fasebj23(9):2996-3006.

gordon,s.m.,j.chaix,l.j.rupp,j.wu,s.madera,j.c.sun,t.lindstenands.l.reiner(2012)."thetranscriptionfactorst-betandeomescontrolkeycheckpointsofnaturalkillercellmaturation."immunity36(1):55-67.

gottschalk,s.,j.t.sparrow,j.hauer,m.p.mims,f.e.leland,s.l.wooandl.c.smith(1996)."anoveldna-peptidecomplexforefficientgenetransferandexpressioninmammaliancells."genether3(5):448-457.

gould,s.j.,g.a.keller,n.hosken,j.wilkinsonands.subramani(1989)."aconservedtripeptidesortsproteinstoperoxisomes."jcellbiol108(5):1657-1664.

green,m.andp.m.loewenstein(1988)."autonomousfunctionaldomainsofchemicallysynthesizedhumanimmunodeficiencyvirustattrans-activatorprotein."cell55(6):1179-1188.

grimes,m.l.,j.zhou,e.c.beattie,e.c.yuen,d.e.hall,j.s.valletta,k.s.topp,j.h.lavail,n.w.bunnettandw.c.mobley(1996)."endocytosisofactivatedtrka:evidencethatnervegrowthfactorinducesformationofsignalingendosomes."jneurosci16(24):7950-7964.

hallbrink,m.,a.floren,a.elmquist,m.pooga,t.bartfaiandu.langel(2001)."cargodeliverykineticsofcell-penetratingpeptides."biochimbiophysacta1515(2):101-109.

herce,h.d.anda.e.garcia(2007)."moleculardynamicssimulationssuggestamechanismfortranslocationofthehiv-1tatpeptideacrosslipidmembranes."procnatlacadsciusa104(52):20805-20810.

hoetal.,(2001).“syntheticproteintransductiondomains:enhancedtransductionpotentialinvivo.”cancerresearch61:474-477.

hurt,e.c.,b.pesold-hurt,k.suda,w.oppligerandg.schatz(1985)."thefirsttwelveaminoacids(lessthanhalfofthepre-sequence)ofanimportedmitochondrialproteincandirectmousecytosolicdihydrofolatereductaseintotheyeastmitochondrialmatrix."emboj4(8):2061-2068.

ichii,h.,a.sakamoto,y.kurodaandt.tokuhisa(2004)."bcl6actsasanamplifierforthegenerationandproliferativecapacityofcentralmemorycd8+tcells."jimmunol173(2):883-891.

irie,y.,k.yamagata,y.gan,k.miyamoto,e.do,c.h.kuo,e.tairaandn.miki(2000)."molecularcloningandcharacterizationofamida,anovelproteinwhichinteractswithaneuron-specificimmediateearlygeneproductarc,containsnovelnuclearlocalizationsignals,andcausescelldeathinculturedcells."jbiolchem275(4):2647-2653.

kakudo,t.,s.chaki,s.futaki,i.nakase,k.akaji,t.kawakami,k.maruyama,h.kamiyaandh.harashima(2004)."transferrin-modifiedliposomesequippedwithaph-sensitivefusogenicpeptide:anartificialviral-likedeliverysystem."biochemistry43(19):5618-5628.

karniely,s.ando.pines(2005)."singletranslation--dualdestination:mechanismsofdualproteintargetingineukaryotes."emborep6(5):420-425.

kato,g.j.,w.m.lee,l.l.chenandc.v.dang(1992)."max:functionaldomainsandinteractionwithc-myc."genesdev6(1):81-92.

kichler,a.,a.j.masonandb.bechinger(2006)."cationicamphipathichistidine-richpeptidesforgenedelivery."biochimbiophysacta1758(3):301-307.

kichleretal.,(2003).“histidine-richamphipathicpeptideantibioticspromoteefficientdeliveryofdnaintomammaliancells”.procnatlacadsciusa.2003feb18；100(4):1564–1568.

kiraetal.,(2011).‘’unificationofcasproteinfamiliesandasimplescenariofortheoriginandevolutionofcrispr-cassystems”.bioldirect.2011；6:38.

kleinschmidt,j.a.anda.seiter(1988)."identificationofdomainsinvolvedinnuclearuptakeandhistonebindingofproteinn1ofxenopuslaevis."emboj7(6):1605-1614.

kohler,m.,d.gorlich,e.hartmannandj.franke(2001)."adenovirale1aproteinnuclearimportispreferentiallymediatedbyimportinalpha3invitro."virology289(2):186-191.

lanford,r.e.,p.kandaandr.c.kennedy(1986)."inductionofnucleartransportwithasyntheticpeptidehomologoustothesv40tantigentransportsignal."cell46(4):575-582.

lord-dufouretal.,(2009)“evidencefortranscriptionalregulationoftheglucose-6-phosphatetransporterbyhif-1alpha:targetingg6ptwithmumbaistatinanalogsinhypoxicmesenchymalstromalcells”.stemcells27:489-497.

li,w.,f.nicolandf.c.szoka,jr.(2004)."gala:adesignedsyntheticph-responsiveamphipathicpeptidewithapplicationsindrugandgenedelivery."advdrugdelivrev56(7):967-985.

lin,m.h.,f.c.chou,l.t.yeh,s.h.fu,h.y.chiou,k.i.lin,d.m.changandh.k.sytwu(2013)."blymphocyte-inducedmaturationprotein1(blimp-1)attenuatesautoimmunediabetesinnodmicebysuppressingth1andth17cells."diabetologia56(1):136-146.

liu,x.,p.k.tian,d.w.ju,m.h.zhang,m.yao,x.t.caoandj.r.gu(2003)."systemicgenetictransferofp21waf-1andgm-csfutilizingofanoveloligopeptide-basedegfreceptortargetingpolyplex."cancergenether10(7):529-539.

london,e.(1992)."diphtheriatoxin:membraneinteractionandmembranetranslocation."biochimbiophysacta1113(1):25-51.

lorieau,j.l.,j.m.louisanda.bax(2010)."thecompleteinfluenzahemagglutininfusiondomainadoptsatighthelicalhairpinarrangementatthelipid:waterinterface."procnatlacadsciusa107(25):11341-11346.

lu,s.j.,q.feng,y.ivanova,c.luo,t.li,f.li,g.r.honigandr.lanza(2007)."recombinanthoxb4fusionproteinsenhancehematopoieticdifferentiationofhumanembryonicstemcells."stemcellsdev16(4):547-559.

luanetal.,(2015).“peptideamphiphileswithmultifunctionalfragmentspromotingcellularuptakeandendosomalescapeasefficientgenevectors.”j.mater.chem.b,3:1068-1078.

mack,m.,b.luckow,p.j.nelson,j.cihak,g.simmons,p.r.clapham,n.signoret,m.marsh,m.stangassinger,f.borlat,t.n.wells,d.schlondorffanda.e.proudfoot(1998)."aminooxypentane-rantesinducesccr5internalizationbutinhibitsrecycling:anovelinhibitorymechanismofhivinfectivity."jexpmed187(8):1215-1224.

maeng,c.h.,j.h.yi,j.lee,j.y.hong,m.k.choi,h.a.jung,j.o.park,s.h.park,y.s.park,w.k.kangandh.y.lim(2013)."effectsofsinglenucleotidepolymorphismsontreatmentoutcomesandtoxicityinpatientstreatedwithsunitinib."anticancerres33(10):4619-4626.

mahlum,e.,d.mandal,c.halder,a.maran,m.j.yaszemski,r.b.jenkins,m.e.bolanderandg.sarkar(2007)."engineeringanoncarriertoahighlyefficientcarrierpeptidefornoncovalentlydeliveringbiologicallyactiveproteinsintohumancells."analbiochem365(2):215-221.

makarovaetal.,(2011).“evolutionandclassificationofthecrispr-cassystems.”natrevmicrobiol.9(6):467-477.

makkerh,j.p.,c.dingwallandr.a.laskey(1996)."comparativemutagenesisofnuclearlocalizationsignalsrevealstheimportanceofneutralandacidicaminoacids."currbiol6(8):1025-1027.

martinez-fong,d.,i.navarro-quiroga,i.ochoa,i.alvarez-maya,m.a.meraz,j.lunaandj.a.arias-montano(1999)."neurotensin-spdp-poly-l-lysineconjugate:anonviralvectorfortargetedgenedeliverytoneuralcells."brainresmolbrainres69(2):249-262.

maurer,m.ande.vonstebut(2004)."macrophageinflammatoryprotein-1."intjbiochemcellbiol36(10):1882-1886.

mckay,t.,p.reynolds,s.jezzard,d.curielandc.coutelle(2002)."secretin-mediatedgenedelivery,aspecifictargetingmechanismwithpotentialfortreatmentofbiliaryandpancreaticdiseaseincysticfibrosis."molther5(4):447-454.

midoux,p.,a.kichler,v.boutin,j.c.maurizotandm.monsigny(1998)."membranepermeabilizationandefficientgenetransferbyapeptidecontainingseveralhistidines."bioconjugchem9(2):260-267.

milenkovic,d.,t.ramming,j.m.muller,l.s.wenz,n.gebert,a.schulze-specking,d.stojanovski,s.rospertanda.chacinska(2009)."identificationofthesignaldirectingtim9andtim10intotheintermembranespaceofmitochondria."molbiolcell20(10):2530-2539.

miyoshi,i.,n.kasaiandy.hayashizaki(1994)."[structureandregulationofhumanthyroid-stimulatinghormone(tsh)gene]."nihonrinsho52(4):940-947.

moede,t.,b.leibiger,h.g.pour,p.berggrenandi.b.leibiger(1999)."identificationofanuclearlocalizationsignal,rrmkwkk,inthehomeodomaintranscriptionfactorpdx-1."febslett461(3):229-234.

montrose,k.,y.yang,x.sun,s.wilesandg.w.krissansen(2013)."xentry,anewclassofcell-penetratingpeptideuniquelyequippedfordeliveryofdrugs."scirep3:1661.

moreland,r.b.,g.l.langevin,r.h.singer,r.l.garceaandl.m.hereford(1987)."aminoacidsequencesthatdeterminethenuclearlocalizationofyeasthistone2b."molcellbiol7(11):4048-4057.

morris,m.c.,l.chaloin,m.choob,j.archdeacon,f.heitzandg.divita(2004)."combinationofanewgenerationofpnaswithapeptide-basedcarrierenablesefficienttargetingofcellcycleprogression."genether11(9):757-764.

morris,m.c.,j.depollier,j.mery,f.heitzandg.divita(2001)."apeptidecarrierforthedeliveryofbiologicallyactiveproteinsintomammaliancells."natbiotechnol19(12):1173-1176.

nakanishi,a.,d.shum,h.morioka,e.otsukaandh.kasamatsu(2002)."interactionofthevp3nuclearlocalizationsignalwiththeimportinalpha2/betaheterodimerdirectsnuclearentryofinfectingsimianvirus40."jvirol76(18):9368-9377.

o'keefe,d.o.(1992)."characterizationofafull-length,active-sitemutantofdiphtheriatoxin."archbiochembiophys296(2):678-684.

parente,r.a.,s.nirandf.c.szoka,jr.(1990)."mechanismofleakageofphospholipidvesiclecontentsinducedbythepeptidegala."biochemistry29(37):8720-8728.

paul,r.w.,k.e.weisser,a.loomis,d.l.sloane,d.lafoe,e.m.atkinsonandr.w.overell(1997)."genetransferusinganovelfusionprotein,gal4/invasin."humgenether8(10):1253-1262.

perez,f.,a.joliot,e.bloch-gallego,a.zahraoui,a.trilleranda.prochiantz(1992)."antennapediahomeoboxasasignalforthecellularinternalizationandnuclearaddressingofasmallexogenouspeptide."jcellsci102(pt4):717-722.

pimenta,d.c.,v.c.chen,j.chao,m.a.julianoandl.juliano(2000)."alpha1-antichymotrypsinandkallistatinhydrolysisbyhumancathepsind."jproteinchem19(5):411-418.

prieve,m.g.andm.l.waterman(1999)."nuclearlocalizationandformationofbeta-catenin-lymphoidenhancerfactor1complexesarenotsufficientforactivationofgeneexpression."molcellbiol19(6):4503-4515.

rajagopalan,r.,j.xavier,n.rangaraj,n.m.raoandv.gopal(2007)."recombinantfusionproteinstat-mu,muandmu-mumediateefficientnon-viralgenedelivery."jgenemed9(4):275-286.

riddelletal.,(2014)“reprogrammingcommittedmurinebloodcellstoinducedhematopoieticstemcellswithdefinedfactors”.cell,157:549-564

rodolphebarrangouandlucianoa.marraffini(2014).‘’crispr-cassystems:prokaryotesupgradetoadaptiveimmunity”.cellvolume54,issue2,p234–244,24april2014.

salomone,f.,f.cardarelli,m.diluca,c.boccardi,r.nifosi,g.bardi,l.dibari,m.serresiandf.beltram(2012)."anovelchimericcell-penetratingpeptidewithmembrane-disruptivepropertiesforefficientendosomalescape."jcontrolrelease163(3):293-303.

salomonef.,cardarellif,signoreg,boccardic,beltramf.(2013)“invitroefficienttransfectionbycm18-tat11hybridpeptide:anewtoolforgene-deliveryapplications.”plosone.8(7):e70108.

schneider,h.,r.p.harbottle,y.yokosaki,j.kunde,d.sheppardandc.coutelle(1998)."anovelpeptide,plaeidgielty,forthetargetingofalpha9beta1-integrins."febslett429(3):269-273.

schreiber,v.,m.molinete,h.boeuf,g.demurciaandj.menissier-demurcia(1992)."thehumanpoly(adp-ribose)polymerasenuclearlocalizationsignalisabipartiteelementfunctionallyseparatefromdnabindingandcatalyticactivity."emboj11(9):3263-3269.

schuster,m.j.,g.y.wu,c.m.waltonandc.h.wu(1999)."multicomponentdnacarrierwithavesicularstomatitisvirusg-peptidegreatlyenhancesliver-targetedgeneexpressioninmice."bioconjugchem10(6):1075-1083.

scott,m.s.,f.m.boisvert,m.d.mcdowall,a.i.lamondandg.j.barton(2010)."characterizationandpredictionofproteinnucleolarlocalizationsequences."nucleicacidsres38(21):7388-7399.

shaw,p.a.,i.r.catchpole,c.a.goddardandw.h.colledge(2008)."comparisonofproteintransductiondomainsinmediatingcelldeliveryofasecretedcreprotein."biochemistry47(4):1157-1166.

shoya,y.,t.kobayashi,t.koda,k.ikuta,m.kakinumaandm.kishi(1998)."twoproline-richnuclearlocalizationsignalsintheamino-andcarboxyl-terminalregionsofthebornadiseasevirusphosphoprotein."jvirol72(12):9755-9762.

somasekaram,a.,a.jarmuz,a.how,j.scottandn.navaratnam(1999)."intracellularlocalizationofhumancytidinedeaminase.identificationofafunctionalnuclearlocalizationsignal."jbiolchem274(40):28405-28412.

stojanovski,d.,m.bohnert,n.pfannerandm.vanderlaan(2012)."mechanismsofproteinsortinginmitochondria."coldspringharbperspectbiol4(10).

sudbeck,p.andg.scherer(1997)."twoindependentnuclearlocalizationsignalsarepresentinthedna-bindinghigh-mobilitygroupdomainsofsryandsox9."jbiolchem272(44):27848-27852.

sung,m.s.,j.y.mun,o.kwon,k.s.kwonandd.b.oh(2013)."efficientmyogenicdifferentiationofhumanadipose-derivedstemcellsbythetransductionofengineeredmyodprotein."biochembiophysrescommun437(1):156-161.

takahashi,k.ands.yamanaka(2006)."inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors."cell126(4):663-676.

takeda,a.,c.goolsbyandn.r.yaseen(2006)."nup98-hoxa9induceslong-termproliferationandblocksdifferentiationofprimaryhumancd34+hematopoieticcells."cancerres66(13):6628-6637.

tan,y.,z.xie,m.ding,z.wang,q.yu,l.meng,h.zhu,x.huang,l.yu,x.mengandy.chen(2010)."increasedlevelsoffoxa1transcriptionfactorinpluripotentp19embryonalcarcinomacellsstimulateneuraldifferentiation."stemcellsdev19(9):1365-1374.

tan,y.x.,c.chen,y.l.wang,s.lin,y.wang,s.b.li,x.p.jin,h.w.gao,f.s.du,f.gongands.p.ji(2012)."truncatedpeptidesfrommelittinanditsanalogwithhighlyticactivityatendosomalphenhancebranchedpolyethylenimine-mediatedgenetransfection."jgenemed14(4):241-250.

uherek,c.,j.fominayaandw.wels(1998)."amodulardnacarrierproteinbasedonthestructureofdiphtheriatoxinmediatestargetcell-specificgenedelivery."jbiolchem273(15):8835-8841.

varkouhi,a.k.,m.scholte,g.stormandh.j.haisma(2011)."endosomalescapepathwaysfordeliveryofbiologicals."jcontrolrelease151(3):220-228.

veach,r.a.,d.liu,s.yao,y.chen,x.y.liu,s.downsandj.hawiger(2004)."receptor/transporter-independenttargetingoffunctionalpeptidesacrosstheplasmamembrane."jbiolchem279(12):11425-11431.

vives,e.,p.brodinandb.lebleu(1997)."atruncatedhiv-1tatproteinbasicdomainrapidlytranslocatesthroughtheplasmamembraneandaccumulatesinthecellnucleus."jbiolchem272(25):16010-16017.

wagstaff,k.m.,d.j.glover,d.j.tremethickandd.a.jans(2007)."histone-mediatedtransductionasanefficientmeansforgenedelivery."molther15(4):721-731.

warr,m.r.,m.binnewies,j.flach,d.reynaud,t.garg,r.malhotra,j.debnathande.passegue(2013)."foxo3adirectsaprotectiveautophagyprograminhaematopoieticstemcells."nature494(7437):323-327.welch,k.,j.franke,m.kohlerandi.g.macara(1999)."ranbp3containsanunusualnuclearlocalizationsignalthatisimportedpreferentiallybyimportin-alpha3."molcellbiol19(12):8400-8411.

wiedenheftetal.,(2011).rna-guidedcomplexfromabacterialimmunesystemenhancestargetrecognitionthroughseedsequenceinteractions.proc.natl.acad.sci.usa108,10092–10097.

witzel,i.,m.graeser,t.karn,m.schmidt,r.wirtz,d.schutze,a.rausch,f.janicke,k.milde-langoschandv.muller(2013)."androgenreceptorexpressionisapredictivemarkerinchemotherapy-treatedpatientswithendocrinereceptor-positiveprimarybreastcancers."jcancerresclinoncol139(5):809-816.

wu,j.,l.zhou,k.tonissen,r.teeandk.artzt(1999)."thequakingi-5protein(qki-5)hasanovelnuclearlocalizationsignalandshuttlesbetweenthenucleusandthecytoplasm."jbiolchem274(41):29202-29210.

wyman,t.b.,f.nicol,o.zelphati,p.v.scaria,c.plankandf.c.szoka,jr.(1997)."design,synthesis,andcharacterizationofacationicpeptidethatbindstonucleicacidsandpermeabilizesbilayers."biochemistry36(10):3008-3017.

yu,z.,c.h.lee,c.chinpaisalandl.n.wei(1998)."aconstitutivenuclearlocalizationsignalfromthesecondzinc-fingeroforphannuclearreceptortr2."jendocrinol159(1):53-60.

zetscheetal.,(2015).“cpf1isasinglerna-guidedendonucleaseofaclass2crispr-cassystem”.cell.25.pii:s0092-8674(15)01200-3[http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038].

zhang,j.k.,j.cui,y.j.lvandh.yan(2006)."[analysisofreasonsforeyetraumainconstructionworkersandvisualacuityaftertreatment]."zhonghualaodongweishengzhiyebingzazhi24(6):371-372.

zhou,h.,s.wu,j.y.joo,s.zhu,d.w.han,t.lin,s.trauger,g.bien,s.yao,y.zhu,g.siuzdak,h.r.scholer,l.duanands.ding(2009)."generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins."cellstemcell4(5):381-384.

序列表

<110>费尔丹生物公司

d·盖

t·戴尔'吉迪斯

j-p·勒珀蒂-斯托弗斯

<120>用于改进多肽负荷向靶真核细胞的细胞质转导的效率的基于多肽的穿梭剂，其用途、及与其相关的方法和试剂盒

<130>016995-0010

<140>未指定

<141>2016-04-08

<150>us62/145,760

<151>2015-04-10

<150>us62/246,892

<151>2015-10-27

<160>103

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18

<400>1

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrgly

<210>2

<211>189

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>白喉毒素t结构域(dt)

<400>2

valglyserserleusercysileasnleuasptrpaspvalilearg

151015

asplysthrlysthrlysilegluserleulysgluhisglyproile

202530

lysasnlysmetsergluserproasnlysthrvalsergluglulys

354045

alalysglntyrleuglugluphehisglnthralaleugluhispro

505560

gluleusergluleulysthrvalthrglythrasnprovalpheala

65707580

glyalaasntyralaalatrpalavalasnvalalaglnvalileasp

859095

sergluthralaaspasnleuglulysthrthralaalaleuserile

100105110

leuproglyileglyservalmetglyilealaaspglyalavalhis

115120125

hisasnthrglugluilevalalaglnserilealaleuserserleu

130135140

metvalalaglnalaileproleuvalglygluleuvalaspilegly

145150155160

phealaalatyrasnphevalgluserileileasnleupheglnval

165170175

valhisasnsertyrasnargproalatyrserprogly

180185

<210>3

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gala

<400>3

trpglualaalaleualaglualaleualaglualaleualagluhis

151015

leualaglualaleualaglualaleuglualaleualaala

202530

<210>4

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pea

<400>4

valleualaglyasnproalalyshisaspleuaspilelysprothr

151015

valileserhisargleuhispheprogluglyglyserleualaala

202530

leuthralahisglnalacyshisleuproleugluthrphethrarg

354045

hisargglnproargglytrpgluglnleugluglncysglytyrpro

505560

valglnargleuvalalaleutyrleualaalaargleusertrpasn

65707580

glnvalaspglnvalileargasnalaleualaserproglysergly

859095

glyaspleuglyglualailearggluglnprogluglnalaargleu

100105110

alaleuthr

115

<210>5

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>inf-7

<400>5

glyleupheglualailegluglypheilegluasnglytrpglugly

151015

metileaspglytrptyrglycys

20

<210>6

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lah4

<400>6

lyslysalaleuleualaleualaleuhishisleualahisleuala

151015

leuhisleualaleualaleulyslysala

2025

<210>7

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hgp

<400>7

leuleuglyargargglytrpgluvalleulystyrtrptrpasnleu

151015

leuglntyrtrpserglngluleu

20

<210>8

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h5wyg

<400>8

glyleuphehisalailealahispheilehisglyglytrphisgly

151015

leuilehisglytrptyrgly

20

<210>9

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ha2

<400>9

glyleupheglyalailealaglypheilegluasnglytrpglugly

151015

metileaspglytrptyrgly

20

<210>10

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>eb1

<400>10

leuileargleutrpserhisleuilehisiletrppheglnasnarg

151015

argleulystrplyslyslys

20

<210>11

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vsvg

<400>11

lysphethrilevalpheprohisasnglnlysglyasntrplysasn

151015

valproserasntyrhistyrcyspro

2025

<210>12

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>假单胞菌毒素

<400>12

gluglyglyserleualaalaleuthralahisglnalacyshisleu

151015

proleugluthrphethrarghisargglnproargglytrpglugln

202530

leugluglncysglytyrprovalglnargleuvalalaleutyrleu

354045

alaalaargleusertrpasnglnvalaspglnvalileargasnala

505560

leualaserproglyserglyglyaspleuglyglualaileargglu

65707580

glnprogluglnalaargleualaleuthrleualaalaalagluser

859095

gluargphevalargglnglythrglyasnaspglualaglyalaala

100105110

asnalaasp

115

<210>13

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蜂毒肽

<400>13

glyileglyalavalleulysvalleuthrthrglyleuproalaleu

151015

ilesertrpilelysarglysargglngln

2025

<210>14

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>kala

<400>14

trpglualalysleualalysalaleualalysalaleualalyshis

151015

leualalysalaleualalysalaleulysalacysgluala

202530

<210>15

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>jst-1

<400>15

glyleupheglualaleuleugluleuleugluserleutrpgluleu

151015

leuleugluala

20

<210>16

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sp

<400>16

alaalavalalaleuleuproalavalleuleualaleuleualapro

151015

<210>17

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tat

<400>17

tyrglyarglyslysargargglnargargarg

1510

<210>18

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>穿膜肽(控制触角的基因)

<400>18

argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys

151015

<210>19

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pvec

<400>19

leuleuileileleuargargargilearglysglnalahisalahis

151015

serlys

<210>20

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>m918

<400>20

metvalthrvalleupheargargleuargileargargalacysgly

151015

proproargvalargval

20

<210>21

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pep-1

<400>21

lysgluthrtrptrpgluthrtrptrpthrglutrpserglnprolys

151015

lyslysarglysval

20

<210>22

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pep-2

<400>22

lysgluthrtrpphegluthrtrpphethrglutrpserglnprolys

151015

lyslysarglysval

20

<210>23

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>xentry

<400>23

leucysleuargprovalgly

15

<210>24

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>精氨酸伸展

<400>24

argargargargargargargargarg

15

<210>25

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>运输蛋白

<400>25

trpthrleuasnseralaglytyrleuleuglylysileasnleulys

151015

alaleualaalaleualalyslysileleu

2025

<210>26

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>synb1

<400>26

argglyglyargleusertyrserargargargpheserthrserthr

151015

glyarg

<210>27

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>synb3

<400>27

argargleusertyrserargargargphe

1510

<210>28

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>e1a

<400>28

lysargproargpro

15

<210>29

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sv40t-ag

<400>29

prolyslyslysarglysval

15

<210>30

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>c-myc

<400>30

proalaalalysargvallysleuasp

15

<210>31

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>op-t-nls

<400>31

serseraspaspglualathralaaspserglnhisalaalapropro

151015

lyslyslysarglysval

20

<210>32

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vp3

<400>32

lyslyslysarglys

15

<210>33

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>核纤溶酶

<400>33

lysargproalaalathrlyslysalaglyglnalalyslyslyslys

151015

<210>34

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白2bnls

<400>34

aspglylyslysarglysargserarglys

1510

<210>35

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>非洲爪蟾n1

<400>35

valarglyslysarglysthrgluglugluserproleulysasplys

151015

aspalalyslysserlysglnglu

20

<210>36

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>parp

<400>36

lysarglysglyaspgluvalaspglyvalaspglucysalalyslys

151015

serlyslys

<210>37

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pdx-1

<400>37

argargmetlystrplyslys

15

<210>38

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>qki-5

<400>38

argvalhisprotyrglnarg

15

<210>39

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hcda

<400>39

lysargproalacysthrleulysproglucysvalglnglnleuleu

151015

valcysserglnglualalyslys

20

<210>40

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h2b

<400>40

glylyslysargserlysala

15

<210>41

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>v-rel

<400>41

lysalalysargglnarg

15

<210>42

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>amida

<400>42

arglysargargarg

15

<210>43

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ranbp3

<400>43

proprovallysarggluargthrser

15

<210>44

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pho4p

<400>44

protyrleuasnlysarglysglylyspro

1510

<210>45

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lef-1

<400>45

lyslyslyslysarglysargglulys

15

<210>46

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tcf-1

<400>46

lyslyslysargargserargglulys

15

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>bdv-p

<400>47

proargproarglysileproarg

15

<210>48

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tr2

<400>48

lysaspcysvalileasnlyshishisargasnargcysglntyrcys

151015

argleuglnarg

20

<210>49

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sox9

<400>49

proargargarglys

15

<210>50

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>max

<400>50

proglnserarglyslysleuarg

15

<210>51

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自tim9的线粒体信号序列

<400>51

asnleuvalgluargcysphethrasp

15

<210>52

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自酵母细胞色素c氧化酶亚单元iv的线粒体信号序列

<400>52

metleuserleuargglnserileargphephelys

1510

<210>53

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自18srrna的线粒体信号序列

<400>53

metleuileserargcyslystrpserargpheproglyasnglnarg

151015

<210>54

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>过氧化物酶体信号序列-pts1

<400>54

serlysleu

1

<210>55

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自birc5的核仁信号序列

<400>55

metglnarglysprothrileargarglysasnleuargleuargarg

151015

lys

<210>56

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自recql4的核仁信号序列

<400>56

lysglnalatrplysglnlystrparglyslys

1510

<210>57

<211>29

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-tat

<400>57

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglytyrglyarglyslysargargglnargargarg

2025

<210>58

<211>34

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-穿膜肽

<400>58

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglyargglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrp

202530

lyslys

<210>59

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-tat

<400>59

methishishishishishislystrplysleuphelyslysilegly

151015

alavalleulysvalleuthrthrglytyrglyarglyslysargarg

202530

glnargargarg

35

<210>60

<211>290

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gfp

<400>60

methishishishishishisglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyalaserthrglythrglyileargmetvalserlysgly

202530

glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly

354045

aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp

505560

alathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylys

65707580

leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval

859095

glncyspheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphephe

100105110

lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrilephephe

115120125

lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly

130135140

aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu

145150155160

aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis

165170175

asnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysvalasn

180185190

phelysilearghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp

195200205

histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro

210215220

aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuserlysaspproasn

225230235240

glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly

245250255

ilethrleuglymetaspgluleutyrlysglyglyserglyglygly

260265270

serglyglyglyserglytrpileargalaserserglyglyargglu

275280285

ileser

290

<210>61

<211>317

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tat-gfp

<400>61

methishishishishishisglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyalaserthrglythrglyarglyslysargargglnarg

202530

argargproproglnglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

354045

glyglythrglyileargmetvalserlysglyglugluleuphethr

505560

glyvalvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhis

65707580

lyspheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylys

859095

leuthrleulyspheilecysthrthrglylysleuprovalprotrp

100105110

prothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserarg

115120125

tyrproasphismetlysglnhisaspphephelysseralametpro

130135140

gluglytyrvalglngluargthrilephephelysaspaspglyasn

145150155160

tyrlysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasn

165170175

argilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleu

180185190

glyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilemet

195200205

alaasplysglnlysasnglyilelysvalasnphelysilearghis

210215220

asnilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasn

225230235240

thrproileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleu

245250255

serthrglnseralaleuserlysaspproasnglulysargasphis

260265270

metvalleuleugluphevalthralaalaglyilethrleuglymet

275280285

aspgluleutyrlysglyglyserglyglyglyserglyglyglyser

290295300

glytrpileargalaserserglyglyarggluileser

305310315

<210>62

<211>327

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>gfp-nls

<400>62

methishishishishishisglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyalaserthrglyileargmetvalserlysglygluglu

202530

leuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspglyaspval

354045

asnglyhislyspheservalserglygluglygluglyaspalathr

505560

tyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylysleupro

65707580

valprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncys

859095

pheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphephelysser

100105110

alametprogluglytyrvalglngluargthrilephephelysasp

115120125

aspglyasntyrlysthrargalagluvallysphegluglyaspthr

130135140

leuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysgluaspgly

145150155160

asnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasnval

165170175

tyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysvalasnphelys

180185190

ilearghisasnilegluaspglyservalglnleualaasphistyr

195200205

glnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleuproaspasn

210215220

histyrleuserthrglnseralaleuserlysaspproasnglulys

225230235240

argasphismetvalleuleugluphevalthralaalaglyilethr

245250255

leuglymetaspgluleutyrlysglyglyserglyglyglysergly

260265270

glyglyserglytrpileargalaserserglyglyargserserasp

275280285

aspglualathralaaspserglnhisalaalaproprolyslyslys

290295300

arglysvalglyglyserglyglyglyserglyglyglyserglygly

305310315320

glyargglythrgluileser

325

<210>63

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>c(llkk)3c

<400>63

cysleuleulyslysleuleulyslysleuleulyslyscys

1510

<210>64

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>g(llkk)3g

<400>64

glyleuleulyslysleuleulyslysleuleulyslysgly

1510

<210>65

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ptd4

<400>65

tyralaargalaalaalaargglnalaargala

1510

<210>66

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tat-cm18

<400>66

tyrglyarglyslysargargglnargargargcyslystrplysleu

151015

phelyslysileglyalavalleulysvalleuthrthrgly

202530

<210>67

<211>42

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tat-kala

<400>67

tyrglyarglyslysargargglnargargargcystrpglualalys

151015

leualalysalaleualalysalaleualalyshisleualalysala

202530

leualalysalaleulysalacysgluala

3540

<210>68

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-ptd4

<400>68

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglytyralaargalaalaalaarggln

202530

alaargala

35

<210>69

<211>33

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-9arg

<400>69

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglyargargargargargargargarg

202530

arg

<210>70

<211>50

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-运输蛋白

<400>70

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglyglytrpthrleuasnseralagly

202530

tyrleuleulysileasnleulysalaleualaalaleualalyslys

354045

ileleu

50

<210>71

<211>43

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-lah4-pdt4

<400>71

hishishishishishislyslysalaleuleualaleualaleuhis

151015

hisleualahisleualaleuhisleualaleualaleulyslysala

202530

tyralaargalaalaalaargglnalaargala

3540

<210>72

<211>31

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-c(llkk)3c-pdt4

<400>72

hishishishishishiscysleuleulyslysleuleulyslysleu

151015

leulyslyscystyralaargalaalaalaargglnalaargala

202530

<210>73

<211>324

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mcherry-nls

<400>73

methishishishishishisglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyalaserthrglyileargmetvalserlyscysgluglu

202530

aspasnmetalaileilelysgluphemetargphelysvalhismet

354045

gluglyservalasnglyhisgluphegluilegluglygluglyglu

505560

glyargprotyrgluglythrglnthralalysleulysvalthrlys

65707580

glyglyproleuprophealatrpaspileleuserproglnphemet

859095

tyrglyserlysalatyrvallyshisproalaaspileproasptyr

100105110

leulysleuserpheprogluglyphelystrpgluargvalmetasn

115120125

phegluaspglyglyvalvalthrvalthrglnaspserserleugln

130135140

aspglyglupheiletyrlysvallysleuargglythrasnphepro

145150155160

seraspglyglnvalmetglnlyslysthrmetglytrpglualaser

165170175

sergluargmettyrprogluaspglyalaleulysglygluilelys

180185190

glnargleulysleulysaspglyglyhistyraspalagluvallys

195200205

thrthrtyrlysalalyslysprovalglnleuproglyalatyrasn

210215220

valasnilelysleuaspilethrserhisasngluasptyrthrile

225230235240

valgluglntyrgluargalagluglyarghisserthrglyglymet

245250255

aspgluleutyrlysglyglyserglyglyglyserglyglyglyser

260265270

glytrpileargalaserserglyglyargserseraspaspgluala

275280285

thralaaspserglnhisalaalaproprolyslyslysarglysval

290295300

glyglyserglyglyglyserglyglyglyserglyglyglyarggly

305310315320

thrgluileser

<210>74

<211>1414

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cas9-nls

<400>74

metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval

151015

glytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslysphe

202530

lysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleuile

354045

glyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrargleu

505560

lysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargilecys

65707580

tyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspaspser

859095

phephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplyslys

100105110

hisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalalatyr

115120125

hisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuvalasp

130135140

serthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleualahis

145150155160

metilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasnpro

165170175

aspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthrtyr

180185190

asnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalaspala

195200205

lysalaileleuseralaargleuserlysserargargleugluasn

210215220

leuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleupheglyasn

225230235240

leuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasnphe

245250255

aspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyrasp

260265270

aspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyralaasp

275280285

leupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuserasp

290295300

ileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuseralaser

305310315320

metilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleulys

325330335

alaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephephe

340345350

aspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyalaser

355360365

glnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmetasp

370375380

glythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleuarg

385390395400

lysglnargthrpheaspasnglyserileprohisglnilehisleu

405410415

glygluleuhisalaileleuargargglngluaspphetyrprophe

420425430

leulysaspasnargglulysileglulysileleuthrpheargile

435440445

protyrtyrvalglyproleualaargglyasnserargphealatrp

450455460

metthrarglysserglugluthrilethrprotrpasnphegluglu

465470475480

valvalasplysglyalaseralaglnserpheilegluargmetthr

485490495

asnpheasplysasnleuproasnglulysvalleuprolyshisser

500505510

leuleutyrglutyrphethrvaltyrasngluleuthrlysvallys

515520525

tyrvalthrgluglymetarglysproalapheleuserglyglugln

530535540

lyslysalailevalaspleuleuphelysthrasnarglysvalthr

545550555560

vallysglnleulysgluasptyrphelyslysileglucyspheasp

565570575

servalgluileserglyvalgluaspargpheasnalaserleugly

580585590

thrtyrhisaspleuleulysileilelysasplysasppheleuasp

595600605

asnglugluasngluaspileleugluaspilevalleuthrleuthr

610615620

leuphegluaspargglumetileglugluargleulysthrtyrala

625630635640

hisleupheaspasplysvalmetlysglnleulysargargargtyr

645650655

thrglytrpglyargleuserarglysleuileasnglyileargasp

660665670

lysglnserglylysthrileleuasppheleulysseraspglyphe

675680685

alaasnargasnphemetglnleuilehisaspaspserleuthrphe

690695700

lysgluaspileglnlysalaglnvalserglyglnglyaspserleu

705710715720

hisgluhisilealaasnleualaglyserproalailelyslysgly

725730735

ileleuglnthrvallysvalvalaspgluleuvallysvalmetgly

740745750

arghislysprogluasnilevalileglumetalaarggluasngln

755760765

thrthrglnlysglyglnlysasnserarggluargmetlysargile

770775780

glugluglyilelysgluleuglyserglnileleulysgluhispro

785790795800

valgluasnthrglnleuglnasnglulysleutyrleutyrtyrleu

805810815

glnasnglyargaspmettyrvalaspglngluleuaspileasnarg

820825830

leuserasptyraspvalasphisilevalproglnserpheleulys

835840845

aspaspserileaspasnlysvalleuthrargserasplysasnarg

850855860

glylysseraspasnvalproserglugluvalvallyslysmetlys

865870875880

asntyrtrpargglnleuleuasnalalysleuilethrglnarglys

885890895

pheaspasnleuthrlysalagluargglyglyleusergluleuasp

900905910

lysalaglypheilelysargglnleuvalgluthrargglnilethr

915920925

lyshisvalalaglnileleuaspserargmetasnthrlystyrasp

930935940

gluasnasplysleuilearggluvallysvalilethrleulysser

945950955960

lysleuvalseraspphearglysasppheglnphetyrlysvalarg

965970975

gluileasnasntyrhishisalahisaspalatyrleuasnalaval

980985990

valglythralaleuilelyslystyrprolysleuglusergluphe

99510001005

valtyrglyasptyrlysvaltyraspvalarglysmetileala

101010151020

lyssergluglngluileglylysalathralalystyrphephe

102510301035

tyrserasnilemetasnphephelysthrgluilethrleuala

104010451050

asnglygluilearglysargproleuilegluthrasnglyglu

105510601065

thrglygluilevaltrpasplysglyargaspphealathrval

107010751080

arglysvalleusermetproglnvalasnilevallyslysthr

108510901095

gluvalglnthrglyglypheserlysgluserileleuprolys

110011051110

argasnserasplysleuilealaarglyslysasptrpasppro

111511201125

lyslystyrglyglypheaspserprothrvalalatyrserval

113011351140

leuvalvalalalysvalglulysglylysserlyslysleulys

114511501155

servallysgluleuleuglyilethrilemetgluargserser

116011651170

pheglulysasnproileasppheleuglualalysglytyrlys

117511801185

gluvallyslysaspleuileilelysleuprolystyrserleu

119011951200

phegluleugluasnglyarglysargmetleualaseralagly

120512101215

gluleuglnlysglyasngluleualaleuproserlystyrval

122012251230

asnpheleutyrleualaserhistyrglulysleulysglyser

123512401245

progluaspasngluglnlysglnleuphevalgluglnhislys

125012551260

histyrleuaspgluileilegluglnileserglupheserlys

126512701275

argvalileleualaaspalaasnleuasplysvalleuserala

128012851290

tyrasnlyshisargasplysproilearggluglnalagluasn

129513001305

ileilehisleuphethrleuthrasnleuglyalaproalaala

131013151320

phelystyrpheaspthrthrileasparglysargtyrthrser

132513301335

thrlysgluvalleuaspalathrleuilehisglnserilethr

134013451350

glyleutyrgluthrargileaspleuserglnleuglyglyasp

135513601365

glyglyargserseraspaspglualathralaaspserglnhis

137013751380

alaalaproprolyslyslysarglysvalglyglyserglygly

138513901395

glyserglyglyglyserglyglyglyarghishishishishis

140014051410

his

<210>75

<211>42

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>crrna(实施例13.3)

<400>75

gaguccgagcagaagaagaaguuuuagagcuaugcuguuuug42

<210>76

<211>69

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>tracrrna(实施例13.3)

<400>76

aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccga60

gucggugcu69

<210>77

<211>69

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>tracrrna(实施例13.5)

<400>77

aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccga60

gucggugcu69

<210>78

<211>42

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>ppibcrrna(实施例13.5)

<400>78

guguauuuugaccuacgaauguuuuagagcuaugcuguuuug42

<210>79

<211>74

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>ppibtracrrna(实施例13.5)

<400>79

aacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgag60

ucggugcuuuuuuu74

<210>80

<211>246

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hoxb4-wt

<400>80

methishishishishishismetalametserserpheleuileasn

151015

serasntyrvalaspprolyspheproprocysgluglutyrsergln

202530

serasptyrleuproserasphisserproglytyrtyralaglygly

354045

glnargarggluserserpheglnproglualaglypheglyargarg

505560

alaalacysthrvalglnargtyrpropropropropropropropro

65707580

proproglyleuserproargalaproalaproproproalaglyala

859095

leuleuprogluproglyglnargcysglualavalserserserpro

100105110

proproproprocysalaglnasnproleuhisproserproserhis

115120125

seralacyslysgluprovalvaltyrprotrpmetarglysvalhis

130135140

valserthrvalasnproasntyralaglyglygluprolysargser

145150155160

argthralatyrthrargglnglnvalleugluleuglulysgluphe

165170175

histyrasnargtyrleuthrargargargargvalgluilealahis

180185190

alaleucysleusergluargglnilelysiletrppheglnasnarg

195200205

argmetlystrplyslysasphislysleuproasnthrlysilearg

210215220

serglyglyalaalaglyseralaglyglyproproglyargproasn

225230235240

glyglyproargalaleu

245

<210>81

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-ptd4

<400>81

hishishishishishistyralaargalaalaalaargglnalaarg

151015

ala

<210>82

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ptd4-kala

<400>82

tyralaargalaalaalaargglnalaargalatrpglualalysleu

151015

alalysalaleualalysalaleualalyshisleualalysalaleu

202530

alalysalaleulysalacysgluala

3540

<210>83

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>9arg-kala

<400>83

argargargargargargargargargtrpglualalysleualalys

151015

alaleualalysalaleualalyshisleualalysalaleualalys

202530

alaleulysalacysgluala

35

<210>84

<211>51

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pep1-kala

<400>84

lysgluthrtrptrpgluthrtrptrpthrglutrpserglnprolys

151015

lyslysarglysvaltrpglualalysleualalysalaleualalys

202530

alaleualalyshisleualalysalaleualalysalaleulysala

354045

cysgluala

50

<210>85

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>xentry-kala

<400>85

leucysleuargprovalglytrpglualalysleualalysalaleu

151015

alalysalaleualalyshisleualalysalaleualalysalaleu

202530

lysalacysgluala

35

<210>86

<211>40

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>synb3-kala

<400>86

argargleusertyrserargargargphetrpglualalysleuala

151015

lysalaleualalysalaleualalyshisleualalysalaleuala

202530

lysalaleulysalacysgluala

3540

<210>87

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vsvg-ptd4

<400>87

lysphethrilevalpheprohisasnglnlysglyasntrplysasn

151015

valproserasntyrhistyrcysprotyralaargalaalaalaarg

202530

glnalaargala

35

<210>88

<211>34

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>eb1-ptd4

<400>88

leuileargleutrpserhisleuilehisiletrppheglnasnarg

151015

argleulystrplyslyslystyralaargalaalaalaargglnala

202530

argala

<210>89

<211>31

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>jst-ptd4

<400>89

glyleupheglualaleuleugluleuleugluserleutrpgluleu

151015

leuleuglualatyralaargalaalaalaargglnalaargala

202530

<210>90

<211>29

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-ptd4

<400>90

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglytyralaargalaalaalaargglnalaargala

2025

<210>91

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>6cys-cm18-ptd4

<400>91

cyscyscyscyscyscyslystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglytyralaargalaalaalaarggln

202530

alaargala

35

<210>92

<211>32

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-l1-ptd4

<400>92

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglyglyglysertyralaargalaalaalaargglnalaargala

202530

<210>93

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-l2-ptd4

<400>93

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglyglyglyserglyglyglysertyralaargalaalaalaarg

202530

glnalaargala

35

<210>94

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-l3-ptd4

<400>94

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglyglyglyserglyglyglyserglyglyglyserglytyrala

202530

argalaalaalaargglnalaargala

3540

<210>95

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-tat

<400>95

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglytyrglyarglyslysargarggln

202530

argargarg

35

<210>96

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-ptd4-6cys

<400>96

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglytyralaargalaalaalaarggln

202530

alaargalacyscyscyscyscyscys

3540

<210>97

<211>32

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3his-cm18-ptd4

<400>97

hishishislystrplysleuphelyslysileglyalavalleulys

151015

valleuthrthrglytyralaargalaalaalaargglnalaargala

202530

<210>98

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>12his-cm18-ptd4

<400>98

hishishishishishishishishishishishislystrplysleu

151015

phelyslysileglyalavalleulysvalleuthrthrglytyrala

202530

argalaalaalaargglnalaargala

3540

<210>99

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ha-cm18-ptd4

<400>99

hishishisalahishishislystrplysleuphelyslysilegly

151015

alavalleulysvalleuthrthrglytyralaargalaalaalaarg

202530

glnalaargala

35

<210>100

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3ha-cm18-ptd4

<400>100

hisalahishisalahishisalahislystrplysleuphelyslys

151015

ileglyalavalleulysvalleuthrthrglytyralaargalaala

202530

alaargglnalaargala

35

<210>101

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cm18-his-ptd4

<400>101

lystrplysleuphelyslysileglyalavalleulysvalleuthr

151015

thrglyhishishishishishistyralaargalaalaalaarggln

202530

alaargala

35

<210>102

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>his-cm18-ptd4-his

<400>102

hishishishishishislystrplysleuphelyslysileglyala

151015

valleulysvalleuthrthrglytyralaargalaalaalaarggln

202530

alaargalahishishishishishis

3540

<210>103

<211>36

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>hprtcrrna

<400>103

aauuauggggauuacuaggaguuuuagagcuaugcu36