本发明涉及由3-羟基丙酸(3-hp)诱导表达的启动子系统以及用于生物生产3-hp的方法。
背景技术：
：3-羟基丙酸(3-hp)是用于各种化学过程中的重要合成中间体，作为原料用于生产丙烯酸、丙烯酰胺、1,3-丙二醇、丙二酸等。3-hp也被用于合成可生物降解的聚合物。通过对各种细菌中3-hp生产途径所需的关键酶进行基因工程化，成功实现了使用甘油进行的3-hp生物生产。具体而言，已经证实了在诸如大肠杆菌(escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、脱氮假单胞菌(pseudomonasdenitrificans)等细菌中，通过基因工程(过)表达甘油脱水酶(一种辅酶b12依赖性酶)、dhab再激活酶(dhabreactivase)(一种甘油脱水酶的再激活酶)和乙醛脱氢酶(一种nad+依赖性酶)等来生产3-hp。一些重组菌株(包括大肠杆菌wdubgk)能够在48小时内生产超过40g/l3-hp，但很难在此基础上再提高3-hp生产。尤其是，观察到随着3-hp生产的发酵时间持续，发生了酶(例如甘油脱水酶和乙醛脱氢酶)变得不稳定或失去活性的问题。就此而言，甘油脱水酶活性消失的一个重要原因在于被称为自杀失活(suicidalinactivation)的机制。在这种机制下，在从甘油到3-羟基丙醛(3-hpa)的脱水反应中，辅酶b12(甘油脱水酶的辅酶)受到不可逆的损伤，并且在存在氧的情况下此类失活反应得到促进。近年来，为了减轻基于上述机制的失活，已经根据定点突变开发出了突变型甘油脱水酶。已经发现几种突变酶具有改善的酶稳定性，但是当与常规的酶相比时，仍观察到其酶活性显著降低。上述问题的另一个原因在于3-hpa(高反应性中间产物)的毒性。当甘油脱水酶或乙醛脱氢酶与3-hpa一起存在时，甘油脱水酶或乙醛脱氢酶的活性随着3-hpa的浓度而降低。已知乙醛与分别存在于赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸中的氨基酸残基(例如ε-氨基酸(nh3+)、巯基(-c-sh)和咪唑基)进行反应。已经尝试使用定点突变和随机突变来提高在乙醛存在时许多酶的稳定性，但成功的情况却很有限。解决这些酶变得不稳定的问题的一个有趣的替代方法是在整个细胞培养期间连续地合成具有活性的新酶。从理论上讲，如果能够提供与变得不稳定的酶一样多的新酶，那么细胞中酶的酶活性可以保持不变。特别地，在发酵后期由于高浓度3-hp的存在而导致细胞生长减慢并且细胞总代谢活性降低的时候，需要连续地表达酶。技术实现要素：技术问题本发明提供了针对3-羟基丙酸(3-hp)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-hp或其衍生物具有反应性的lysr蛋白的结合位点。本发明还提供了对3-hp或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒，所述重组基因表达盒包含：编码lysr蛋白(对3-hp或其衍生物具有反应性)的lysr基因、含有lysr蛋白结合位点的启动子、以及编码目标表达蛋白的基因。技术方案为了解决上述技术问题，本发明提供了针对3-羟基丙酸(3-hp)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-hp或其衍生物具有反应性的lysr蛋白的结合位点。另外，本发明涉及包含所述针对3-hp或其衍生物的诱导型启动子的重组表达载体、经所述重组表达载体转化的重组微生物、以及生产3-hp的方法(所述方法包括对所述重组微生物进行培养)。此外，本发明提供了对3-hp或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒，所述重组基因表达盒包含：编码lysr蛋白(对3-hp或其衍生物具有反应性)的lysr基因、含有lysr蛋白结合位点的启动子、以及编码目标表达蛋白的基因。另外，本发明提供了包含所述对3-hp或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒的重组表达载体、经所述重组表达载体转化的重组微生物、包含所述重组基因表达盒(其对3-hp或其衍生物具有反应性，被插入宿主细胞的染色体中)的重组微生物、以及生产目标表达蛋白的方法(所述方法包括对所述重组微生物进行培养)。有益效果本发明涉及由3-羟基丙酸(3-hp)诱导表达的启动子系统和使用该启动子系统生物生产3-hp的方法。为了以生物学方式提高3-hp生产，需要连续地合成具有酶活性的新酶。作为对来自几种微生物(包括脱氮假单胞菌)的3-hp反应性转录调节因子和3-hp反应性启动子进行筛选的结果，证实了这些转录调节因子和启动子由lysr蛋白和结合至lysr蛋白的特定基因核苷酸序列组成。因此，预期所述3-hp诱导系统将有效地用于调节3-hp代谢途径。附图说明图1示出了增殖细胞中3-羟基丙酸(3-hp)的生产(a)和3-hp的降解(b)。在补充有25±2mmol/l3-hp作为单一碳源和能量源的m9培养基中培养用于进行3-hp生产测试的脱氮假单胞菌菌株。同时，通过在补充有25±2mmol/l3-hp的m9培养基中进行培养来制备用于进行3-hp降解测试的脱氮假单胞菌静息细胞。此处，3-hp浓度测量值的标准偏差计算为10％以下。符号：实心圆，3-hp；左半圆，细胞质量；十字，ph。图2示出3-hp的两条代谢途径(氧化途径和还原途径)。缩写：3-hpdh，3-羟基丙酸脱氢酶；3-hibdh，3-羟基异丁酸脱氢酶；mmsadh，甲基丙二酸半醛脱氢酶；hpcs，3-羟基丙酰-coa合成酶。图3示出了就3-羟基丙酸分解代谢物(catabolite)基因而言脱氮假单胞菌atcc13867中的相对mrna表达水平(a)以及倍数增加(b)。图3(a)示出了由在补充有25mmol/l3-hp的m9培养基中培养脱氮假单胞菌获得的结果(以灰色柱显示)和由在没有补充3-hp的m9培养基中培养脱氮假单胞菌获得的结果(以黑色柱显示)。图3(b)示出了取决于3-hp供给的mrna表达水平差异的结果(以灰色柱显示)，其中结果以倍数增加进行表示。此处，mrna水平测量值的标准偏差计算为10％以下。此处，使用rpod基因作为参考基因来比较mrna表达水平。图4示出了基因(即mmsadh(黑色显示)和3hibdhiv(灰色显示))的表达。除3-hp之外，3-羟基异丁酸(3hib)、3-羟基丁酸(3-hb)、l-缬氨酸等也作为诱导物起作用。图5示出了基因3hpdh的表达。除3-hp之外，3hib、3-hb、l-缬氨酸等也作为诱导物起作用。图6示出了启动子系统基因序列及其结构，该启动子系统由3-hp进行诱导。图6a示出了mmsadh基因和3hibdh基因以及调控mmsadh和3hibdh的基因转录的lysr蛋白(c4-lysr)基因的位置。图6b示出了3hpdh基因以及调控3hpdh的基因转录的lysr蛋白(c3-lysr)基因的位置。图7示出了c4-lysr基因的诱导型启动子的分析结果。基因(例如c4-lysr(由mmsr表示)和mmsadh(由mmsa表示))之间的o1操纵子和o2操纵子各自存在于相对于mmsadh转录起始位点(作为标准)的-58位置和-9位置处，并且各自包含反向重复序列。对构成o1和o2各自的反向重复序列进行分析的结果是，aacgtgtaa序列是保守的。图8示出了lysr家族转录调节因子的调控机制。图9示出了在lysr蛋白中高度保守的氨基酸序列。氨基酸的位置集中在c4-lysr蛋白上。然而，对所有源自本发明使用的菌株的lysr蛋白而言，dna结合结构域或底物结合结构域中保守的氨基酸序列是相同的。图10示出了使用如下伴侣质粒(chaperonplasmid)对具有c-his标签的c4-lysr的溶解性进行分析的sds-page结果：pg-kje8(a)、pgro7(b)、pkje7(c)、pg-tf2(d)和ptf16(e)。在25℃的温度下在lb培养基中培养大肠杆菌bl21的基因工程化菌株，用0.1mmiptg进行诱导，并在4小时或12小时内进行收集。此处，蓝色箭头表示c4-lysr蛋白的大小34.4kda。图11示出了纯化的c4-lysr蛋白的sds-page和非变性page分析结果。图11(a)示出了通过变性sds-page得到的纯化结果，其中泳道1表示野生型(粗)的结果；泳道2表示(-)iptg的结果；泳道3、泳道4、泳道5和泳道7分别表示无细胞部分、可溶部分、不可溶部分以及纯化部分的结果；以及泳道6示出蛋白质分子量标记的结果。图11(b)示出了非变性page分析结果，其中泳道8、泳道10和泳道12表示蛋白质分子量标记的结果；以及泳道9、泳道11和泳道13分别表示以65nm、220nm和550nm的浓度上样的纯化的c4-lysr蛋白的结果。图12示出了c4-lysr浓度和3-hp对c4-lysr蛋白与其启动子区域之间的dna片段的结合的影响。图12(a)示出了在实验中使用的启动子的dna片段序列，其中f12表示包含o1和o2二者的片段；f12m表示仅包含o1操纵子的片段；f1m2表示仅包含o2操纵子的片段；f1m2m表示o1和o2都被删除的片段，而且实验中使用的dna片段具有135bp的相同长度。图12(b)示出了由对c4-lysr蛋白与其启动子区域之间的dna片段的体外结合进行分析获得的电泳迁移位移实验(electromobilityshiftassay，emsa)的结果，其中上图示出了在缺少3-hp的情况下进行电泳的结果；下图示出了在存在25mm3-hp的情况下进行电泳的结果，在泳道1-泳道9中，c4-lysr蛋白的浓度从0nm逐渐增加至0.36nm、0.73nm、1.45nm、2.9nm、5.8nm、11.6nm、14.5nm和24.2nm；在泳道10-泳道15中，c4-lysr蛋白的浓度从0nm逐渐增加至2.9nm、5.8nm、11.6nm、14.5nm和24.2nm；在泳道16-泳道21中，c4-lysr蛋白的浓度从0nm逐渐增加至2.9nm、11.6nm、24.2nm和72.7nm。图12(c)示出了c4-lysr蛋白与其启动子区域之间的dna片段的结合亲和力的定量结果，其中亲和力是指解离常数(kd)，即，一半的dna片段由结合c4-lysr蛋白所需的蛋白质的浓度表示。图13示出了脱氮假单胞菌atcc13867与各种微生物之间的参与3-hp降解途径的基因群的结构对比。图14和图15示出了包含在lysr区域中的n末端hth的多个序列排列。c4-lysr(图14)；c3-lysr(图15)。图16示出了为在脱氮假单胞菌中表达甘油脱水酶和kgsadh而开发的pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh质粒。图17示出了比较pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)菌株(o1、o2和o3)和pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)菌株(s1、s2和s3)的葡萄糖和甘油消耗、细胞生长、3-hp生产以及ph变化的结果。(o1和s1)，无甘油；(o2和s2)，25mg/lcocl2·6h2o加入培养基中；(o3和s3)，12μmol/l辅酶b12加入培养基中。在3小时时加入100mm甘油。图18示出了使用pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)和pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)的细胞裂解物来比较甘油脱水酶和kgsadh的时间依赖性失活的结果。图19示出了在补料分批(fed-batch)生物反应器操作之后甘油和葡萄糖消耗、生物质(biomass)和3-hp生产的时间依赖性变化：(a)重组pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)和(b)pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)。具体实施方式因此，就有效地维持3-羟基丙酸(3-hp)生成酶的表达而言，本发明的发明人发现了在各种微生物中由3-hp诱导表达的特异性基因转录启动子系统，然后检验了该启动子系统的遗传特征和生化特征。该启动子系统是从未在文献中报道过的罕见系统，由与3-hp结合的转录激活蛋白和特异性地结合至该转录激活蛋白的dna序列组成。本发明的发明人开发了一种重组菌株，该重组菌株通过使用该启动子系统来过表达dhab、gdrab和kgsadh，能够从甘油高浓度地生产3-hp，从而完成了本发明。本发明提供了针对3-hp或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-hp或其衍生物具有反应性的lysr蛋白的结合位点。另外，本发明提供了包含所述针对3-hp或其衍生物的诱导型启动子的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体可进一步包含编码与所述针对3-hp或其衍生物的诱导型启动子连接的外源蛋白的基因。更优选地，所述外源蛋白可为甘油脱水酶(dhab)、dhab再激活酶(gdrab)或α-酮戊二酸半醛脱氢酶(kgsadh)，但本公开的实施方式不限于此。另外，本发明提供了经所述重组表达载体转化的重组微生物。优选地，所述重组微生物具有3-hp生产性。更优选地，所述重组微生物可为脱氮假单胞菌，并且更优选地，所述重组微生物可为在脱氮假单胞菌菌株中删除了涉及3-hp降解的3hpdh基因、3hibdh基因和mmsadh基因的脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi的菌株，但本公开的实施方式不限于此。此外，本发明提供了生产3-hp的方法，所述方法包括对所述重组微生物进行培养。此外，本发明提供了对3-hp或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒，所述重组基因表达盒包含编码lysr蛋白(对3-hp或其衍生物具有反应性)的lysr基因、具有lysr蛋白结合位点的启动子、以及编码目标表达蛋白的基因。此外，本发明提供了包含所述重组基因表达盒(对3-hp或其衍生物具有反应性)的重组表达载体以及经所述重组表达载体转化的重组微生物。此外，本发明提供了包含所述重组基因表达盒的重组微生物，所述重组基因表达盒对3-hp或其衍生物具有反应性，被插入到宿主细胞的染色体中。对本领域普通技术人员而言显而易见的是，即使将所述重组基因表达盒插入到宿主细胞的基因组中，也具有与将所述重组载体导入宿主细胞的情况相同的效果。在本发明中，作为将重组基因表达盒插入宿主细胞染色体的方法，可使用本领域已知的任何基因工程方法。在一个实施方式中，可使用应用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体或非病毒载体的方法。此外，本发明提供了一种生产目标表达蛋白的方法，所述方法包括对所述重组微生物进行培养。优选地，对所述重组微生物进行培养可进一步包括添加3-hp。优选地，所述lysr蛋白或启动子可来自具有3-hp降解性的微生物。更优选地，所述微生物可为脱氮无色杆菌(achromobacterdenitrificans)、燕麦食酸菌亚种(acidovoraxavenaesubsp)、食酸菌属(acidovoraxsp.)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)、农杆菌属(agrobacteriumsp.)、粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)、红灯食烷菌(alcanivoraxhongdengensis)、alicycliphilusdenitrificans、海洋交替单胞菌(alteromonasmarina)、拟无枝酸菌(amycolatopsissp.)、anaeromyxobacterdehalogenans、巴西固氮螺菌(azospirillumbrasilense)、棕色固氮菌(azotobactervinelandii)、印度拜耶林克氏菌(beijerinckiaindica)、鸟博德特氏菌(bordetellaavium)、日本慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、burkholderiaambifaria、catenulisporaacidiphilia、柄杆菌属(caulobactersp.)、castellanielladefragrans、紫色色杆菌(chromobacteriumviolaceum)、collimonasarenae、睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastestosteroni)、corynebacteriumvitaeruminis、cupriavidusnecator、curvibactergracilus、食酸戴尔福特菌(delftiaacidovorans)、ferrimonasbalearica、glaciecolanitratireducens、支气管戈登菌(gordoniabronchialis)、hahellachijuensis、伸长盐单胞菌(halomonaselongata)、hirschialitorea、idiomarinasp.、janthinobacteriumlividum、刚毛北里孢菌(kitasatosporasetae)、kutzneriaalbida、甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)、甲基孢囊菌属(methylocystissp.)、新鞘氨醇杆菌属(novosphingobiumsp.)、oceanimonassmirnovii、副球菌属(paracoccussp.)、parvibaculumlavamentivorans、phenylobacteriumkunshanensis、photobacteriumgaetbuleda、polynucleobacternecessariusasymbioticus、pseudoalteromonascarrageenovora、pseudogulbenkianiasp.、脱氮假单胞菌atcc13867、p.knackmussii、p.protegens、荧光假单胞菌(p.fluorescens)、pseudoxanthomonasspadix、psychrobacterphenylpyruvicus、ralstoniaoxalatica、rhodomicrobiumvannielli、segniliparusrotundus、shewanellaoneidensis、simiduiaagarovorans、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、sphingobiumchlorophenolicum、sphingomonaswittichii、sphingopyxisalaskensis、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、结节链霉菌(streptomycesnodosus)、tatlockiamicdadei、厦门海旋菌(thalassospiraxiamenensis)、奇异贪噬菌(variovoraxparadoxus)、verminephrobactereiseniae、弗尼斯弧菌(vibriofurnissii)、自养黄色杆菌(xanthobacterautotrophicus)、xanthomonascampestri以及水稻黄单胞菌(xanthomonasoryzae)，但是本公开的实施方式不限于此。优选地，所述lysr蛋白可具有：具有螺旋-转角-螺旋结构并与dna结合的n末端结构域、与3-hp或其衍生物结合的c末端结构域以及有助于稳定lysr蛋白二聚体的c末端结构域，但是本公开的实施方式不限于此。更优选地，所述具有螺旋-转角-螺旋结构并与dna结合的n末端结构域可包含由seqidno：1或seqidno：2表示的氨基酸序列；所述与3-hp或其衍生物结合的c末端结构域可包含由seqidno：3表示的氨基酸序列；所述有助于稳定lysr蛋白二聚体的c末端结构域可包含由seqidno：4表示的氨基酸序列，但是本公开的实施方式不限于此。在seqidno：1-seqidno：4中描述的“x”或“xaa”不是指特定氨基酸，而是意味着可使用任何氨基酸。更优选地，所述lysr蛋白可为具有由表4和表5表示的genbankid的lysr蛋白，但是本公开的实施方式不限于此。优选地，lysr的结合位点可包含彼此结合的两个lysr蛋白二聚体，并且可包含选自于seqidno：5-seqidno：43的碱基序列，其中，反向重复序列和与之配对的另一反向重复序列可在所述lysr蛋白的结合位点中重复两次，其中所述反向重复序列可由选自于seqidno：5-seqidno：43之一表示的碱基序列组成，但是本公开的实施方式不限于此。更优选地，所述lysr蛋白的结合位点可由seqidno：44或seqidno：45表示的碱基序列组成。在seqidno：5-seqidno：43中描述的“n”不是指特定碱基，而是意味着可使用任何碱基。seqidno：44或seqidno：45可为来自于脱氮假单胞菌atcc13867的启动子碱基序列。优选地，所述衍生物可为3-羟基异丁酸(3hib)或3-羟基丁酸(3-hb)，但是本公开的实施方式不限于此。如本文所用的术语“载体”是指用于携带克隆基因(或克隆dna的其它片段)的自我复制型dna分子。如本文所用的术语“表达载体”是指包含期望的编码序列和合适的核酸序列的重组dna分子，所述核酸序列对表达可操作地连接至特定宿主生物体的编码序列而言是必需的。所述表达载体可包含至少一个选择标记。所述标记可为具有通常可通过化学方法进行筛选的特征的核酸序列，并可包括能够将转化细胞和未转化细胞区分开的所有基因。所述标记的实例包括抗生素抗性基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素和氯霉素，但是本公开的实施方式不限于此。本领域普通技术人员可适当地选择这样的标记。实施例下文中将通过实施例和比较实施例来进一步详细描述本发明的构思。然而，这些实施例仅是用于说明目的，并不限制本发明构思的范围。<实施例1>通过3-hp进行的基因表达系统的识别1.材料包括脱氮无色杆菌和鲍氏不动杆菌在内的许多菌株从韩国微生物培养中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)获得。包括燕麦食酸菌亚种和农杆菌属在内的许多菌株从韩国典型培养物保藏中心(koreancollectionfortypecultures，kctc)购得。包括alicycliphilusdenitrificans和anaeromyxobacterdehalogenans在内的许多菌株从德国dsm获得。包括嗜水气单胞菌和脱氮假单胞菌atcc13867在内的许多菌株从美国atcc购得。引物由cosmogenetech(首尔，韩国)合成。3-hp购自日本tokyokaseikogyo(tci美国，portland，or)。从difco(bectondickinson；franklinlakes，nj)购得酶提取物(货号212750)和胰蛋白胨(货号211705)。所有未提及的化学制剂和酶均购自sigmaaldrich(st.louis，mo)。2.增殖细胞中的3-hp生产和休眠细胞中的3-hp降解摇瓶实验以30ml的体积在250ml无挡板erlenmeyer烧瓶中在振荡培养箱中以37℃的温度和200rpm的搅拌速度进行。脱氮假单胞菌的3-hp生产实验在以下条件下进行：将具有30ml的改良体积的m9培养基添加到250ml无挡板erlenmeyer烧瓶中，用于在振荡培养箱中以37℃的温度和200rpm的搅拌速度进行培养。此处，用于培养菌株的改良m9培养基的组成成分包含：100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)、0.25g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/lnh4cl和25mm3-hp。对休眠细胞进行实验以在总共69种微生物(包括脱氮假单胞菌)中研究3-hp降解，实验中使用的细菌示于表1中。为了制备活化细胞，将3-hp添加到特异性针对各种菌株的富含营养物的培养基中，然后以50ml的体积在250ml无挡板erlenmeyer烧瓶中进行培养。在37℃的温度下进行菌株培养，当细胞的od600达到约1-1.5时，以5,000rpm的速度离心10分钟收集细胞。用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)洗涤沉淀的细胞，然后重悬于含有25±2mmol/l3-hp的相同缓冲液中。在3-hp降解实验之前进行上述的细胞收集、洗涤和重悬步骤。定期取样以调查3-hp的浓度。[表1]本发明中使用的菌株3.rna提取和逆转录聚合酶链式反应使用m9培养基对脱氮假单胞菌菌株(atcc13867)进行培养，并使用各种菌株所规定的营养培养基对表1中所示的其它微生物进行培养。然后，当检查3-hp的作用时，将25mm3-hp添加到本文提供的培养基中。在有氧条件下在37℃的温度和200rpm的搅拌速度下在振荡培养箱中培养所有菌株，待培养细胞达到指数生长期后，收集细胞。以约5×108的量收集细胞后，将其以5,000g离心10分钟。然后，将500μlrnalater溶液(ambion，uk)立即加入沉淀的细胞中，然后重悬混合溶液。通过使用总rna分离试剂盒(macherey-nagel，德国)来提取rna。将1μg总rna用于合成20μl第一链cdna，并使用由invitrogen提供的superscriptiii第一链合成系统来合成cdna。利用onerealtimepcr系统(appliedbiosystems，usa)，通过使用sybrgreen步骤来进行逆转录聚合酶链式反应。在用于逆转录聚合酶链式反应的反应液(20μl)中，含有300ngcdna、10μl2×powersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems，uk)、5pmol正向引物和反向引物以及depc处理的水。将逆转录聚合酶链式反应的条件确定为如下：变性，95℃30秒，1个循环；扩增，95℃15秒、62℃30秒、72℃30秒，40个循环。在进行逆转录聚合酶链式反应之前，为了测定mrna水平，进行pcr来确认实验中使用的引物的效果，并根据δδct法来计算mrna水平的相对定量。4.lysr蛋白的基因克隆、蛋白质生产和分离纯化在脱氮假单胞菌的情况中，存在参与3-hp降解的2个操纵子(即3hpdh(下文称为c3系统)和3hibdh-iv(下文称为c4系统))，还存在调节所述操纵子转录的lysr蛋白(如c3-lysr和c4-lysr)。在这些蛋白质中，针对c4-lysr尝试了蛋白质生产。使用大肠杆菌bl21(de3)作为宿主，并使用大肠杆菌菌株top10克隆和维持质粒。通过pcr在脱氮假单胞菌基因组中扩增c4lysr基因，将其克隆到pet30b(+)质粒中，并加到大肠杆菌菌株top10中以确认序列，随后加到大肠杆菌bl21(de3)中。为了蛋白质纯化，在c末端位点处标记his标签。为了以活性可溶形式表达lysr蛋白，将lysr蛋白与几种伴侣质粒(如pg-kje8、pgro7、pg-tf2和ptf-16)一起共表达。使用适当补充有卡那霉素、氯霉素、l-阿拉伯糖等的lb培养基作为培养基，并在有氧条件下进行培养。当细胞浓度达到od为0.6时，加入0.1mmiptg来诱导lysr蛋白的生产。为了lysr蛋白的水溶性表达，检查了各种培养条件，最终，将lysr蛋白在25℃的温度和150rpm的速度下培养10小时。通过离心获得培养细胞，用100mm(ph7)磷酸盐缓冲液进行洗涤，重悬于结合缓冲液中，随后用弗氏压碎器(frenchpress)进行破碎。之后，再次对所得细胞进行离心，除去固体和未破碎的细胞，并使用ni-亲和柱来纯化溶液。然后在20％甘油溶液中储存在80℃的温度下。5.用于在体外条件下分析蛋白质-dna结合的电泳迁移位移实验(emsa)的测量为了在体外条件下研究分离的c4-lysr基因与其启动子区域之间的结合，合成了启动子区域的dna片段(见图7)。合成了三种类型的片段：第一种是包含o1操纵子和o2操纵子二者的片段(命名为f12)，预期转录调节蛋白将与c4-lysr基因和mmsadh基因之间的整个dna片段结合；第二种是包含o1操纵子部分的片段(命名为f12m)；第三种是包含o2操纵子部分的片段(命名为f1m2)。使用由invitrogen公司制造的基于分子探针荧光的迁移位移实验试剂盒(荧光-emsa)进行emsa实验。首先，用玻璃纤维柱将启动子区域的dna片段纯化，与经结合缓冲液纯化的lysr蛋白混合，并在室温下反应30分钟。之后，将混合物上样到6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在220v下于tbe缓冲液(ph8)中跑胶30分钟。然后，为了在凝胶固定之后确认dna条带，在其上进行sybrgreenemsa染色，然后通过凝胶成像系统(bio-rad)对条带强度进行定量。为了观察蛋白质，用syprorubyemsa对dna-蛋白质条带进行染色。6.分析方法使用带有长度为10mm的比色杯的双光束分光光度计(lambda20，perkin-elmer，norwalk，ct)测量细胞浓度。使用高效液相色谱(hplc)测量3-hp浓度(raj等，2008)。为了制备样品，将为了进行hplc分析而获取的样品以10,000×g离心10分钟以除去细胞沉淀物，并经tuffryn膜过滤器(acrodisc；palllifesciences，portwashington，ny)过滤。用于hplc分析的柱尺寸为300mm×7.8mmaminexhpx-87h(bio-rad，美国)，并在65℃的温度下使用2.5mmol/lh2so4作为流动相。7.结果(1)脱氮假单胞菌中3-hp诱导型启动子的筛选3-hp是一种很少在自然环境中存在的碳化合物，很少有关于其用作碳底物或其生物降解的报道。然而，最近，本发明的发明人发现脱氮假单胞菌在生长期和非生长期都快速地降解3-hp。在细胞的生长期，脱氮假单胞菌能够使用3-hp作为唯一的碳源和能量源(图1a)。在细胞的非生长期，脱氮假单胞菌在存在氧的情况下显示出降解3-hp的特征(图1b)。已知3-hp的生物降解使用还原途径或氧化途径(图2)。通过使用气相色谱-质谱分析(gaschromatography-massspectrometry)进行的基因组分析和代谢物分析，估计脱氮假单胞菌中3-hp的降解利用氧化途径。根据该途径，推测3-羟基丙酸脱氢酶(3hpdh)和(甲基)丙二酸-半醛脱氢酶(mmsadh)这两种酶依次地将3-hp转化为甲基丙二酸半醛然后将甲基丙二酸半醛转化为乙酰-coa(图2)。除了3hpdh之外，在脱氮假单胞菌中还证实了许多假定为能够降解3-hp以及3-羟基酸(与3-hp相似)的3-羟基丁酸脱氢酶。就此而言，具有针对3-hp的活性的各种酶的表达可能可通过3-hp进行诱导。通过rt-pcr来对假定为3-hp分解代谢基因的三个基因(3hpdh、3hibdhiv和mmsadh)的mrna水平进行比较(图3)。此处，将已知编码σ因子70并且被认为是持家基因的rpod用作参考基因。结果，有趣的是观察到了通过3-hp显著增加了基因(假定与3-hp降解相关)的表达。当细胞暴露于3-hp时，3hpdh显示出46倍的增加，3hibdhiv显示出146倍的增加，而mmsadh显示出137倍的增加。因此，这些基因的上调可通过由3-hp诱导的基因启动子的性质来解释。检测了基因(即3hpdh、3hibdhiv和mmsadh)的表达被与3-hp具有相似大小但是具有不同结构的其它化合物扩增的可能性(图4和图5)。这些基因全部被3-hp、3-羟基异丁酸(3hib)和3-羟基丁酸(3-hb)扩增。然而，这些基因的扩增不由乳酸、乙酸、丙酸、1,3-丙二醇和2,3-丁二醇诱导。特别地，这些基因的扩增由l-缬氨酸诱导，而假设该诱导是由于在代谢过程中l-缬氨酸转化成3-hib所造成的。就此而言，证实了这些转录调节蛋白特异性地对3-hp、3-hib、3-hb等具有反应性。(2)对3-hp诱导型基因表达系统的分析已知lysr型转录调节因子(lttr)是转录激活因子，调节与芳香族化合物相同的分解代谢途径。通常而言，编码lttr的基因位于参与芳香族化合物降解的基因群前面，并且调节这些化合物的降解。为了鉴定3-hp降解途径，对与脱氮假单胞菌的3hpdh和3hibdh-iv有关的操纵子进行了基因结构分析。结果证实了lttr位于3-hp降解基因前部的类似基因序列中(图6)。也就是说，表明了在脱氮假单胞菌中，3-hp降解基因的表达可能与lysr蛋白有关。具体而言，转录受到lysr基因调节的基因(即，mmsadh、3hibdh4和3hpdh)和与lysr蛋白结合的基因(下文中，将与3-羟基异丁酸脱氢酶(为c4化合物)基因结合的lysr命名为c4-lysr，而将与3-hp脱氢酶(为c3化合物)基因结合的lysr命名为c3-lysr)位于相反的方向。确认了两个特异性结合位点，即具有保守的t-n11-a基序的调节结合位点(regulatorybindingsite，rs)和与35rna聚合酶结合位点相邻的激活结合位点(activationbindingsite，as)(图6)。此外，证实了rs和as在编码lysr蛋白的基因的10位置和-35位置处重叠。就此而言，推测lysr基因的表达被表达产物lysr抑制。对存在于脱氮假单胞菌中的c4lysr诱导型启动子进行更详细的分析。lysr基因和mmsadh基因之间的o1操纵子和o2操纵子各自位于相对于mmsadh基因的转录起始位点的-58位置和-9位置，并且各自具有反向重复(图7)。反向重复序列或回文结构经常在原核生物的操纵子位点中发现，而且已知是转录调节蛋白的结合位点。o1位点和o2位点之间的距离约为50bp，相当于5圈螺旋dna，因此，假定当结合至o1位点和o2位点时，lysr蛋白可以以相同的方向进行结合。o1位点二分体(dyad)每隔15bp由9个碱基组成，但是由于只有一个错配，表明o1位点二分体是高度对称的。同时，o2位点的反向重复序列每隔相对较短的11bp也由9个碱基组成。9个碱基中有6个是错配的，也就是说，o2位点的对称性很弱。作为检测o1操纵子和o2操纵子中存在的四个回文片段的同源性的结果，发现了tagtaa。第3位、第4位和第5位的碱基(粗体字母)在所有片段中均是保守的，第2位和第8位的碱基(下划线)在三个片段中是保守的，表明这些碱基在与c4lysr蛋白的结合中起重要作用。使用绿色荧光蛋白(gfp)作为报告子来检测o1操纵子和o2操纵子对c4-lysr蛋白的生物合成和mmsadh的表达的影响(表2)。表2中示出了c4-lysr蛋白以及o1操纵子和o2操纵子对c4-lysr和mmsadh的表达的影响。示出了在不存在3-hp的情况下相对于野生型的gfp相对水平。c4-lysr蛋白要么不存在，要么由组成型启动子产生，并制备质粒以通过现有的启动子(具有o1操纵子和o2操纵子)来控制gfp的表达。随后，通过将制备的质粒插入脱氮假单胞菌宿主(其中删除了c4-lysr和mmsadh之间的基因)中来进行实验。结果是，gfp的表达被c4-lysr蛋白本身抑制。即，当c4-lysr表达时，gfp表达降低超过10倍。另外，无论是否存在3-hp，表达调节都是不变的。在这方面，确认了c4-lysrmrna的转录受到c4-lysr蛋白的负调节。通过使用为消除对称二分体而随机化o1操纵子和o2操纵子的启动子来重复该实验。结果是，在o1操纵子或o2操纵子位点被随机化的情况下，gfp表达不再受c4-lysr蛋白调节，意味着脱氮假单胞菌菌株中的c4-lysr蛋白由菌株本身进行负调节。同时，以类似方式检测o1操纵子和o2操纵子对mmsadh基因表达的影响。即，使c4-lysr蛋白组成型表达，并制备质粒使得gfp可位于具有o1操纵子和o2操纵子的启动子之后。此处，对o1操纵子或o2操纵子进行突变，使得o1位点或o2位点的对称二分体被随机化。结果是，当o1位点或o2位点被突变时，由3-hp上调转录的现象消失。即，这意味着o1操纵子和o2操纵子对于由3-hp引起的表达上调而言都是必需的位点。因此，表明本发明的启动子是需要o1操纵子和o2操纵子的存在的启动子。[表2]1gfp用作报告蛋白，即，使用了在c4-lysr位置或mmsadh位置处插入gfp基因的质粒。2以25mm的浓度加入3-hp。3当o1和o2被随机化时，c4-lysr使用弱表达但组成型表达的启动子。同时，已知lttr蛋白由以下组成：作为dna结合结构域的n末端(螺旋-转角-螺旋基序)、作为底物结合结构域的c末端以及连接n末端和c末端的接头。lysr蛋白形成同源二聚体以结合rs和as，并且，当效应分子(在本发明的情况下为3-hp)结合每个lysr蛋白时，由于两个lttr二聚体之间的蛋白质-蛋白质相互作用，lttr形成四聚体，进而导致与lysr蛋白缔合的dna发生结构变化。已知特异性结合至lttr四聚体的衍生物引起lysr蛋白的结构变化，并随后改变启动子区域dna的结构，从而最终有助于rna聚合酶结合至启动子(图8)。当检验本发明中强调的c4-lysr蛋白的结构时，结果同样是，c4-lysr蛋白由以下组成：作为dna结合结构域的n末端(螺旋-转角-螺旋基序)、作为底物结合结构域的c末端以及连接n末端和c末端的接头(图9)。发现了四个氨基酸(即thr-31、arg-34、glu-40和leu-47)在dna结合结构域中起关键作用，而且，在底物结合结构域中鉴定出了对结合3-hp而言重要的氨基酸以及在二聚体形成中起重要作用的氨基酸。在这些氨基酸中，在结合3-hp中起重要作用的氨基酸是asp-159、thr-160、pro-237和phe-239，而在二聚体形成中起重要作用的氨基酸是ala-60、gly-91、arg-94、pro-118和glu-137。特别地，除了pro-118之外，在二聚体形成中起重要作用的氨基酸全部位于蛋白质表面。为了证实lysr蛋白是转录调节因子，从脱氮假单胞菌的染色体中删除了编码c3lysr蛋白和c4lysr蛋白的基因，然后检验被转录调节的基因(mmsadh、3hibdhiv和3hpdh)的转录诱导。首先，当c4lysr基因被删除时，无论是否存在3-hp，mmsadh和3hibdhiv基因的表达都较低，而且添加3-hp并不增加表达。当c3lysr基因被删除时，加入3-hp并不引起3hpdh基因表达的增加。但是，当在c3lysr或c4lysr基因被删除的菌株中通过使用质粒再表达c3lysr基因或c4lysr基因(补足实验(complementationexperiment))时，基因表达增加并且恢复到与野生型菌株在有3-hp时相同的水平。就此而言，证实了c3lysr蛋白和c4lysr蛋白各自是调节细胞中mmsadh、3hibdhiv和3hpdh表达的转录调节蛋白。(3)c4-lysr蛋白与o1操纵子和o2操纵子位点的结合特征的体外检验为了检验c4-lysr蛋白的体外特征，在大肠杆菌中制备c末端具有组氨酸标签的c4-lysr蛋白，并从中进行纯化。首先，在c末端和n末端标记his标签，然后进行上述补足实验。结果是，两种情况均表现出与不含his标签的野生型lysr相同的性能。因此，在两种重组lysr蛋白中，只对带c-his标签的lysr进行生物化学实验。该重组lysr在大肠杆菌中主要以不溶形式进行表达。此处，也对表达条件(温度、ph、培养基组成、iptg浓度等)进行了详细的优化实验。此外，也研究了各种伴侣蛋白的影响。结果是，在0.1miptg、lb培养基和groel-es伴侣蛋白的常规条件下，在25℃的相对较低的温度下能够由大肠杆菌产生足够量的水溶性c4-lysr(图10)。通过sds-page鉴定纯化分离的蛋白质。此处，估计c4-lysr的大小约为33kda，与预测的基因大小很匹配。然而，非变性凝胶电泳的结果显示，当蛋白质浓度较高时，在缓冲溶液中形成了二聚体(图11)。通过emsa实验检验了基因重组的c4-lysr与启动子dna之间的结合(图12)。为了进行emsa实验，合成了三个dna片段。f12(135bp)是作为c4-lys基因和mmsadh基因之间的整个启动子区域并且包含o1操纵子和o2操纵子二者的dna片段；f12m(135bp)是仅包含o1操纵子区域的dna片段；f1m2(135bp)是仅包含o2操纵子区域的dna片段。为了用作对照组，合成了一个片段，其中该片段具有与f12相同的大小，但是被设计为通过随机化o1区域和o2区域而不具有回文结构。将c4-lysr蛋白与dna片段(f12、f12m和f1m2)进行反应，并对其进行电泳。结果，观察到dna片段的迁移率降低(图12)，意味着在体外条件下c4-lysr蛋白与dna片段进行了结合。在对照片段中未观察到这种迁移率的降低。也就是说，在存在dna片段的碱基序列(更具体而言，o1操纵子和o2操纵子的序列)的情况下可实现c4-lysr与dna片段之间的结合。在这三个片段中，f12对lysr蛋白表现出最高的亲和力，其次是f12m和f1m2。在存在3-hp的情况下重复emsa实验，而3-hp的存在改变了亲和力。即，f12的亲和力增加，f1的亲和力几乎没有变化，而f2的亲和力稍微降低。既然f12具有比f12m或f1m2更高的亲和力，那么意味着lysr与o1和o2的结合是协同的(cooperative)。即，当lysr蛋白与高亲和力的o1位点结合时，促进了与o2位点的结合。emsa实验的结果显示，相比于f12m或f1m2，f12总是具有较低的迁移率。此外，在低浓度的lysr下，示出仅具有一个迁移的条带，意味着总是更多的lysr蛋白与f12结合。也就是说，当lysr与f12结合时，这意味着lysr与o1位点和o2位点都结合。f12比f12m或f1m2具有更高的亲和力而比f12m或f1m2具有更低的迁移率说明了lysr蛋白与f12中的o1位点和o2位点的结合是协同的这一事实。基于emsa实验的这些结果，3-hp诱导型启动子的重要特性可总结如下：(i)该启动子的特征在于具有两个以上的反向重复序列对，各自由9个碱基组成，并且提供了lysr蛋白的结合位点；(ii)不管是否与诱导物分子结合，lysr蛋白均能够结合至该启动子，但是仅在lysr蛋白与诱导物分子缔合时，才显示出转录效率的提高，其中所述诱导物分子可为3-hp或与3-hp结构相似的3-hib和3-hb；(iii)该启动子提供了两个lysr蛋白二聚体结合的位点，其中该结合彼此具有协同性；(iv)该启动子提供了当rna聚合酶与其结合时可与lysr蛋白相互作用的结构；以及(v)该启动子包含o1操纵子和o2操纵子，其中每个操纵子由9个碱基组成，并且具有高度保守的反向重复序列。(4)3-hp诱导型基因表达系统的虚拟搜索以及该表达系统的特征分析为了找出新的3-hp诱导型基因表达系统，基于脱氮假单胞菌的基因同源性，从多种微生物中筛选出推定的lysr调节基因和mmsadh、3hipdh、3hpdh等。blastp相似性搜索结果表明类似的3-hp诱导型基因表达系统存在于多种微生物中，并且，在众所周知的微生物中，发现了推测为3hibdh(c4系统)和3hpdh(c3系统)的基因群的存在(图13及表4和表5)。结构分析和基因比对的结果是，证实了各微生物具有多种多样的遗传结构。在总共超过150种微生物中发现了3-hp诱导型基因表达系统，并根据是否存在c3-lysr和c4-lysr以及基因排列特征将这些基因表达系统总共分成16组。这些组中，9组既有c4系统又有c3系统，7组仅有c4系统。没有发现只有c3系统的组。此外，在c3系统的情况中，编码lysr蛋白的基因和由lysr蛋白调节其表达的基因的特征在于转录方向都是相反的。在c4系统的情况中，编码lysr蛋白的基因和由lysr蛋白调节其表达的基因的特征在于转录方向大部分是相反的。然而，在属于第15组和第16组的微生物中，转录方向是相同的。分析了对c3lysr蛋白和c4lysr蛋白具有反应性的启动子序列的特征。与脱氮假单胞菌中相同的方式，存在两个串联的操纵子位点(命名为o1和o2)。两个操纵子具有二分体对称性，其中每个反向重复由9个碱基组成。此处，二分体对称的中心之间的距离是50个碱基，从而使得当lysr蛋白与o1操纵子和o2操纵子位点结合时，lysr蛋白被间隔地以相同方向结合。另外，反向重复序列中的9个碱基在许多微生物中都高度保守。对3-hp具有反应性的lysr的回文结合位点在多种微生物中是保守的。然而，取决于物种，只有o1操纵子(即主要结合位点/阻遏结合位点(pbs/rbs))是保守的(表3)。另外，在所有物种中，包含保守的t-n11/12-a基序并且具有高亲和力的pbs存在于邻近相对于转录起始位点(tss)的-65位置和-75位置处。也就是说，o2操纵子(即次要结合位点/激活结合位点(sbs/abs)基序)具有较低的序列保守性，从而使得abs基序的计算机预测是复杂且困难的。据报道，rbs位点和abs位点各自在自生(autogenic)抑制和激活中起关键作用。尽管具有如对3-hp具有反应性的蛋白质的共同功能，3-hp-lysr蛋白在其它属内具有较低的序列相似性，而在同一属内具有高序列相似性。因此，与lysr蛋白结合的操纵子区域的dna序列在不同属之间是不同的，这在逻辑上不是错误的。此处，使用bprom和bdgp工具来预测转录因子(启动子；-10区域和-35区域)。表3中所示的9个碱基序列是指在每个属中对应于lysr(对3-hp具有反应性)的结合位点的保守区域，其中大写字母是在所有目标受试者中看起来保守的碱基。[表3]属阻遏结合位点(t-n11/12-a基序)#代表无色杆菌属(achromobacter)cacacatct4食酸菌属(acidovorax)tcgcacacc3不动杆菌属(acinetobacter)gtcaaagat7产碱杆菌属(advenella)ttgcaaatt4气单胞菌属(aeromonas)gggcaaaca2产碱菌属(alcaligenes)cacacatct5食烷菌属(alcanivorax)agcagcatg2alicycliphilustgcaaagcc2anaeromyxobactergggacgacg3固氮螺菌属(azospirillum)gtgcccgcg4固氮菌属(azotobacter)gtatcgagc4拜耶林克氏菌属(beijerinckia)attgccgtg3博德特杆菌属(bordetella)gtttcgttg6慢生型根瘤菌属(bradyrhizobium)atatatcag3布鲁氏菌属(brucella)aaaaatgca3伯克氏菌属(burkholderia)gcctacact16棒状杆菌属(corynebacterium)cacctttgc6贪铜菌属(cupriavidus)agttcagcg3戴尔福特菌属(delftia)gcaaaaacg3ferrimonasgcggtttta2glaciecolatgaattgac3戈登菌属(gordonia)gaaaccggc2盐单胞菌属(halomonas)tacacacaa3紫色杆菌属(janthinobacterium)ttcgcatta3海杆菌属(marinobacter)cagaaggct2甲基孢囊菌属(methylocystis)cgatcgacc2phenylobaculumgtcccgctc2假单胞菌属(pseudomonas)ttgcacatc24劳尔氏菌属(ralstonia)gcctacact5希瓦氏菌属(shewanella)gttcgcgta6中华根瘤菌属(sinorhizobium)tcggaaatt2鞘脂菌属(sphingobium)cgcacaacc2寡养单胞菌属(stenotrophomonas)ggccagatt2tistrellaccggcggcg3贪噬菌属(variovorax)gtctattgt2verminephrobactercgtggccga2弧菌属(vibrio)tgcaccgtt6黄色杆菌属(xanthobacter)ctgtgcaca2黄单胞菌属(xanthomonas)gcggtgggc6#代表：在属内鉴定为具有相同阻遏结合位点(rbs)的物种数。[表4]对c4-lysr、mmsadh和3hibdh的酶蛋白序列同源性进行的比较[表5]对c3-lysr和3hpdh的酶蛋白序列同源性进行的比较以相同方式进行lysr蛋白的分析。从非冗余ncbi数据库中对c4lysr和c3lysr序列进行blast搜索的结果是，确认了存在126个和132个与结合dna的螺旋-转角-螺旋区域同源的序列。图14和图15示出了这些序列的多重序列比对。序列比对的结果是，确认发现lysr序列的很大部分是高度保守的，并且确认发现lysr序列在其它微生物中也是高水平保守的。即，这说明了大多数微生物在细胞中使用lysr。此外，在所有c4lysr序列和c3lysr序列中都发现了推测与3-hp表达启动子中的操纵子区域的反向重复序列强烈结合的螺旋-转角-螺旋区域。在这个螺旋-转角-螺旋区域中，四个残基(如thr-31、arg-34、glu-40和leu-47)是高度保守的。这些保守的氨基酸残基被认为是在lysr蛋白与dna之间结合时的强烈相互作用中的重要部分(图9)。为了进一步检验lysr和3-hp之间的蛋白质-配体相互作用，进行了同源性建模和对接实验(dockingexperiments)。首先，使用从pdb数据库可得的结构，作为使用该结构对脱氮假单胞菌中c4-lysr和c3-lysr的序列相似性进行对比的结果，显示出35％以下的序列相似性(pdbid：3szp，24％一致性)。因此，根据使用muster和lomet服务器的线程化方法(threadingmethod)来进行c4-lysr和c3-lysr的建模。结果，将预测的c4-lysr模型和c3-lysr模型用rampage进行改进和验证，并通过拉氏图(ramachandranplot)确认了98％的氨基酸残基位于合适的区域。随后，通过使用coach来预测c4-lysr和c3-lysr中与3-hp结合的活性位点。此处，使用有效(valid)模型和预测的活性位点处的残基在schrodingertm的maestro程序中进行对接实验。使用蛋白制备wizard和ligprepwizard分别检验目标蛋白(c4-lysr和c3-lysr)和配体(3-hp)。为了生成网格框(gridbox)，使用受体网格生成工具，并通过使用标准精度(standardprecision，sp)和超精度(extraprecision，xp)对接设置在生成的网格框中进行配体对接。结果是，当c4-lysr的对接分数为5.01，c3-lysr的对接分数为3.74时，显示出了出色的对接位姿(pose)。这也证实了c4-lysr和c3-lysr与3-hp和几种分子具有相互作用。在c4-lysr的氨基酸残基中，经检验，asp-159、thr-160、pro-237和phe-239与3-hp之间具有氢键，而arg24与3-hp之间具有疏水相互作用(图9)。在c3-lysr的氨基酸残基中，经检验，leu74、thr190和thr28具有氢键，而thr73、val150、pro167、phe127和phe169具有疏水相互作用。与3-hp和lysr之间没有相互作用的预测不同的是，对接结果有趣地表明3-hp与c4-lysr中的底物结合结构域(arg94、lys96和glu137)和螺旋-转角-螺旋结构域(arg24)具有强烈的相互作用。以相似的方式，发现了c3-lysr的thr28(螺旋-转角-螺旋结构域)与3-hp具有强烈的相互作用。具体而言，在底物结合结构域中，除了3-hp结合之外，还鉴定出了在二聚体形成中起重要作用的氨基酸，所鉴定出的氨基酸是ala-60、gly-91、arg-94、pro-118和glu-137。特别地，除了pro-118之外，在二聚体形成中起重要作用的氨基酸全部位于蛋白质表面。就此而言，当3-hp直接影响lysr并导致lysr二聚化时，经历二聚化的lysr结合至dna并高度调节位于lysr基因下游的3-hp降解基因的转录。(5)具有3-hp诱导型基因的微生物引起的3-hp降解和3-hp诱导型基因的表达根据基因结构分析，发现3-hp降解途径存在于多种微生物中。为了评估各种微生物的3-hp降解能力，将细胞悬浮于含有25mmol/l3-hp的100mm磷酸盐溶液中，并使其降解3-hp24小时(表6)。结果，取决于微生物，3-hp降解率有所不同，但是发现所有微生物都能有效地降解3-hp。根据是否存在3-hp，评估了3-hp降解基因(3hpdh、3hibdh和mmsadh)的转录水平(表7)。如表7所示，3-hp使微生物中3hpdh基因、3hibdh基因和mmsadh基因的表达分别增加了6倍、14倍和16倍。这样的结果表明3-hp诱导型系统在各种微生物中是常见的。同时，与脱氮假单胞菌相比，其它微生物中的转录率增加比脱氮假单胞菌的转录率增加低约10倍，这可能是由于培养条件的不同。即，除了脱氮假单胞菌之外，为了提高其它微生物的生长，在补充有大量复合氮源的培养基中培养微生物，但是在这种情况下，包含在除3-hp之外的复合氮源里的氨基酸或这些氨基酸的降解产物在3-hp不存在的条件下以一定程度激活了3hpdh、3hibdh和mmsadh的转录，从而使得即使在缺乏3-hp的情况下也能高度维持转录量。[表6]休眠细胞的3-hp降解a在0-24小时之间计算的3-hp降解的量。[表7]3-hp降解基因的相对mrna水平对上述微生物进行3-hp诱导型启动子的分析。与之前脱氮假单胞菌的情况相同的方式，所有启动子都具有o1操纵子和o2操纵子序列，并且证实了这些序列具有由9个碱基组成的回文结构。尽管没有对这些序列进行进一步研究，但是预期以与脱氮假单胞菌中相同的方式结合至lysr蛋白。总之，为了以生物学方式提高3-hp生产，需要不断地生产具有酶活性的新酶。在本发明中，从微生物(包括脱氮假单胞菌)中筛选出了对3-hp具有反应性的转录调节因子和启动子，其中所述转录调节因子和启动子由lysr蛋白和结合至lysr蛋白的特定基因序列组成。而且，在存在3-hp的情况下，发现lysr家族转录调节因子上调相应基因的表达。分子建模和对接实验显示出存在对c4-lysr(arg94、lys96、glu137和arg24)和c3-lysr(leu74、thr190、thr28、thr73、val150、pro167、phe127和phe169)而言重要的残基。因此，预期3-hp诱导型系统将有效地用于调节3-hp代谢途径。<实施例2>脱氮假单胞菌中3-hp生产途径的优化1.菌株、质粒和实验材料表8中示出了本研究中使用的细菌菌种和质粒。由kctc提供大肠杆菌菌株，并由atcc提供脱氮假单胞菌菌株。将大肠杆菌xl1-blue用于质粒克隆和维持。基因组dna分离试剂盒和pgem-t载体购自promega(madison，wi，usa)；高性能pfx聚合酶购自invitrogen(首尔，韩国)；dna修饰酶购自newenglandbio-labs(beverly，ma，usa)；miniprep试剂盒和dna凝胶提取试剂盒购自qiagen(mannheim，德国)。另外，引物购自cosmogenetechco.ltd.(首尔，韩国)；bacto胰蛋白胨和酵母提取物购自difco(bectondickinson；franklinlakes，nj，usa)；其它化学制剂和酶购自sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)。[表8]本研究中使用的细菌菌种和质粒2.脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi删除突变菌株的开发为了了解3-hp降解基因的作用，将3hibdhi从脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhiv的染色体中删除。基于sacb阴性反筛选系统从中将目标基因删除。将sacb-km盒导入pqe-80l的ndei和xbai限制位点以制备用于删除目标基因的pqsak质粒。用脱氮假单胞菌的基因组dna通过pcr获得包含目标基因的上游和下游约700bp的dna片段。在对其进行dna测序之后，将该dna片段克隆到pgem-t载体中。之后，再次将其亚克隆至pqsak质粒中，然后，经过两轮重组开发出了脱氮假单胞菌的突变菌株。通过对其进行pcr和测序重新鉴定该突变菌株。如此获得的突变菌株被命名为脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi。3.质粒构建通过使用pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh质粒来扩增编码甘油脱水酶和再激活酶的基因，并通过分别将c3启动子和c3终止子克隆到gdrab基因和dhab123基因5'末端和3'末端处来构建表达盒。将该表达盒复制到pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh质粒的xbai和saci限制位点处，并将所得质粒命名为pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh。将如此获得的pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh质粒用脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi进行转化，最终构建了pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)质粒(图16)。4.酶活性的测定可通过对kgsadh的酶活性进行测量来测量dhab活性。将1单位dhab活性定义为在1分钟内将1μmolnad+还原成nadh所需要的酶量。简而言之，首先，将20μl26u/mgnad+依赖性kgsadh在50mm磷酸钾缓冲液(ph8.0)(总体积为1ml，含有1mmdtt、15μm辅酶b12、3mmmgcl2以及1.5mmatp)中于37℃的温度下孵育5分钟。此处，kgsadh含有25％甘油。通过加入含有1.5mmnad+和在37℃的温度下预热的dhab的适量细胞提取物来开始反应，并通过nadh吸光度的变化来观察。kgsadh活性根据raj博士报道的方法(通过测量在340nm处nad+到nadh的还原)来确定。将反应混合物(包含50mm磷酸钾缓冲液(ph8.0)、1mmdtt和适量的酶提取物)在37℃的温度下孵育5分钟，然后通过加入2.0mm3-hpa和2.0mmnad+开始反应。nadh的量通过使用6.22×103m-1cm-1的摩尔消光系数(δε340)来测定。将kgsadh的1单位活性定义为在1分钟内将1μmolnad+还原成nadh所需的酶量。所有酶活性通过使用粗细胞提取物进行测量。5.培养基和培养条件除非另有说明，使用含有20ml培养肉汤的250ml无挡板erlenmeyer烧瓶以200rpm的速度在30℃的温度下进行摇瓶培养。此处，使用每升中补充有以下物质的m9培养基：mgso4，0.25g；nacl，1.0g；nh4cl，1.0g；酵母提取物，1g；甘油，100mmol；l-谷氨酸，5克；胰蛋白胨，2克；以及葡萄糖，2.5g，并且该培养基含有100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)。如果需要，额外注入12μmol/l辅酶b12，然后用透氧海绵塞密封烧瓶。为了测量细胞质量(cellmass)、残留底物和代谢物，定期进行取样，所有摇瓶培养实验都重复三次，其中生物质和代谢物的标准偏差小于10％。在1.5l容量的biotron-liflusgm生物反应器(biotron，首尔，韩国)中以1l的工作体积进行生物反应器实验。用于生物反应器实验的m9培养基每升补充有如下物质：mgso4·h2o，0.25g；nacl，1.0g；nh4cl，1.0g；酵母提取物，1g；l-谷氨酸，5克；胰蛋白胨，2克；酪蛋白氨基酸，2g；葡萄糖，2.5g；以及微量元素溶液，10ml/l，并且该培养基含有100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)。在30℃的温度下以进料型(fed-type)培养模式进行培养，同时向其中定期注入浓甘油(10m)和7mm葡萄糖。此处，使用5nnaoh和2.5nhcl将ph维持在7.0±0.1。在1vvm下以650rpm的搅拌速度连续供应空气。在培养期间，每6小时向生物反应器中加入补充有以下物质的培养基：胰蛋白胨，2g/l；酪蛋白氨基酸，2g/l；l-谷氨酸，5.0g/l；和酵母提取物，1g/l。定期分析其中的样品以测量细胞质量、残留底物和代谢物。6.分析方法使用带有长度为10mm的比色杯的分光光度计(lambda20，perkinelmer；norwalk，ct，usa)测量细胞浓度。600nm处的1个吸光度单位(od600)与每升0.3g干细胞量一致。根据bradford方法，用酶标仪基于牛血清白蛋白(1420，wallacvictor2；perkinelmer)来分析蛋白质浓度。通过hplc测量甘油、3-hp和其它代谢物的浓度，其中，通过将培养样品以10,000×g离心10分钟而获得的上清液经tuffryn膜(acrodisc，palllifesciences)进行过滤，然后在65℃的温度下使用2.5mmh2so4作为流动相，用300mm×7.8mmaminexhpx-87h(bio-rad，usa)柱进行洗脱。7.结果(1)重组pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)的摇瓶培养在先前的研究中，本发明的发明人观察到，当发生甘油转化时，由于dhab的自毁式(self-destructive)催化反应，dhab活性显著降低。这种降低可能是由再激活dhab的gdrab的低表达引起的。此外，还预期通过在pc3启动子之下依次正确排列gdrab和dhab将提高gdrab的表达。基于该假设，开发了pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh质粒，并将其导入脱氮假单胞菌(以下称为pd)δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi菌株中以用于生产3-hp。在pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)中测量改变gdrab和dhab的排列顺序对关于由甘油生产3-hp的影响。通过在0小时提供12μm辅酶b12来检验辅酶b12的补给作用。使用pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)作为对照组。图17中的s1-s3示出了由重组pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)从甘油生产3-hp；而图17中的o1-o3示出了由重组pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)从甘油生产3-hp。图17中的s1和o1示出了在不提供甘油的情况下的结果；图17中的s2和o2示出了在不提供辅酶b12的情况下的结果。同时，图17中的s3和o3示出了获得的与提供辅酶b12有关的结果。这证实了在两种菌株之间，细胞生长没有显著差异。然而，提供钴和辅酶b12的pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)菌株在12小时后的3-hp生产增加至41％和29％。这些结果表明，dhab的反应速率受辅酶量或钴量的影响。观察到添加钴导致在12小时时产生3-hpa和1,3-pdo，但是在对照菌株中，观察到并不积累3-hpa(具有钴)(表9)。从甘油生产3-hp的产率约为～1，这意味着向其中提供的甘油被完全用于生产3-hp，并且产生的3-hp不会再被降解。[表9]重组脱氮假单胞菌δ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi在12h培养中的碳分布s2s3o2o3底物葡萄糖(mm)0.580.910.670.88甘油(mm)64.1352.1544.9237.45生物量(g/l)1.511.361.661.17代谢物3-hp(mm)64.8349.5145.9338.243-hpa(mm)0.780.5200.391,3-pdo(mm)3.554.951.371.42生长速率(μmax,h-1)0.560.540.540.53来自甘油的3-hp产率(mol/mol)1.010.951.021.02甘油碳回收(％)1.081.051.051.07(2)酶活性测量了dhab和kgsadh的时间依赖性的体外酶活性(图18)。使用kgsadh的酶活性来检验dhab的酶活性，而使用丙醛作为底物来测量kgsadh的酶活性。当dhab基因和gdrab基因的顺序被改变时，观察到dhab活性降低。同时，观察到加入甘油、钴或辅酶b12导致dhab酶活性相当显著地降低。在这方面，需要额外的实验来确定是否这种作用是由3-hpa的积累或其它因素引起的。然而，有一点很清楚的是，gdrab和dhab顺序的改变不足以充分提高dhab酶活性。因此，尚不清楚在本文使用的重组菌株中是否提高了gdrb的表达。为了进行gdrb翻译，使用肺炎克雷伯氏菌的rbs，但是需要对其进行进一步验证。(3)过表达gdrab、dhab、kgsadh的重组pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)的生物反应器培养通过使用pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-gdrab-dhab,pc4-kgsadh)菌株和pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)菌株进行进料型甘油-葡萄糖生物反应器操作。在生物反应器实验中，分别将葡萄糖和甘油的浓度保持在10mm和150mm的低水平。每6小时为细胞生长提供谷氨酸。培养的结果是，在两个生物反应器中观察到了相似的细胞生长。9小时后，两个培养中的细胞生长均减少，但是细胞生长持续至反应结束。在生物反应器a中，使用pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi(pucpk'/pc3-dhab-gdrab,pc4-kgsadh)菌株(图19)。此处，3-hp的生产大部分增加到直至36小时，导致以1.2g/l/h以上的生产速率获得了超过58±2g/l的量，而且来自甘油的3-hp产率超过0.9mol/mol。在36小时后，3-hp生产速率降低。在36小时-48小时之间，仅保持了2±0.5g/l的3-hp生产。总体而言，基于1.0g/l/h的生产速率和来自甘油的0.93mol/mol的3-hp产率，48h内生产了60±2g/l3-hp。相比于之前的实验(即，其中的3hibdhi没有被删除的菌株的发酵实验)，3-hp产率显著增加，证实了3hibdhi在3-hp降解中具有重要作用。在发酵时间较短的烧瓶实验中，根本没有观察到3hibdhi的影响。在生物反应器b中，使用其中的基因顺序(dhab和gdrab)发生改变的菌株，结果是，发酵后半部分的3-hp生产得到提高。基于1.3g/l/h的生产速率和来自甘油的0.95mol/mol的产率，生产了约63±2g/l3-hp。与生物反应器a相比，3-hp生产增加了5％。尽管该结果并没有在酶活性分析或烧瓶实验中见到，但是gdrab表达程度在3-hp生产方面是非常重要的。总之，当表达3-hp生产酶(即dhab、gdrab和kgsadh)时，脱氮假单胞菌能够从甘油生产3-hp。使用两个强诱导型启动子pc3和pc4开发了重组质粒，并使用删除了三个基因的pdδ3hpdhδ3hibdhivδ3hibdhi作为宿主。为了减弱dhab的失活程度，使gdrab位于dhab前面，以此增强gdrab的表达。通过sds-page进行的蛋白质表达分析和酶活性分析表明，通过这种位置变化降低了dhab的活性。然而，不管dhab的活性是否降低，3-hp生产都得到了提高。使用新重组菌株操作进料型生物反应器的结果是，以高浓度、高生产速率和高产率获得了3-hp。序列表<110>pusannationaluniversityindustry-universitycooperationfoundation<120>由3-羟基丙酸诱导表达的启动子系统及用其生物生产3-羟基丙酸的方法<130>aop-2016-0046_pct<150>kr10-2015-0082593<151>2015-06-11<150>kr10-2016-0073091<151>2016-06-13<160>45<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>17<212>prt<213>artificialsequence(人工序列)<400>1thrxaaxaaargxaaxaaxaaxaaxaagluxaaxaaxaaxaaxaaxaa151015leu<210>2<211>60<212>prt<213>artificialsequence(人工序列)<400>2trpxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa151015xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaathrxaaxaaxaa202530xaaxaaxaaxaaxaagluxaaxaaxaaxaaxaaxaaleuxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaagly505560<210>3<211>81<212>prt<213>artificialsequence(人工序列)<400>3aspthrxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa151015xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa202530xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa505560xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaproxaa65707580phe<210>4<211>78<212>prt<213>artificialsequence(人工序列)<400>4alaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa151015xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaagly202530xaaxaaargxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaproxaaxaaxaaxaaxaa505560xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaglu657075<210>5<211>9<212>dna<213>无色杆菌属(achromobacter)<400>5cananatnn9<210>6<211>9<212>dna<213>食酸菌属(acidovorax)<400>6tngcananc9<210>7<211>9<212>dna<213>不动杆菌属(acinetobacter)<400>7gtnnangat9<210>8<211>9<212>dna<213>产碱杆菌属(advenella)<400>8ttgcanatt9<210>9<211>9<212>dna<213>气单胞菌属(aeromonas)<400>9gggnannca9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