本发明涉及具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L-赖氨酸的方法。
背景技术：
L-赖氨酸作为必需氨基酸中的一种，在动物饲料、人类医药品及化妆品工业中得到使用，其通常由棒状杆菌属菌株或埃希氏菌属菌株的发酵而生产。
棒状杆菌属菌株(Corynebacterium)，尤其谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是多用于L-氨基酸的生产的革兰阳性微生物。为了生产L-赖氨酸，通常使用在棒状杆菌属菌株中扩增编码主要参与L-赖氨酸生物合成的酶的基因表达，或敲除对L-赖氨酸生物合成不必要的基因等靶物质特异性处理方法。但除了这些方法之外，还有敲除不参与L-赖氨酸生成的基因的方法、敲除具体功能未知的基因的方法也得到利用。
因此，本发明的发明人为了持续探索能够增加赖氨酸生产能力的有效形质而努力研究，使棒状杆菌属微生物的内在基因随机缺失，从而筛选到能够高浓度生产L-赖氨酸的微生物，发现使该微生物缺失对某种迄今为止不知道其功能的蛋白质进行编码的基因时，L-赖氨酸的生产能力增加，由此完成了本发明。
[现有技术文献]
(专利文献1)KR 10-0838035 B1(公告日2008.06.12)
技术实现要素：
技术问题
本发明的目的在于提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物。
此外，本发明的另一目的在于提供一种利用上述微生物生产L-赖氨酸的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其中，包含序列号为1的氨基酸序列的蛋白质失活。
本发明还提供一种生产L-赖氨酸的方法，包括如下步骤：将本发明的微生物在培养基中进行培养；以及从所述微生物或培养基中回收L-赖氨酸。
有益效果
本发明使生产L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物中功能未知的、包含序列号为1的氨基酸序列的蛋白质失活，而提供L-赖氨酸生产能力增加的重组棒状杆菌属微生物，所述重组棒状杆菌属微生物能够以高收率生产L-赖氨酸，因此能够有效用于L-赖氨酸的工业生产。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其中，包含序列号为1的氨基酸序列的蛋白质失活。
包含所述序列号为1的氨基酸序列的蛋白质是棒状杆菌属微生物中内在本身具有的蛋白质，是功能尚未被确定的假定蛋白质(hypothetical protein)。
包含所述序列号为1的氨基酸序列的蛋白质，还可以包括包含相对于所述序列号为1的氨基酸序列具有80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、尤其具体地97％以上同源性的氨基酸序列的蛋白质。可以明确的是，作为与所述序列具有同源性的序列，只要是与序列号为1的氨基酸序列实质上相同或具有相应的生物活性的氨基酸序列，即使存在部分序列缺失、变形、取代或附加的氨基酸序列的情况，也均属于本发明的范围。
只要是能够编码包含所述序列号为1的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列就属于本发明范围，但是具体地可以具有序列号为2的核苷酸序列。此外，相对于所述序列号为2的核苷酸序列具有80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、尤其具体地97％以上同源性的核苷酸序列也包含在本发明。此外，本发明还包括基于遗传密码简并性(genetic code degeneracy)而编码相同氨基酸序列的上述序列的变异体。
本发明中术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的一致程度，可以以百分比表示。本说明书中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的其同源性序列以“％同源性”表示。
所述氨基酸或核苷酸序列的同源型可以使用例如文献中的算法BLAST[参照：Karlin和Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或根据Pearson的FASTA[参照：Methods Enzymol.，183，63(1990)决定。基于上述算法BLAST，开发出了叫做BLASTN或BLASTX的软件[参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
本发明中，术语“失活”是指生成所述内在基因的表达相比亲本菌株或变形前的菌株或野生型菌株水平降低或者完全不表达的基因和即使表达也不具有活性或活性减少的基因。可以通过本领域公知的任意失活方法实施。根据本发明，失活方法可以通过选自由向基因内插入一个以上的碱基对引起的插入(insertion)突变、所述基因内一个以上的碱基对缺失的缺失(deletion)突变及所述基因内引入无义密码子的碱基对的转换(transition)或颠换(transversion)突变组成的组中的一者以上突变而实施，或者是将所述基因的内在启动子替换为更弱的启动子，或使所述基因的全部或部分缺失的方法，但不限于此。
使基因缺失的方法可以使用本领域公知的基因缺失方法而没有限制。举例为，利用如紫外线的光或化学物质诱发突变，从获得的突变体中筛选靶基因缺失的菌株。此外，所述基因缺失方法可以通过例如将包含与靶基因具有同源性的核苷酸序列的核苷酸序列或载体注入到所述微生物中，引发同源重组(homologous recombination)而实现。此外，所注入的核苷酸序列或载体中可以包含显性筛选标记。
所述载体只要是可以用于使靶蛋白失活的，可以是天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体可以使用pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII,λgt10、λgt11、Charon4A和Charon21A等，作为质粒载体可以使用pDZ载体、pBR类、pUC类、pBluescriptII类、pGEM类、pTZ类、pCL类和pET类等。可使用的载体不受特别限制，可以使用公知的表达载体。
所述载体的引入可以通过本领域通常的方法容易地实现。通常有CaCl2沉淀法、CaCl2方法中使用叫做DMSO(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)的还原物质而提高效率的Hanahan方法、电穿孔(electroporation)法、磷酸钙沉淀法、原生质融合法、利用碳化硅纤维的搅拌法、利用PEG的转化法、硫酸葡聚糖、脂质体和干燥/抑制介导的转化方法等。
本发明中，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞内，使得多核苷酸在宿主细胞内表达或失活。所述多核苷酸可以包括编码靶蛋白的DNA和RNA、或减少靶蛋白表达的启动子或可以使靶蛋白表达失活的标记基因等。所述多核苷酸只要是能够引入至宿主细胞内而表达的，无论任何形态均可。
包含所述序列号为1的氨基酸序列的蛋白质失活的亲本菌株只要是能够生成L-赖氨酸的微生物就也可以使用而不受限制，可以是属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、埃希氏菌(Escherichia)属、肠杆菌(Enterbacter)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属和普罗威登斯菌(Providencia)属的微生物。具体地可以使用棒状杆菌属微生物，更具体地可以使用谷氨酸棒状杆菌。
本发明中，术语“具有L-赖氨酸生产能力的微生物”是指以能够生产L-赖氨酸的方式处理通常已知的基因而获得的微生物，例如，可以是增强选自由参与L-氨基酸生产的棒状杆菌属微生物中内在的aspB(编码天冬氨酸转氨酶的基因)、lysC(编码天冬氨酸激酶的基因)、asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因)、dapA(编码二氢吡啶二羧酸合成酶的基因)、dapB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)和lysA(编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因)等的L-赖氨酸生物合成基因组成的组中的一种或多种基因的表达而获得的微生物。此外，可以是进行突变处理，例如用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理引入L-亮氨酸营养缺陷型的变异菌株而获得的微生物。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种生产L-赖氨酸的方法，包括如下步骤：将本发明的微生物在培养基中进行培养；以及从所述微生物或培养基中回收L-赖氨酸。
本发明所述微生物如上所述。
根据本发明的方法，棒状杆菌属微生物培养可以使用本领域公知的任意培养条件和培养方法。
可以用于培养棒状杆菌菌株的培养基可以是Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology(美国华盛顿,1981)中公开的培养基。
培养基中可使用的糖源可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等糖和碳水化物；大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等油和脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等脂肪酸；甘油、乙醇等醇；醋酸等有机酸。这些物质可以单独使用或混合使用，但不限于此。
可使用的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕、尿素或无机化合物，例如包括硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。上述氮源也可以单独使用或混合使用，但不限于此。
可使用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。此外，培养基还可以包含生长所需的硫酸镁或硫酸铁等金属盐。最后，除了上述物质之外，还可以使用氨基酸和维生素等生长必须物质。此外，还可以使用适合培养基的前体。所述原料在培养过程中可以根据适合培养物的方式以分批式或连续式添加。
在所述微生物的培养过程中可以通过适当方式使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨等基础化合物或磷酸、硫酸等酸化合物，以调节培养物的pH值。此外，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂抑制气泡生成。为了维持嗜氧状态，可以向培养物中注入氧或含氧气体(例如空气)。培养物温度通常可以为20℃～45℃、具体为25℃～40℃。培养时间可以维持到获得所需的L-氨基酸的生成量，具体可以为10至160小时。
在本发明的方法中，培养可以为连续式或分批式，例如批量工艺、分批引入及反复分批引入工艺。这些培养方法本领域以公知，本领域技术人员可以选择任意一种方法使用。
L-赖氨酸可以通过阴离子交换色谱及后续茚三酮衍生化而分离和分析。此外，本发明的方法包括回收L-赖氨酸的步骤。从微生物或培养基回收L-赖氨酸的方法本领域公知。所述L-赖氨酸回收方法可以使用过滤、阴离子交换色谱、结晶化和HPLC等，但不限于此。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。但这些实施例仅用于示例性说明本发明，本发明的范围并不由这些实施例限定。
[实施例]
实施例1:利用转座子制作随机突变文库
为了获得赖氨酸生产能力提高的菌株，按照下述方法制备了载体文库。
首先使用EZ-Tn5TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp TransposomeTM Kit(Epicentre)获得质粒，将谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国授权专利第10-0159812号；所述微生物以KFCC10881公开，并在布达佩斯条约下的国际保藏机构重新保藏而获得保藏号KCCM11016P)作为亲本菌株，通过电脉冲法(Appl.Microbiol.Biothcenol.(1999)52:541-545)转化所获得的质粒，涂覆到含有卡那霉素(25mg/l)的复合平板培养基上，获得了约20000个菌落。
<复合平板培养基(pH 7.0)>
葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉提取物5g、酵母提取物5g、脑心浸液(Brain Heart Infusion)18.5g、NaCl 2.5g、尿素2g、山梨糖醇91g、琼脂20g(蒸馏水1升为基准)
实施例2:利用转座子筛选随机突变文库
将在所述实施例1中获得的约20000个菌落分别接种至300μL的下列筛选培养基中，在96深孔板(96-deep well plate)中在32℃下，以1000rpm培养约24小时。
<筛选培养基(pH 8.0)>
葡萄糖10g、5.5g硫酸铵(ammonium sulfate)、MgSO47H2O 1.2g、KH2PO4 0.8g、K2HPO4 16.4g、生物素100μg、硫胺素HCl 1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以蒸馏水1升为基准)
为了分析培养液中产生的L-赖氨酸的生成量，使用了茚三酮法(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。
培养结束后，将培养上清液10μl和茚三酮反应溶液190μl在65℃反应30分钟，在570nm波长下利用分光光度计(spectrophotometer)测定吸光度，与作为对照组的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株比较，筛选出显示高吸光度的变异菌株约60多种菌落。其他菌落与对照组谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株显示相似或减少的吸光度。
将所筛选的60多种菌株按照与上述方法相同方法再次进行培养后，反复实施茚三酮法反应，结果筛选出了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株比较L-赖氨酸生产能力提高的前10种突变菌株。
实施例3:分析筛选的随机突变株的L-赖氨酸生产能力
为了最终筛选出L-赖氨酸生产能力可再现地增加的菌株，以所述实施例2中筛选的10种突变菌株为对象，利用下述培养基实施了烧瓶培养。培养结束后，利用HPLC分析了培养液内的L-赖氨酸浓度，各突变菌株的L-赖氨酸生成浓度在下表1中示出。
<种菌培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以蒸馏水1升为基准)。
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白质2.5g、玉米浸渍固体成分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺3000μg、CaCO3 30g(以蒸馏水1升为基准)。
[表1]
筛选的10种随机突变菌株的L-赖氨酸生成浓度
从所筛选的10种突变菌株中，最终筛选了L-赖氨酸生产能力显著性提高的菌株KCCM11016P/mt-8。
实施例4:确定最终筛选菌株中L-赖氨酸生产能力增加原因
本实施例中，以所述实施例3中最终筛选的突变菌株为对象，断定由转座子的随机插入而缺损的基因。
提取了KCCM11016P/mt-8的基因组DNA并切断然后连接，转化至大肠杆菌DH5α，涂覆到含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基。筛选转化的20种菌落后，获得了包含部分未知基因的质粒，使用EZ-Tn5TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp TransposomeTM Kit的引物1(序列号3)和引物2(序列号4)，进行碱基序列的分析，结果根据美国国立保健院基因银行(NIH Genbank)报告的碱基序列可以确认包含序列号为2的核苷酸序列的基因失活。
引物1(序列号3)：ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC
引物2(序列号4)：CTACCCTGTGGAACACCTACATCT
实施例5:制作包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺损的重组载体
为了制作能够使得在棒状杆菌属菌株的染色体上将包含所述实施例4确认的序列号为2的核苷酸序列的基因缺失的重组载体，而为了制作缺失所述基因的片段，合成了引物3-6，将此示于表2。
[表2]
用于制作基因缺失的片段的引物3-6
根据序列号2，为了使ORF部位缺失，以在5'末端具有EcoRI限制酶且在3'末端具有SalI限制酶部位的方式，合成了引物3(序列号5)、引物4(序列号6)、引物5(序列号7)、引物6(序列号8)(表2)，以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体DNA为模板，进行了PCR[Sambrook等,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories]。由此获得了编码由序列号为2的核苷酸序列编码的蛋白质的部分的上端500bp和下端500bp连接而成的DNA片段。此时，PCR条件通过在95度下变性30秒；在50度下退火30秒；和在72度下进行聚合反应1分钟，反复30次后，在72度下进行聚合反应7分钟而实施。将谷氨酸棒状杆菌内的无法复制的pDZ载体(韩国授权专利第10-0924065号)和通过PCR扩增的所述片段使用染色体引入用限制酶EcorI和SalI处理后，利用DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌DH5α中，涂覆到含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基。
通过PCR筛选出用插入所述靶基因的质粒转化的菌落后，利用质粒提取法获得质粒，并将该质粒命名为pDZ-△MT8EH。
实施例6:制作包含源自谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P的序列号为2的核苷酸序列的基因缺失的菌株并评估L-赖氨酸生产能力
将所述实施例5中制作的重组质粒pDZ-△MT8EH通过染色体上的同源重组转化至作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(van der Rest等,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)。
之后，在包含4％蔗糖的固体平板培养基中进行了2次重组。以完成2次重组的所述谷氨酸棒状杆菌转化菌株为对象，利用引物3和引物6进行PCR法，获得了染色体上缺失序列号为2的基因的菌株。所述重组菌株命名为谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-MT8EH。
为了分析上述制作的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-MT8EH菌株的L-赖氨酸生产能力，与作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株一同通过下述方法培养。
在含有下述种菌培养基25ml的250ml三角烧瓶中接种作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P和实施例6制作的菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-MT8EH，在30℃下，以200rpm振荡培养20小时。然后，在含有24ml生产培养基的250ml三角烧瓶中接种1ml的种菌培养液，在30℃下，以200rpm震荡培养72小时。所述种菌培养基和生产培养基的组成分别如下。
<种菌培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg,硫胺素HCl 1000μg,泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以蒸馏水1升为基准)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸渍固体成分(Corn Steep Solids)5g,尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺3000μg、CaCO3 30g(以蒸馏水1升为基准)。
培养结束后，通过HPLC(Waters 2478)测定L-赖氨酸的生成量，将分析的L-赖氨酸浓度示于下表3。
[表3]
源自KCCM11016P的KCCM11016P-MT8EH的L-赖氨酸生产能力分析
如上述结果所示，在作为L-赖氨酸生成菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中使包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失时，相比亲本菌株L-赖氨酸生产能力平均提高32％。
由此可以确认，在棒状杆菌属微生物中使包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失时，能够提高L-赖氨酸生产能力。
从上述结果确认，在L-赖氨酸生成菌株中使包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失，使得未知功能的假定蛋白(hypothetical protein)失活，而获得了提高L-赖氨酸生产能力的效果，将所述菌株KCCM11016P-MT8EH命名为CA01-2295，在2015年5月15日保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)，获得了保藏号KCCM11697P。
实施例7:制作源自谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P的包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失的菌株并评估L-赖氨酸生产能力
为了确认属于生产L-赖氨酸的其他谷氨酸棒状杆菌属的菌株是否也具有上述相同效果，按照与所述实施例6相同方法，以作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(所述微生物以KFCC10750公开，随后重新保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构，获得了保藏号KCCM11347P。韩国授权专利第10-0073610号)为对象，制作了包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失的菌株，并命名为KCCM11347P-MT8EH。
按照与所述实施例6相同的方法培养，培养结束后通过HPLC(Waters 2478)测定L-赖氨酸的生成量，所分析的L-赖氨酸浓度在下表4中示出。8
[表4]
分析源自KCCM11347P的KCCM11347P-MT8EH的L-赖氨酸生产能力
如上结果可以确认，以作为L-赖氨酸生成菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P为对象，使包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失时，L-赖氨酸生产能力平均提高25％。
从而，可以确认与实施例6的结果相同，使棒状杆菌属微生物中的包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失，能够提高L-赖氨酸生产能力。
实施例8:制作源自谷氨酸棒状杆菌CJ3P的包含序列号为2的核苷酸序列基因缺失的菌株并评估L-赖氨酸生产能力
为了确认属于生产L-赖氨酸的其他谷氨酸棒状杆菌属的菌株是否也具有上述相同效果，按照所述实施例6相同方法，以在野生菌株中引入3种变异[pyc(P458S)，hom(V59A)，lysC(T311I)]而具有L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder等Genome Biology 2012,13:R40)为对象，制作了包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失的菌株，并命名为CJ3P-MT8EH。
按照与所述实施例6相同的方法培养，培养结束后通过HPLC(Waters 2478)测定L-赖氨酸的生成量，所分析的L-赖氨酸浓度在下表5中示出。
[表5]
源自CJ3P的CJ3P-MT8EH的L-赖氨酸生产能力
如上结果可以确认，以作为L-赖氨酸生成菌株的谷氨酸棒状杆菌CJ3P为对象，使包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失时，L-赖氨酸生产能力平均提高23％。
从而，可以确认与实施例6和实施例7的结果相同，使棒状杆菌属微生物中的包含序列号为2的核苷酸序列的基因缺失，能够提高L-赖氨酸生产能力。
[保藏号]
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏号：KCCM11697P
保藏日期：20150515
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L-赖氨酸的方法
<130> PP16-0105
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 193
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
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Pro Ser Gly Asn Ser Arg Asp Leu Val Val Cys Gly Gly Phe Ala Ala
20 25 30
Thr Gly Ala Ala Ser Glu Ile Arg Arg Ala Asn Val Ala Leu Val Leu
35 40 45
Gly Ala Gly Leu Asn Gln Phe Thr Met Ala Phe Gly Glu Ala Phe Gly
50 55 60
Glu Leu Ala Glu Val Leu Gln Val Asp Leu Glu Thr Gln Thr Thr Asn
65 70 75 80
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Leu Tyr Leu Asp Asp Asn Pro Leu Thr Cys Pro Gly Gly Asp Ala Leu
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Ala Ala Asp Gly Arg Leu Asp Pro His Ser Leu Met Arg Gln Leu Asn
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Pro
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<213> 谷氨酸棒状杆菌
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<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5
<400> 7
gattccaggc acatacgacc aggtcgcg 28
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 6
<400> 8
gcaggtcgac tcaccaacac catgaccacg ctt 33