新的转氨酶以及使用其对氨基化合物脱氨基的方法与流程

本公开内容涉及一种具有转氨酶活性的新分离的多肽，编码所述多肽的多核苷酸，包含所述核苷酸的微生物，以及通过使用所述多肽或微生物将氨基化合物脱氨基的方法。
背景技术：
：己二酸是分子式为(ch2)4(cooh)2的二羧酸化合物。已将己二酸广泛地作为尼龙树脂、塑料增塑剂的原料以及染料和药物使用。特别地，作为用于生产聚酰胺(如尼龙66)的重要中间产品，己二酸具有非常高的商业价值。己二酸主要通过化学方法生产，其涉及使用石油化合物作为原料的两步法。具体而言，使用苯酚、环己烷、环己烯、苯等环状化合物作为初始材料，使其转化为称为酮环醇或环己醇的酮醇油(ka油)。然后，通过使用硝酸的氧化处理，生成己二酸。这种化学方法是高效和经济的，但是使用苯作为原料且产生大量作为副产物的氮氧化物被认为是问题。除了这些问题以外，由于最近环保法规的加强，使得已经出现了对用于生产己二酸的环境友好型工艺的需求。在这方面，将试图通过微生物生产己二酸。然而，目前尚未准确地知晓能够作为生产己二酸的中间体的6-氨基己酸的生物合成或生物降解途径。如果将6-氨基己酸的6-氨基除去并将酮基引入其中，则生成己二酸半醛，并且通过醛脱氢酶反应，预计合成己二酸是可能的(guerrillotl.等，eurjbiochem.,1977,81(1):185-92；vandecasteele,j.p.等，methodsenzymol.,1982,89:484-490)。由6-氨基己酸向己二酸(其与6-氨基己酸由相同数量的碳原子组成)的酶促转化反应因其是一项新技术以及其较高的商业价值而被高度重视。然而，能够参与实际反应的酶或微生物是未知的。在这方面，本申请的发明人分离了一种具有脱氨活性的新的微生物，同时研究了其对6-氨基己酸的脱氨作用，并且因此，从新的微生物中发现了一种新的酶，从而完成了本公开内容。发明详述技术问题本公开内容提供了一种具有转氨酶活性的新分离的多肽。本公开内容提供了一种编码所述多肽的多核苷酸。本公开内容提供了一种被转化以表达所述新的多肽的微生物。本公开内容提供了一种将氨基化合物脱氨基的方法，以及通过使用具有转氨酶活性的多肽将半醛化合物转化为氨基化合物的方法。技术方案本申请的一个方面提供了一种具有转氨酶活性的分离的多肽，所述多肽具有seqidno:7所示的氨基酸序列或者与seqidno:7具有至少75％同源性的氨基酸序列。如在本申请中所使用的，术语“具有转氨酶活性的多肽”是指具有催化氨基酸与α-酮酸之间的可逆氨基转移反应活性的多肽。可以将转氨酶称为氨基转移酶。如在本申请中所使用的，术语“多肽”指氨基酸的聚合物。在通常情况下，将几个氨基酸连接在一起的形式称为肽，以及将多个氨基酸连接在一起的形式称为蛋白。将构成蛋白的约20种氨基酸彼此之间通过化学键连接以形成多肽。本申请具有转氨酶活性的多肽可以包含seqidno:7所示的氨基酸序列。此外，作为与seqidno:7具有至少75％、至少80％、至少90％、例如至少95％以及例如至少99％同源性的氨基酸序列，多肽可以不受限制的具有任何氨基酸序列，只要多肽的氨基酸序列具有转氨酶催化氨基转移反应的活性即可。此外，多肽可以包括氨基酸序列的变体或类似物，只要多肽的氨基酸序列在生物学上等同于该多肽或与该多肽具有等同的活性即可。如在本申请中所使用的，术语“同源性”指针对给定多肽序列或多核苷酸序列的序列同一性程度，其中该程度可以以百分比表示。在说明书中，与给定的多肽序列或多核苷酸序列具有相同的序列同源性或与给定的多肽序列或多核苷酸序列具有相似活性的序列同源性以“同源性％”表示。例如，可以通过使用标准软件(例如，blast2.0)计算参数(如评分、同一性和相似性)确定同源性。或者，通过根据在定义的严谨条件下进行的杂交方法如southern杂交比较序列，可以鉴定同源性。可以考虑采用本领域普通技术人员熟知的方法确定用于杂交方法的被定义的和适宜的条件。具有转氨酶活性的多肽可以来自p.stutzeri。具体而言，多肽可以来自p.stutzericj-mkb(kccm11587p)。在一个实施方式中，本公开内容的发明人分离了p.stutzericj-mkb，其是能够将6-氨基己酸作为氮源固定的新菌株，从而获得了新的转氨酶。本公开内容的具有转氨酶活性的多肽可以将氨基化合物脱氨基。氨基化合物可以包括选自下组的至少一个：n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸(4-氨基丁酸)、5-氨基戊酸和6-氨基己酸，但是不限于此。具体而言，氨基化合物可以是5-氨基戊酸或6-氨基己酸。已知常规公知的n-乙酰鸟氨酸转氨酶使用n-乙酰鸟氨酸和n-琥珀酰-l-2-氨基-6-氧代庚二酸酯作为底物。然而，完全不知道是否可以将γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸作为底物(rajaramv,ratnaprasunap,savithrihs,murthymr.structureofbiosyntheticn-acetylornithineaminotransferasefromsalmonellatyphimurium:studiesonsubstratespecificityandinhibitorbinding,proteins,2008,70(2):429-441)。然而，本公开内容的多肽除了n-乙酰鸟氨酸之外可以使用γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸作为底物，从而催化其脱氨基反应。在一个实施方式中，n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸被本公开内容的多肽脱氨基，并且可以确证产生了谷氨酸。本公开内容的另一个方面提供了一种编码具有转氨酶活性的多肽的多核苷酸。如在本申请中所使用的，术语“多核苷酸”指核苷酸的聚合物，其中核苷酸单体通过共价键在长链中连接，以及在通常情况下指超过一定长度的脱氧核糖核酸(dna)链或核糖核酸(rna)链。多核苷酸可以包含编码seqidno:7所示多肽或者与seqidno:7具有至少75％同源性的多肽的核苷酸序列。具体而言，多核苷酸可以包含seqidno:4所示的碱基序列。此外，多核苷酸可以包含与seqidno:4具有至少80％、例如至少90％、例如至少95％同源性的序列，只要该序列是编码根据本公开内容的具有转氨酶活性的蛋白的核苷酸序列即可。此外，由于遗传密码的简并性，多核苷酸可以包含编码相同氨基酸序列的核苷酸序列的变体。本公开内容的另一个方面提供了一种被转化以表达具有转氨酶活性的多肽的微生物。具体而言，该微生物被转化以表达编码具有转氨酶活性的多肽的多核苷酸，以及更具体地，其可以被其中可操作地连接了多核苷酸的重组载体转化。多肽和多核苷酸分别如上文所述。如在本申请中所使用的，术语“可操作地连接”意指基因序列功能性连接至启动子序列，所述启动子序列启动和介导编码根据本公开内容的具有转氨酶活性的多肽的多核苷酸转录。可以使用本领域公知的基因重组技术制备与表达载体的连接。例如，可以使用切口酶和连接酶制备位点特异性dna裂解和连接。如在本申请中所使用的，术语“表达载体”指dna构建体，所述dna构建体包含编码目标蛋白的多核苷酸的碱基序列，所述碱基序列与适宜控制序列可操作地连接，以使得可以在适宜宿主细胞中表达目标蛋白。控制序列可以包括用于起始转录的启动子、用于控制转录的任意操纵子序列、编码mrna适宜的核糖体结合位点的序列以及用于控制转录和翻译终止的序列。无论宿主基因组如何，可以将载体转化进入适宜的宿主，然后复制或功能化。此外，可以将载体整合至宿主基因组本身中。对本公开内容中使用的载体没有特别的限制，只要载体在宿主中是可复制的即可，并且可以使用公知的任何载体。常规使用的载体的实例是天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体，但不限于此。当将包含编码具有转氨酶活性多肽的多核苷酸的表达载体转化或转染进入宿主细胞中后，可以在宿主细胞中表达具有转氨酶活性的所需多肽。如在本申请中所使用的，术语“转化”指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中以使得在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白。转化的多核苷酸可以包括在任何情况下的所有类型，无论是将转化的多核苷酸插入宿主细胞的染色体中，还是转化的多核苷酸位于宿主细胞染色体以外，只要能够在宿主细胞中表达即可。将本公开内容的载体转化进入细胞的方法包括将碱基引入细胞的任何方法，例如可以通过选择适宜的本领域公知的标准技术进行转化，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、deae-葡聚糖、阳离子脂质体法等。然而，转化方法不限于此。如在本申请中所使用的，术语“转化的微生物”指包括原核微生物和真核微生物两者的任何微生物，只要微生物能够表达具有转氨酶活性的多肽即可。微生物可以是属于埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属或短杆菌属的一系列微生物。例如，微生物可以属于埃希氏菌属，以及例如可以是大肠杆菌。本公开内容的另一个方面提供了一种将氨基化合物脱氨基的方法，所述方法包括将具有转氨酶活性的多肽或表达所述多肽的微生物加入含有氨基化合物的溶液中。对于该方法而言，具有转氨酶活性的多肽如上文所述。对于该方法而言，可以使用包含编码具有转氨酶活性多肽的多核苷酸的重组载体转化表达具有转氨酶活性的多肽的微生物。此类转化的微生物如上文所述。可以以微生物培养物或微生物裂解物形式将微生物加入含有氨基化合物的溶液中。氨基化合物可以包括例如由选自下组的至少一个组成的组：n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸，但是不限于此。此外，氨基化合物可以包括例如γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸。除了磷酸吡哆醛以外，含有氨基化合物的溶液可以包括选自下组的至少一个：丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸。可以将磷酸吡哆醛作为本公开内容的多肽转氨酶反应中的辅酶。此外，可以将丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸作为胺受体，以接受从反应中的氨基释放的氨基。此外，将氨基化合物脱氨基的方法可以进一步包括从反应产物中回收除去了氨基的化合物。除去氨基的化合物可以包括选自下组的至少一个：n-乙酰谷氨酸5-半醛、琥珀酸半醛、戊二酸半醛和己二酸半醛，但是不限于此。关于从细胞或培养物中回收除去氨基的化合物的方法，根据培养方法不同，使用本领域公知的适宜方法从培养物中收集或回收除去了氨基的化合物。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶以及hplc，但是实施方式不限于此。本公开内容的另一个方面提供了一种生产氨基化合物的方法，所述方法包括将具有转氨酶活性的多肽或表达所述多肽的微生物加入含有半醛化合物的溶液中。对于生产氨基化合物的方法而言，具有转氨酶活性的多肽如上文所述。具有转氨酶活性的多肽对于氨基化合物脱氨基的反向反应具有催化活性，以使得半醛化合物可以转化为氨基化合物。半醛化合物可以包括选自下组的至少一个：n-乙酰谷氨酸5-半醛、琥珀酸半醛、戊二酸半醛和己二酸半醛，但是不限于此。关于生产氨基化合物的方法，除了磷酸吡哆醛以外，含有半醛的溶液还可以包含谷氨酸或天冬氨酸。此外，生产氨基化合物的方法可以进一步包括从溶液中回收所生产的氨基化合物。氨基化合物可以包括选自下组的至少一个：n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸，但是不限于此。可以通过本领域公知的适宜方法回收所生产的氨基化合物。可以将使氨基化合物脱氨基的方法用于生产己二酸。关于生产己二酸的方法，将本公开内容的转氨酶或包含转氨酶的微生物的裂解物加入含有作为氨基化合物的6-氨基己酸的溶液中，然后，可以由使用本领域公知的适宜方法从6-氨基己酸转化得到的己二酸半醛合成己二酸。优选地可以通过醛脱氢酶反应由己二酸半醛合成己二酸。发明的有益效果首次发现了本公开内容的具有转氨酶活性的多肽。此外，可以将通过使用该多肽的将氨基化合物脱氨基的方法用于己二酸基于生物的生产方法。也就是说，在使用常规的化学方法生产己二酸的考量中，本公开内容在提供了使用新途径进行基于生物的己二酸生产方面是有意义的。附图说明图1是通过使用包含6-氨基己酸作为氮源的基本培养基选择的菌株形成的生物膜的图像。具体而言，其示出了通过培养单菌落并对其进行离心获得的产物，以及说明了通过使用蒸馏水将产物分离成生物膜和菌株。图2a至2f显示了在tlc上谷氨酸产生和底物降解程度的比较结果，其取决于5-氨基戊酸、6-氨基己酸、α-酮戊二酸和磷酸吡哆醛的各种浓度以及存在和不存在每种底物：[5ava：10mm5-氨基戊酸(标准品)；1：20mm6-氨基己酸(标准品)；2：p.stutzericj-mkb+20mm6-氨基己酸；3：p.stutzericj-mkb+10mm6-氨基己酸和20mm5-氨基戊酸；4：p.stutzericj-mkb+20mm6-氨基己酸、10mmα-酮戊二酸和0.1mm磷酸吡哆醛；4-1：p.stutzericj-mkb+20mm6-氨基己酸和10mmα-酮戊二酸；5：p.stutzericj-mkb+10mm6-氨基己酸、20mm5-氨基戊酸、10mmα-酮戊二酸和0.1mm磷酸吡哆醛；5-1：p.stutzericj-mkb+10mm6-氨基己酸、20mm5-氨基戊酸和10mmα-酮戊二酸；6：p.stutzericj-mkb+20mm6-氨基己酸和20mm谷氨酸；e：10mm谷氨酸(标准品)]。图3是显示在使用本公开内容的具有转氨酶活性多肽的基因转化的大肠杆菌中过表达的可溶性蛋白的sds-page图像：[t：细胞裂解物；s：可溶性蛋白]。图4显示了通过使用其中过表达本公开内容的具有转氨酶活性的多肽的大肠杆菌细胞裂解物的对氨基化合物反应性的tlc结果：[1：过表达的petduet1(空载体)与4-氨基丁酸之间的反应性；2：过表达的本公开内容的具有转氨酶活性的多肽与4-氨基丁酸之间的反应性；4：过表达的petduet1与6-氨基己酸之间的反应性；5：过表达的本公开内容的具有转氨酶活性的多肽与6-氨基己酸之间的反应性；7：过表达的petduet1与n-乙酰鸟氨酸之间的反应性；8：过表达的本公开内容的具有转氨酶活性的多肽与n-乙酰鸟氨酸之间的反应性；以及10：谷氨酸(标准品)]。图5显示了表示随着6-氨基己酸浓度的增加，通过使用本公开内容的具有转氨酶活性多肽的转化反应产生的谷氨酸的量的tlc结果：[c：过表达的petduet1与6-氨基己酸之间的反应；d：过表达的本公开内容的具有转氨酶活性的多肽与6-氨基己酸之间的反应；以及e：10mm谷氨酸(标准品)]。图6是显示从5种假单胞属菌株中获得的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和在大肠杆菌中的本公开内容的具有转氨酶活性的多肽过表达的sds-page图像。图7是显示在6-氨基己酸与来自5种假单胞属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的具有转氨酶活性的多肽之间进行1小时反应后使用lc-mass对6-氨基己酸减少情况进行分析的图。图8显示了根据来自希夫试剂的相对活性值针对醛形成程度对与图7中相同的样品进行比较的结果。图9是显示在n-乙酰鸟氨酸与来自5种假单胞属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的具有转氨酶活性的多肽之间进行反应后使用lc-mass对n-乙酰鸟氨酸减少情况进行分析的图。图10是显示在γ-氨基丁酸与来自5种假单胞属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的具有转氨酶活性的多肽之间进行反应后使用lc-mass对γ-氨基丁酸减少情况进行分析的图。图11是显示在5-氨基戊酸与来自5种假单胞属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的具有转氨酶活性的多肽之间进行反应后使用lc-mass对5-氨基戊酸减少情况进行分析的图。图12是显示通过比较通过希夫试剂的来自6-氨基己酸的反应以及再次诱导其逆反应的相对酶促活性获得的结果的图，以评估本公开内容的具有转氨酶活性多肽的逆反应。最佳模式发明的模式在下文中，将参照以下实施例更详细地描述一个或多个实施方式。然而，这些实施例并非旨在限制本公开内容的范围。实施例1：使用6-氨基己酸作为氮源的微生物的鉴定1)筛选使用6-氨基己酸作为氮源的微生物并对16srrna进行分析将6-氨基己酸(6-aca)固定为氮源，并且通过传代培养选择了能够将6-aca脱氨基的新菌株p.stutzericj-mkb。为了进行选择，使用表1的组成制备能够培养微生物的基本培养基。这里，菌株培养物的氮源是6-aca。[表1]培养基组成终浓度na2hpo4·h2o15.1mmkh2po422mmnacl8.6mm6-氨基己酸20mmmgso41mmcacl2100mm(nh4)6mo7o24·h2o3nmh3bo3400nmcocl2·h2o30nmcuso4·h2o10nmmncl2·h2o80nmznso4·h2o10nmfeso4·h2o1mm葡萄糖11.1mm具体而言，在37℃温度和200rpm转速下，在具有表1组成的培养基中培养来自位于韩国首尔加阳洞的cj希杰公司金浦工厂的土壤样品。在初始接种光密度(od600)为0.05、温度为37℃、转速为200rpm的条件下，将培养的候选菌株再培养至其光密度达到0.5。然后，将在具有表1组成的培养基中培养的微生物通过传代培养选择5次。最初将所选择的微生物命名为“cj-mkb”，并进行以下实验以确认所选择的微生物是新的微生物。将在液体培养基中培养的cj-mkb菌株在m9琼脂培养板上划板和涂布以获得菌落。由此获得的菌落对浓度为25mg/ml的氨苄西林具有抗性。此外，观察到在菌落周围形成了浅色的生物膜。选择了两个菌落并再次在m9液体培养基中培养，使用基因组dna制备试剂盒提取基因组dna。为了鉴定所获得的基因组，对16s核糖体rna(16srrna)序列进行分析。这里，使用用于分析微生物16srrna序列的常用引物，如27f(agagtttgatcctggctcag；seqidno:18)和1492r(ggttaccttgttacgactt；seqidno:19)，并因此证实了cj-mkb基因组的16srrna具有seqidno:1所示的碱基序列。使用由美国国家生物技术信息中心(ncbi)提供的blast程序来检索与seqidno：1具有较高核酸同源性的菌株(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi℃program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)。结果，确证了该菌株分别与p.stutzeristrainnbris11、γ变形杆菌bp44-iso8、未培养的细菌克隆9、大肠杆菌菌株bm0446和肠杆菌科细菌bm005的每一个的16srrna具有相同的序列。已知假单胞菌属的几种微生物能够产生用于形成生物膜的胞外多糖。此外，假单胞菌属的微生物还对β-内酰胺类抗生素(如青霉素)具有抗性。考虑到cj-mkb菌株16srrna的序列信息、对氨苄西林的抗性以及在培养过程中显示出的生物膜，认为所选择的菌株很有可能是假单胞菌属的微生物。在lb肉汤中培养从含有25mg/ml氨苄西林的m9培养基琼脂培养板上获得的单一菌落，然后以13,000rpm的转速离心1分钟，从而获得该菌株的培养物(图1)。当向所获得的菌株中加入蒸馏水并轻轻振摇混合溶液时，生物膜和菌株彼此之间容易地分离。2)氧化还原酶的序列分析为了确定所选择的菌株是否是假单胞菌属的微生物，分析了新的cj-mkb菌株是否具有在假单胞菌属中存在的氧化还原酶碱基序列。这里，使用新设计的引物，如ncppb5p(atgagcaagactaacgaatccc；seqidno:20)和ncppb3p(tccagaatggccagcccgcg；seqidno:21)进行序列分析。结果，证实了所选择的菌株具有seqidno:2所示的碱基序列。作为使用ncbi的blast问题对seqidno：2所示的碱基序列进行分析的结果，证实了seqidno:2的碱基序列与已知p.stutzeria1501菌株的氧化还原酶钼喋呤结合序列具有相同的序列。在这方面，证实了所选择的新的cj-mkb菌株是假单胞菌属微生物。3)转氨酶的序列分析由于已确证具有同源性的核苷酸序列是714个碱基的短序列，因而无法对微生物的亚群正确分类。在这方面，对其他蛋白核酸序列进行分析以确证亚群。当微生物使用6-aca作为氮源时，预计在转氨酶中的n-乙酰鸟氨酸转氨酶或4-氨基丁酸转氨酶特别地参与酶转化反应。因此，对具有这两种酶促活性的蛋白的碱基序列进行了确证。具体而言，为了对存在于p.stutzeria1501和所选择的cj-mkb菌株中的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的碱基序列进行比较分析，使用argd_f2(5'引物：atttaaggatccgtccgccccgcacaccccgg；seqidno:22)和argd_r2(3'引物：atttaagagctctcaggcctgggtcagcgtc；seqidno:23)通过pcr对核酸序列进行分析。结果，证实了p.stutzeria1501的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和新微生物的n-乙酰鸟氨酸转氨酶分别具有seqidno:3和seqidno:4所示的序列。以相同的方式，为了对p.stutzeria1501和所选择的菌株中的4-氨基丁酸转氨酶的碱基序列进行比较分析，使用gabt_f(5'引物：atttaacatatgcaacgccgtgtcgccgccgttcc；seqidno:24)和gabt_r(3'引物：atttaagaattctcaggtcagctcgtcgaaacact；seqidno:25)进行pcr。结果，证实了p.stutzeria1501和所选择的菌株分别具有seqidno:5和seqidno:6所示的序列。为了对p.stutzeria1501和所选择的菌株中的n-氨基鸟氨酸转氨酶的碱基序列进行比较分析，使用了多重序列比对。结果，证实了在1,221个核酸序列中有13个核酸是不同(核酸同源性：98.9353％)。此外，以如上所述相同的方式，对p.stutzeria1501和所选择的菌株的4-氨基丁酸转氨酶的核酸序列进行的比较分析证实了在1,257个核酸序列中有21个核酸是不同的(核酸同源性：98.3294％)。总而言之，证实了所选择的p.stutzericj-mkb菌株在迄今为止已知的微生物基因组序列中与p.stutzeria1501具有最高的同源性，因而其是新的菌株。因此，将所选择的菌株于2014年10月22日保藏在韩国微生物保藏中心，并且其保藏号为kccm11587p。实施例2：对p.stutzericj-mkb脱氨基反应性的鉴定对p.stutzericj-mkb进行了5-氨基戊酸和6-氨基己酸脱氨基反应性的评估。由于转氨酶反应是胺基与酮基之间的取代反应，因而通过显色反应能够容易地鉴别底物和产物，其中使用薄层色谱(tlc)进行物质分离得到的反应产物能够容易地通过胺基的茚三酮显色反应鉴别。为了确证p.stutzericj-mkb的转氨酶活性，进行了全细胞反应。当对p.stutzericj-mkb进行培养且培养物的光密度达到0.7时，在新的m9培养基中对培养物进行传代培养。这里，将6-氨基己酸和5-氨基戊酸固定为氮源，然后进行培养。向培养基中加入培养所需的α-酮戊二酸和磷酸吡哆醛，并且为了确认5-氨基戊酸和6-氨基己酸的脱氨度，对其进行tlc分析。这里，反应体积为100μl，并且在tlc上确证谷氨酸的产生情况以及底物的降解程度，其取决于5-氨基戊酸、6-氨基己酸、α-酮戊二酸和磷酸吡哆醛的不同浓度以及存在和不存在每种底物。在tlc显色完成后，使用3％茚三酮溶液对含有胺基的物质显色。根据tlc结果，证实了5-氨基戊酸和6-氨基己酸减少，以及产生了谷氨酸(见图2a至2f)。如图2f中所示(97h反应，第4道)，证实了在97小时之前，加入了20mm6-氨基己酸、10mmα-酮戊二酸和0.1mm磷酸吡哆醛的菌株与全部6-氨基己酸反应。与转氨酶反应得到满足的情况相比，6-氨基己酸的反应速率较慢，但是即使在不存在磷酸吡哆醛的情况下，在tlc上也观察到了6-氨基己酸的减少(见图2f，97h反应，第4-1道)。当5-氨基戊酸与6-氨基己酸同时存在时，未证实6-氨基己酸的减少(见图2f，97h反应，第5和5-1道)。在这方面，当在基本培养基条件下培养p.stutzericj-mkb时，对6-氨基己酸和5-氨基戊酸竞争作为碳源进行了评估。从该实验结果可以证实，p.stutzericj-mkb能够使用6-氨基己酸作为单一氮源，并且在存在α-酮戊二酸和磷酸吡哆醛的条件下，5-氨基戊酸和6-氨基己酸的脱氨基加速(见图2a至2f)。在图2d和2e中(24h反应，第5道；以及72h反应，第4道)，证实了存在少量谷氨酸，但是谷氨酸没有持续累积。除了6-氨基己酸产生的谷氨酸以外，大部分所产生的谷氨酸被用作胺源，因此经评估谷氨酸被快速转化，而不是累积在细胞中。实施例3：在大肠杆菌菌株中诱导本公开内容的具有转氨酶活性的新的多肽过表达，以及评估该多肽的反应性1)在大肠杆菌菌株中诱导具有转氨酶活性且来自p.stutzericj-mkb菌株的多肽过表达为了确证假定是转氨酶并且预计在实施例1中选择和鉴定的新的p.stutzericj-mkb菌株中参与脱氨基反应的酶的活性，进行了下述实验。通过序列分析，确证了编码p.stutzericj-mkb转氨酶基因(在下文中称为“argd”)的碱基序列(seqidno:4)。为了进行表达和纯化，通过在argd碱基序列的5'末端添加his-标签进行克隆，以进行表达。具体而言，通过使用大肠杆菌表达载体petduet1(merchmillipore,darmstadt,germany)将来自p.stutzericj-mkb的重组argd引入大肠杆菌rosetta以制备转化的菌株。然后，将所制备的转化菌株加入3ml含有50mg/ml氨苄西林的lb肉汤培养基中，并且将该菌株在37℃的温度下培养12小时。将所培养的菌株在37℃的温度下在50ml含抗生素的lb培养基中培养。当其光密度(在600nm波长下)达到0.8时，诱导表达，然后，在18℃的温度下将该菌株进一步培养48小时。然后，通过sds-page凝胶结果鉴定破坏后过表达的可溶性蛋白质(图3)。将经转化的大肠杆菌rosetta命名为“大肠杆菌rosettacc04-0057”，并且于2014年10月22日保藏在韩国微生物保藏中心(kccm)，其保藏号为kccm11588p。2)评估其中过表达本公开内容的具有转氨酶活性的多肽的大肠杆菌裂解物的脱氨基反应性使用其中过表达实施例3-1中的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的大肠杆菌裂解物评估每种氨基化合物(γ-氨基丁酸、6-氨基己酸和n-乙酰鸟氨酸)的反应性。加入三种氨基化合物每种10mm、10mmα-酮戊二酸和0.1mm磷酸吡哆醛，并且评估过表达的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的活性。将50μl诱导过表达的大肠杆菌裂解物和底物加入50nmhepes缓冲液(ph8.0)中，在100μl体积下进行反应。在37℃温度下进行30分钟反应后，通过tlc鉴定6-氨基己酸的脱氨基度(图4)。观察到过表达的n-乙酰鸟氨酸转氨酶与已知作为原始底物的n-乙酰鸟氨酸具有较高反应性(图4的第8道)。具体而言，观察到n-乙酰鸟氨酸显着降低，而作为转氨酶的共反应物的谷氨酸显着增加。此外，当使用6-氨基己酸作为底物进行反应时，肉眼观察到产生了谷氨酸(图4的第5道)。此外，通过以与在上文所述的反应性评估中相同的方式增加6-氨基己酸的浓度，利用tlc对转化反应中所产生的谷氨酸的量进行分析(图5)。结果，如反应中所示(图5d)，证实了随着6-氨基己酸的浓度增至两倍(20mm)或三倍(30mm)，谷氨酸的产生增加。因此，证实了6-氨基己酸通过n-乙酰鸟氨酸转氨酶的转化是产物随着底物的增加而增加的典型的酶反应。总而言之，根据上述结果，证实了当在大肠杆菌中转化和过表达来自p.stutzericj-mkb的具有转氨酶活性的多肽时，本公开内容的多肽对6-氨基己酸具有脱氨基活性。实施例4：对来自不同假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的脱氨基活性的评估对多肽对6-氨基己酸的脱氨基活性进行了评估，其中多肽来自p.stutzericj-mkb并且具有实施例3的转氨酶活性。在这方面，在大肠杆菌中表达认为能够进行如上文所述的相同生物转化的来自假单胞菌属微生物(如p.mendocina、p.putida、p.resinovorans、p.syringae和p.thermotolerans)的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的基因，用于评估其反应性。1)比较来自不同假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的同源性从假单胞菌属的微生物中选出五个菌株，然后使用由美国国家生物信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和基因组计划提供的核苷酸鉴定来自p.mendocina、p.putida、p.resinovorans、p.syringae和p.thermotolerans的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的基因和氨基酸序列。然后，与来自p.stutzericj-mkb且具有转氨酶活性的多肽的氨基酸序列同源性进行比较(表2)。来自假单胞菌属微生物的每种酶彼此之间显示出至少约75％的同源性。[表2]来自假单胞菌属五种微生物的n-乙酰鸟氨酸转氨酶与来自p.stutzericj-mkb的多肽之间的氨基酸同源性比较结果(单位：％)2)来自五种假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽的分离和纯化获得五种假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的基因和本公开内容的来自p.stutzericj-mkb的具有转氨酶活性的多肽的基因，并且以与实施例3-1中相同的方式在大肠杆菌中表达。然后，获得使用his-标签柱纯化的蛋白。在sds-page凝胶上对所获得的蛋白进行比较的结果表明，证实了可以使用常规方法对蛋白进行纯化(图6)。3)评估来自五种假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽对6-氨基己酸的脱氨基活性对实施例4-2中纯化的蛋白对6-氨基己酸的反应性进行了验证(图6的第3、5、7、9、11和13道)。具体而言，向含有20mm6-氨基己酸、10mmα-酮谷氨酸和0.1mm磷酸吡哆醛的反应溶液中加入每种经纯化的n-乙酰鸟氨酸转氨酶，其浓度为0.5mg/ml总反应液。然后，向混合溶液中加入50mmhepes(ph8.0)，并且在100μl体积下进行反应。在37℃温度下反应1小时后，用990μl乙醇稀释10μl反应完成的样品以除去酶活性。随后，在转速14,000rpm、温度4℃和反应时间10分钟的条件下进行离心，并且使用990μl无菌蒸馏水稀释10μl上清液。然后，使用液相色谱-质谱lc-mass分析6-氨基己酸的减少程度。结果，证实了来自p.syringae的n-乙酰鸟氨酸转氨酶显示出56.69％的6-氨基己酸转化，而来自p.stutzericj-mkb的多肽以与其他比较菌株类似的方式显示出45.52％的6-氨基己酸转化。通过利用使用希夫(schiff’s)试剂的相对活性值，使用相同样品对醛形成程度进行了比较(图8)。在20mm6-氨基己酸的反应中，将10μl反应物用180μl50mmhepes缓冲液(ph8.0)稀释，加入10μl希夫试剂，在室温下反应30分钟。这里，使用未加入底物的酶样品和仅加入底物的底物样品作为对照。使用96孔板酶标仪基于在490nm波长下的吸光度值对相对酶促活性进行比较(图8)。测得在来自p.thermotolerans的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的反应样品中的醛生成高于lc-mass结果，但是证实了总体反应程度的顺序是相同的。此外，证实了lc-mass结果与希夫试剂结果具有相关性。4)评估来自假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽对n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸和5-氨基戊酸底物的脱氨基活性评估了针对不同底物的，来自假单胞菌属的五种微生物的n-乙酰鸟氨酸转氨酶的反应性(在实施例4-3中对其反应性进行了鉴定)以及本公开内容的多肽的反应性。以10mm总反应液的浓度将10mmα-酮谷氨酸以及0.1mm磷酸吡哆醛、n-乙酰鸟氨酸、γ-氨基丁酸或5-氨基戊酸一起加入，以0.5mg/ml总反应液的浓度加入n-乙酰鸟氨酸转氨酶，在37℃温度下反应1小时。取100μl反应物中的10μl用180μl50mmhepes缓冲液(ph8.0)稀释，并用10μl希夫试剂反应30分钟。然后，使用96-孔板酶标仪比较相对酶促活性。当来自p.mendocina时，n-乙酰鸟氨酸(已知其是n-乙酰鸟氨酸转氨酶原始底物)的脱氨基反应显示出最高活性(图9)。来自p.resinovorans的n-乙酰鸟氨酸转氨酶针对γ-氨基丁酸显示出最高的反应性(图10)。来自p.stutzericj-mkb的多肽针对5-氨基戊酸显示出最高的反应性(图11)。实施例5：评估来自p.stutzericj-mkb的具有转氨酶活性的多肽的逆反应活性根据实施例4，证实了来自不同假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽通过将氨基化合物(如6-氨基己酸)脱氨基被转化为己二酸半醛等。在实施例5中，作为实施例4反应的逆反应，为了证实己二酸半醛向6-氨基己酸的转化反应性，在存在由n-乙酰鸟氨酸转氨酶产生的己二酸半醛的条件下，对过量的谷氨酸进行处理，从而确证己二酸半醛是否是由6-氨基己酸产生的。首先，以100μl体积的50mmhepes缓冲液(ph8.0)制备5mm6-氨基己酸、5mmα-酮戊二酸和0.1mm磷酸吡哆醛，并且以0.5mg/ml总反应液的浓度将来自五种假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽加入其中，从而在37℃温度下反应1小时。反应完全后，在100℃温度下处理反应样品至少5分钟，以除去酶活性。在4℃温度下，以14,000rpm转速将经过热处理的样品离心10分钟，然后，使用180μl50mmhepes缓冲液(ph8.0)稀释10μl上清液(正向反应，α-酮戊二酸(α-kg)反应)。此外，为了诱导上述反应的逆反应，制备体积为200μl的样品并且在与上文所述相同的条件下对其进行处理。在对其进行离心后，将20mm谷氨酸和0.5mg/ml酶加入97μl上清液中。然后，在100μl体积下，将反应样品在37℃温度下反应1小时，随后在100℃温度下处理5分钟。此后，在4℃温度下，以14,000rpm转速对其离心10分钟，然后，使用180μl50mmhepes缓冲液(ph8.0)稀释10μl上清液(逆反应，谷氨酸反应)。将所获得的样品与10μl希夫试剂反应30分钟，并且使用96-孔板酶标仪比较相对酶促活性。结果，当对使用希夫试剂反应后使用96-孔板酶标仪获得的值进行比较时，证实了来自5种假单胞菌属菌株的n-乙酰鸟氨酸转氨酶和本公开内容的多肽将己二酸半醛转化为了6-氨基己酸(图12)。保藏单位：韩国微生物培养中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)(国际的)保藏编号：kccm11587p保藏日期：20141022保藏单位：韩国微生物培养中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)(国际的)保藏编号：kccm11588p保藏日期：20141022<110>cj第一制糖株式会社<120>新的转氨酶以及使用其对氨基化合物脱氨基的方法<130>px052331<150>kr15/94943<151>2015-07-02<160>25<170>kopatentin2.0<210>1<211>1384<212>dna<213>p.stutzericj-mkb16srrna的部分dna序列<400>1tgcagtcgagcggatgaatggagcttgctccatgattcagcggcggacgggtgagtaatg60cctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatac120gtcctacgggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcgg180attagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagagg240atgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctac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