许多疾病可以通过受污染的食物或水、劣质药品和其他元素在人体中携带和传播。出于该原因，工业产品的质量成为关键问题之一，特别是针对制药和食品加工行业。现今，污染测试花费若干天，长达21天，这变得昂贵且太长。自动技术使得能够实现以高精度的污染微生物的早期检测，并且非常小的错误率（假阳性（false positive））对于在相对较短的几天内实现稳健且优化的控制非常有帮助。
例如，在制药行业中，许多过程在洁净室环境中执行。这些过程的示例包括注射器的填充等。必须严格监视洁净室条件，以便确实地避免最终产品的污染。因此，通常向洁净室中引入具有特别适于微生物的生长的表面的载体、小盘。
用于检测表面上的微生物的生长的许多已知方法基于对表面的光学检查以及基于微生物菌落的阈值水平或形状评估的微生物菌落的标识。
然而，目前花费相当长的时间来确实地标识表面上的微生物的生长，即，可能花费若干天来获得可靠的结果。过去尝试加速该过程导致了大量的假阳性结果，并且因而负面影响整个生产过程的产出。这部分归因于通过对表面进行成像获得的数据中包括的噪声。如果阈值水平太高，则在生长微生物达到阈值水平之前花费很长时间。另一方面，如果阈值水平太低，则许多噪声伪像可能导致大量的假阳性结果。
在过去的几十年中已经开发了将光学系统与计算机视觉技术整合以用于快速和自动检测以及微生物菌落和细菌细胞的计数和分类的若干种技术。荧光成像技术是其中之一，其用于检测和计算微生物菌落。该技术在微生物的最优生长条件下示出效率和良好的采收率（>90％），但其对于更快的污染测试不方便。
作为替代，基于图像的方法已被用于使用激光散射仪技术的微生物菌落的检测和区分。激光光照射培养微生物菌落的琼脂平板，然后使用CCD相机捕获和记录散射图案，以执行具有例如256灰度级的2D图像。该技术使用应用在大样本集合上的监督训练过程，以便使用诸如Zernike和Chebyshev矩或Haralick描述符之类的大量特征的组合来标识微生物菌落的原型。该技术非常耗时，并且它并不良好适于微生物菌落的在其第一生长期间以及在低或弱浓度下的检测和标识，因为不存在可以在那时被提供用于检测和分类过程的纹理特征或先验信息。
尽管已经建立了许多基于图像处理的方法以用于微生物菌落的检测和标识，但是它们仍然是传统的，并且它们不适合现今使用的最常见和创新的光学技术（在早期检测的框架中，图像是有噪声的并且具有低SNR（Signal-to-Noise-Ratio，信噪比）），并且不适合需要短培养期的苛刻工业条件以及可能存在的微生物的低浓度（稀有事件）。
此外，大多数这些方法的可靠性和效率通常取决于可以被视为限制的条件：菌落形态依赖性（例如，圆形、蛋白质的内部分布、分子结构）、菌落分布依赖性（例如，分离的微生物菌落）、样本尺寸、计算复杂度、所需的先验信息，这意味着手动测试/处理。
另一方面，非常需要设计一种方法，所述方法可以执行具有可靠结果的早期检测，对由任何成像系统形成的噪声具有高度稳健性，并且独立于微生物菌落的形态。然后可以良好地建立分类和计数。
因此，本发明的目的是提供用于确实地且快速地标识表面上的微生物的生长的设备和方法。
上述目的通过权利要求1的方法、通过权利要求10的装置以及通过权利要求16的计算机程序来实现。从属权利要求涉及本发明的不同有利方面。
本发明的基本概念是对从表面获得的图像数据执行统计评估，以便确定噪声分布的模型和参数。不符合预期噪声分布的图像部分/像素的值将被标识为可能的微生物。
为了增加检测的可靠性，可以对在稍后时间点处获得的相同表面的图像数据重复该处理。这是依赖于数据的时间分析并且将允许基于评估数据来在假阳性和真实事件之间区分的第一方法。
作为替代，图像表面的相同数据将使用不同的滤波器（例如，平滑滤波器）进行处理。平滑数据允许考虑用于检测的不同尺度，并因而促进检测与图像的面积相比具有大面积的菌落、覆盖大面积图像的多个菌落、或具有特定特性的菌落（例如霉菌）。
最后，在第三替代方案中，可以组合上述两种方法，并且可以考虑微生物菌落的时间和空间特性。
特别地，本发明提供了一种用于检测表面上的微生物菌落的方法，包括：获得所述表面的一个或多个数字图像，所述数字图像由像素值的至少二维矩阵表示；基于所述数字图像中的至少一个来计算统计噪声分布；将在计算步骤中计算出的统计噪声分布应用于所述一个或多个数字图像；和基于像素值与所述噪声分布的偏差来检测作为微生物菌落的候选而感兴趣的对象。
优选的是，该方法还包括以下步骤：通过在不同时间处对相同表面进行成像来获得多个数字图像。
进一步优选的是，该方法包括在对象检测步骤中将那些感兴趣的对象标识为微生物菌落，其基于两个或更多个数字图像而示出依赖于时间的生长。
根据另一实施例，该方法包括以下步骤：通过对表面进行成像来获得第一数字图像；和通过将相应的平滑滤波器应用于第一数字图像来获得多个数字图像的任何进一步的数字图像。
另外，优选的是，该方法包括以下步骤：
通过将相应的平滑滤波器应用于多个第一数字图像来获得多个数字图像的任何进一步的数字图像。
本发明进一步提出，通过在不同时间处对相同表面进行成像而获得的每个图像被用于通过应用以下步骤来获得多个图像：a）确定通过在不同时间处对相同表面进行成像而获得的图像中的一个作为第一数字图像；和b）通过将相应的平滑滤波器应用于所述第一数字图像来获得多个数字图像的任何进一步的数字图像；和c）针对通过在不同时间处对相同表面进行成像而获得的每个图像重复步骤a）和b）。
在本发明的方法中，像素值是表示表面的点或区域的相对高度的值。
另外，可以考虑在计算统计噪声分布之前将数学校正函数应用于像素值以用于补偿表面的任何弯曲。
特别地，统计噪声分布可以被建模为高斯随机场。
尽管已经通过方法特征描述了本发明，但是本发明不限于该方法。本发明还包括特别配置为执行上述方法中的任何一个的设备。
最后，本发明可以以包括计算机程序代码的计算机程序的形式实现，计算机程序代码在被加载到计算机的内部存储器中时将使得计算机执行如上所述的本发明的方法。
在下文中，将参考附图描述本发明的优选实施例，所述附图示出：
图1是第一实施例的流程图；
图2是第二实施例的流程图；
图3是第三实施例的流程图；
图4是第四实施例的流程图；和
图5是用于执行本发明的装置。
本方法基于背景，与现有技术中的基于微生物菌落的其他方法相反。它们主要依赖于它们的形状，例如识别圆形外形。存在若干种解决方案来解决检测问题并标识如现有技术中所见的微生物菌落。尽管如此，在我们的情况下，这些解决方案并未提供针对有噪声数据的完整分析和稳健检测结果，这意味着需要许多预处理和/或后处理和/或去噪步骤来以很少数量的假阳性检测和标识微生物菌落。
如图1所示并且如上所述的该第一实施例基于使用微生物菌落在背景图像中是稀有信号的假设来对背景图像进行建模并在背景图像中针对微生物菌落进行搜索。建模工程表面中最常见和最常用的概率模型是高斯和偏态高斯过程。也存在其他模型（比如贝塔、对数正态、伽玛或瑞利分布），但它们不太有吸引力。高斯过程是最有吸引力的模型，因为它们是完全且唯一地由其一阶矩和二阶矩确定的简单模型，并且它们在计算上很快。然而，“高斯化”（改变数据以使其对应于高斯模型的事实）可以是可行的，并且其通常提供用于拟合非高斯或未知模型的数据的良好解决方案。人们可以使用一种正交变换（比如PCA和ICA），其给出了未知PDF（概率密度函数）的最潜在“可高斯化”分量。
在污染微生物菌落的早期生长期间检测到污染微生物菌落的情况下，没有先验信息可用。这导致了无监督方法的实现。微生物菌落必须从形貌（topographic）表面粗糙度辨别。粗糙度形貌可以通过由平稳高斯随机场建模的真实2D图像表示。
对于下面的讨论，高斯随机场的定义将被限制为二维图像的情况下，其中空间由像素集合在采样点阵上表示。
考虑像素x∈S，其中S∈RN（在我们的情况下N=2）是图像的支持空间，并且令Z（x）是像素x处的相对高度的值，那么定义高斯随机场（GRF），如果对于每个选择x1、x2、……、xn以及任何任意n，峰值Z（x1）、Z（x2）、……，Z（xn）遵循具有以下形式的概率的多元高斯分布函数：
其中平均向量，并且n×n非负（或半正）定协方差矩阵C具有元素，并且行列式。
高斯随机场在广义和严格意义两者上都是平稳的，如果其均值是恒定的（独立于图像中的位置），并且其协方差函数，对于任何整数（i，j），仅取决于差异。如果协方差函数仅取决于任何两个位置之间的差异的欧几里得长度，使得，那么GRF称为各向同性或齐性的（homogeneous）。一般，均值可以从高斯随机场中减去，以便利用零均值GRF工作。在这种情况下，可以通过齐性零均值GRF建模的图像将具有在平移和旋转下不变的协方差函数。
已经在不存在微生物菌落的情况下在粗糙度形貌的图像上测试了该模型的有效性。
通过估计表面观测的粗糙度参数并从直方图数据分析以及从将表面的几何泛函（例如Minkowski泛函和Euler特性函数）拟合到高斯泛函来执行模型的验证（高斯性的测试）。
然后应用基于该模型的统计分析，以便尽可能早地检测不同类型的微生物菌落在粗糙度形貌之上的存在。该分析使用偏移集（excursion set）的概念，其将有助于估计检测阈值。具有高于该阈值的值的形成集群的所有像素将被视为感兴趣的对象。
检测阈值被估计并用于得到可以对应于微生物菌落的所有候选集群。由一个阈值给出的所有集群属于偏移集。
偏移集的概念被定义用于在可测量子集上定义的任何可测量的实值函数。将从高斯随机场获得的偏移集将被称为高斯偏移集。
偏移集的重要性来自采用在这些集之上携带的几何方法的需要，并且更具体地，在其中这些集从随机场计算的情况下。然后，可以导出关于其几何特征的预期。这样的几何方法有助于估计检测阈值。
随机场的偏移集的几何形状使用积分几何和微分拓扑框架两者来发展，并且允许定义欧拉特性（EC）的概念（表示为）以描述偏移集中的点与其拓扑特征之间的邻接性，或换句话说连通分量。
例如，偏移集可能由二进制分量组成，并且其中一些可能包含背景的封闭区域，称为“空洞（hole）”。在这种情况下，EC计数连通分量的数量减去空洞的数量。
对于高级偏移集和适当规则随机场，EC计数连通分量或集群的数量。
偏移集和高斯随机场的该概念对于统计数据处理领域的技术人员来说是众所周知的，并且在此将不再进一步详述。
然后执行基于高斯随机场的统计分析以测试检测到的集群的显著性（significance）并控制检测到假阳性的概率。
其包括应用峰高和空间范围测试来推断检测到的区域是否以存在的高可能性与感兴趣的微生物群落匹配，或者它们是否属于噪声（假阳性）。
第一阈值从欧拉特性函数获得，该函数近似局部最大值的平均数。该测试使得能够检测到尖峰强度值的所有潜在菌落。
第二测试被应用于通过设置低于上面获得的值的阈值而检测到的对象的平均尺寸。仅在背景图像上应用该测试意味着得到相对大尺寸的对象的概率可能偶然发生，这与包括微生物菌落的背景图像的情况相反。该测试使得能够检测到低峰值和显著尺寸的对象。
基于该理论，本发明提出以下方法，以用于使用从时间t处的表面粗糙度轮廓（profile）的图像所获得的数据以便作为结果获得指示微生物菌落的那些集群。
将错误率ε固定为0.0 1；
使用高斯随机场方法估计z并且对应的偏移集针对显著性的5％测试设置；
检测z和z-0.7处的所有候选集群；
对于所有候选集群做
计算P（h>h0））；
计算P（sz>s0）；
接受满足P（h>ho）<ε或
P（sz>s0）<ε的集群
其中z：阈值水平；
ho：z以上的最大高度；
h：在z以上检测到的一个集群的高度；
so：尺寸阈值；
sz：在z以上检测到的一个集群的尺寸；
ε：错误率；
其中Φ是正态累积分布函数。项是z以上的高斯随机场的偏移集的平均面积。然后，阈值z以上的尺寸sz≥s0的一个集群的空间范围的边际概率可以表达为
在下文将讨论说明本发明的一些示例。
两种不同类型的微孔膜滤器与不同的标准琼脂平板（R2A，TSA（Triptic Soy Agar，胰酶大豆琼脂），SDA（Sabouraud Dextrose Agar，沙氏葡萄糖琼脂））一起使用。膜之一由混合纤维素酯组成，亲水性47mm并且0.45/μm孔径，白色网格化（HAWG04700 [15]），并且第二种为Durapore膜，PVDF，亲水性47mm并且0.45μm孔径，白色，网格化。这些膜将分别被称为HA和HV。污染测试中使用的细菌培养菌株如下：绿脓杆菌ATCC 9027，嗜中温甲基杆菌ATCC 29983，异常德克拉酵母CBS 77和巴西曲霉ATCC 16404。通过膜HA和HV过滤样本，并且将膜置于琼脂平板上并在针对微生物菌落的生长而推荐的环境条件内培养。考虑若干个培养期以评价足够的样本以用于测试和验证两者。
使用的样本的总数为40个样本，其从包括四种菌株的两种膜获得。
在培养前和在每个培养期后，沿着测量设备的光轴放置膜。
光学测量系统由405nm波长的激光二极管光和相对于激光线倾斜的数字相机组成。发射激光束以照射垂直于光轴（X轴）放置的一个膜的线轮廓（穿过X轴的800个点）。通过Y轴的位移（displacement）使得能够扫描15768个轮廓，并且从轮廓的每个点的反射光由相机记录，从而形成膜的粗糙度拓扑的2D图像（800×15768像素）。所有光学组件都安装在试验板（breadboard）上，以使得能够实现稳定的定位和较小的振动效果。
由于相机的倾斜，从膜测量的轮廓将倾斜或者不线性地倾斜，取决于膜的形式，在这种情况下生成弯曲的表面和应校正的非期望总几何形状。膜样本名义上是平坦的，然而，实际上在样本长度之上仍然存在一些倾斜，这产生来自获取的曲面生成。因此，二阶多项式拟合被用于使用最小二乘算法然后从轮廓数据减去拟合的曲面来去除这样的误差。然后应用3×3中值滤波器以在不丢失位于高频处的所期望的信息的情况下去除异常值并增加信噪比。然后通过减去均值并将每个像素除以标准偏差来对图像进行归一化，以获得零均值和单位方差的值。
在下文，每个图像将包括两类数据：粗糙度形貌（噪声）和微生物菌落。将该方法应用于在培养期t0、t1、t2、t3和t4处从污染的膜获取的图像，其中t0表示培养前一天（此时微生物细胞保持在分辨率下），t1是细菌生长的第一天，并且t4表示培养期的最后一天。微生物菌落在时间t2处开始生长，并且其中一些在时间t4处或之前变得被测量系统明显地识别。遍及培养期应用该方法以证明其能够在微生物菌落几乎不能被识别时实现非常早的检测。在没有微生物菌落的图像的情况下，轮廓的实验性全局最大值在4.59处获得，而使用欧拉特性分析地获得的近似最大值对于p-值<0.05为z=5.07，并且对于p-值<0.01为z=5.4。
当图像包括微生物菌落时，微生物菌落的峰值针对5％和1％显著性两者相对高于z，这保证检测到z以上的非常少数量的假阳性。
在时段t0和t4期间，微生物菌落以对于0.05显著性测试处计算的阈值为100%并且对于0.01显著性测试为多于95％的精度稳健地检测到。由于检测错误所导致的假阳性的数量少于1％。
总之，本发明的主要目的是引入稳健且自动化的方法，该方法使得能够实现从由形貌成像设备所测量的生物表面（膜）的微生物污染物的早期检测。测量由包括粗糙度拓扑（噪声）和微生物菌落两者的2D图像表示。统计分析从高斯随机场的理论框架导出，以便估计将微生物菌落与噪声分离的检测阈值。
该方法呈现出非常好的结果、以及在所有培养期内对假阳性的较少敏感性。
如以上关于本发明的实施例所讨论的，用于检测微生物菌落的方法基于背景图像的模型的使用。该模型允许将允许检测的参数的计算（基于数据）。那些参数也可以用于表征检测到的内容。
实施例允许获得“对象”，即，可能的微生物菌落形式，以定位对象并对它们进行计数。
在向膜添加非活菌的情况下，则应去除另一种类型的假阳性，否则即使在没有微生物菌落的情况下，该方法也将指示微生物菌落的存在。
可以示出的是，隐含在培养期之前和之后的检测到的集群之间的匹配过程可以有助于去除不属于微生物污染的对象。
在图像的对象的步骤定位和计数之后，可以实现在不同时间处获得的图像的数据之间的“对象匹配”步骤，如图1所示。以这种方式，通过所示的后处理来实现可能的微生物菌落的验证。
在匹配对象发生变化的情况下，相应对象被标记为“生长对象”，否则其被标记为不相关。
也就是说，如果参考图像包括无意义的颗粒/对象，则执行上述后处理，以便通过将参考获得物与其他进行比较来从这些颗粒标识微生物菌落。
一般，该方法示出稳健且良好的结果。然而，匹配准则是经验性的，并且其取决于图像分辨率，并且其对参考图像和当前图像之间的任何可能的配准不良是敏感的，因此如果检测阈值不导致获得整个对象或者配准不良达到多个像素的程度，则将检测到假的微生物菌落。
作为结果，本发明提出了第二实施例，如图2所示，其修改第一实施例而不使用后处理阶段。
该第二实施例在模型中包括时间（时空分析）。
为了在不使用后处理阶段的情况下在微生物菌落和其他类似对象之间区别，将时间添加到检测过程。产生至少两个获得物，其中第一在t0处并且其他在生长期间。
微生物菌落在表面培养基上不隔离；存在也可以存在于该表面上的不重要的一些颗粒。因此，为了避免向每个获取的图像应用阈值然后处理来自每个阈值的检测结果，本发明的第二实施例的构思是构建处理遍及不同培养时间所获得的时间序列图像的一个模型（即，一个检测阈值）。
第一图像是背景图像，并且下面的（n-1）个图像是包括在微生物群落的时间生长期间的微生物群落的图像。
在微生物菌落标识的意义上，该实施例示出了比第一实施例更好的结果。
尽管如此，向涉及获得物的分辨率的图像应用该模型，这可能会对检测的稳健性（估计阈值）造成不可忽视的影响。
此外，可能需要表征检测到的微生物菌落，比如例如估计它们的尺寸和几何特征。
一般，由任何光学设备所观测的微生物菌落将根据观测的尺度而表现不同，并导致多级噪声观测。为了处理这些问题，本发明提出了第三实施例，如图3所示。
第三实施例包括尺度空间分析以检测任何尺寸的对象并且估计它们的真实尺寸。噪声始终存在，其来自背景、获取系统等。其通过信噪比（SNR）进行量化，而在低SNR的情况下（对象类似于噪声），它们很难检测。然后改进是在若干个尺度上考虑信号。这意味着图像以若干个程度进行平滑。该平滑使得能够得到更好的SNR以及对象信号的更好匹配。该实施例建议通过适当的模型将尺度空间策略整合到检测过程，以用于更好的检测和参数计算或特性两者。
基于尺度空间建模的解决方案被用于将图像分解成若干个尺度，因而获得多个图像，每个图像对应于特定尺度。
为了最佳检测结果，选择平滑滤波器以拟合微生物菌落的一般形状。第二和第三实施例两者是互补的解决方案并且在本发明的应用中需要。
第二实施例解决了对象标识和区分的问题，并且第三实施例被指定为改进SNR以用于更好的检测和对象表征。尽管如此，独立地应用每个解决方案取决于应用需求。对于本发明的应用，使用一个实施例在计算上不是耗尽的，并且应用多于一个连续实施例可以将不合期望的结果从一个解决方案变换到另一个（受第二解决方案的错误所影响的一个解决方案的结果的偏向）。因此，提出合并第二和第三实施例的融合过程作为完整且稳健的解决方案。
如图4所示，该第四实施例的构思是构建合并由第二和第三实施例给出的尺度和时间准则两者的完整和统一的模型。时空尺度空间模型被构建为在不存在微生物菌落的情况（虚假设情况）下对（n）个时间序列图像进行建模。使得当模型应用于虚假设时，每个检测都被视为假阳性，因此，假阳性的数量可以是有界的。否则，当模型应用于包括微生物菌落的数据时，每个检测将被视为真实的，如所有先前实施例的情况那样，其中一个差异涉及得到最佳最小化假阳性数量和更少的偏向性结果。本文，模型整合了尺度空间和时空实施例两者。
在不同的培养时间处获取至少两个图像，并且每个图像通过尺度空间滤波器进行平滑。
根据本发明，一旦用实施例1至4中任一个的所描述的方法检测到，就可以对微生物菌落进行计数。然后，这样的解决方案可以整合到用于生物负载（bio-burden）研究的应用中，其中具有稳健的计数。
事实上，该系统将不考虑不是微生物菌落的对象，并且将由于改进的外形和形状定界而能够区别和计数微生物菌落的集群。另外，当使用时空和/或尺度空间时，可以获得微生物菌落的特性，其可以用于例如生长速率、尺寸、几何特征（外形、伸长率、直径、……）、尺度、在尺度间隔之上的微生物菌落的寿命等的标识。
包括尺度空间的实施例3良好地适于微生物菌落的几何特征的研究，因为其允许微生物菌落的非常稳健的定位和定界。其提供面积、外形等的更好估计。所提取的特征可以被视为要在传统机器学习方法中分析的先验信息。
该方法可以稳健地检测在生长的早期阶段处的微生物菌落。
本发明提供了一种快速且在计算上高效的方法。其旨在限制和最小化假阳性的数量，因此与现有技术中的其他方法相比，其是稳健的且提供更低的虚假检测。
第三或第四实施例的平滑滤波器可以适于使用具有变化特性的一堆滤波器来拟合任何形状的微生物菌落。
本发明可以在没有后处理的情况下一次同时实现检测和区分。
如在第一和第三实施例中定义的本发明可以应用于包括隔离的微生物菌落的一个图像，而不使用时间生长准则。
该方法提供可以用于表征微菌落以用于分类目的的尺度、尺寸和其他几何特征、时间生长间隔以及在尺度间隔之上的微生物菌落寿命。
在使用整合时间和多尺度分析的第四实施例的情况下，本发明提出了使用时空尺度空间高斯随机场。微生物菌落通常不是隔离的，并且不明显的颗粒可以与微生物菌落一起存在于膜表面上。在该操作模式下，使用微生物菌落的生长准则并且时间间隔满足。
尽管已经基于方法描述了本发明，但是本发明当然可以被实现为一种装置，所述装置包括：用于获得表面的一个或多个数字图像的部件1，所述数字图像由像素值的至少二维矩阵表示；用于基于所述数字图像中的至少一个来计算统计噪声分布的部件3；用于将在计算步骤中计算出的统计噪声分布应用于多个数字图像的部件5；和用于基于像素值与噪声分布的偏差来检测作为微生物菌落的候选而感兴趣的对象的部件7，如图5所示。
如上所述，用于获得表面的一个或多个数字图像的部件1可以是CCD相机以执行具有256灰度级的2D图像并且可以包括激光二极管LD。它们可以进一步包括用于相对于相机和激光二极管保持样本的台9或桌子。
用于计算统计噪声分布的部件、用于应用统计噪声分布的部件、用于检测感兴趣的对象的部件可以被实现为计算机。
尽管已经关于实施例1至4描述了本发明，但是本发明不限于这些实施例。如所讨论的，可以使用除高斯随机场之外的不同方法。