本申请涉及检测短同聚核酸重复、特别是短同聚微卫星中的核苷酸数量的变化，例如用于诊断肿瘤中的微卫星不稳定性(msi)和/或错配修复缺陷(mmr-)的目的。因此，提供了用于检测段同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法以及用于自动化检测所述变化的试剂盒(kit)和筒(cartridge)。
发明背景
dna错配修复(mmr)是一种进化保守的多因子系统，用于识别和修复进入基因组中碱基的错误插入或缺失(“插入缺失(indel)”)，其可能在复制或重组过程中或修复某些形式的dna损伤过程中发生。与上述一致，有证据表明mmr受损与基因组不稳定性相关，因此也与癌症进展有关。
事实上，在包括白血病、卵巢癌、胰腺癌或胃癌的几种癌症类型中已经描述了mmr缺陷，并且mmr缺陷是造成lynch癌症易感综合征的确定原因，该综合征占所有子宫内膜(em)或结直肠(crc)肿瘤的2-5％(jiricny,2006)。重要的是，mmr缺陷肿瘤在标准癌症治疗后显示不同的预后和治疗结果(ngandschrag,2010)。例如，来自crc患者的mmr缺陷型肿瘤似乎对基于5-氟尿嘧啶的化疗没有反应(fischeretal.,2007)，所述化疗是crc的首选化疗。此外，mmr缺陷型肿瘤还倾向于对经常用于em癌症治疗的顺铂和卡铂的抗性(hewishetal.,2010)。最后，还观察到这些肿瘤相对较快地产生对靶向治疗的抗性，这可能是由于它们的可突变性增加，并且因此也更容易获得能够潜在影响其他抗癌防御的二次突变。
由于事实上mmr缺陷被证实会影响患者对癌症治疗的反应，因此mmr缺陷的有效检测可能会对患者的有效管理并对患者的生存产生深远的影响。由于影响mmr通路的突变的复杂性，在临床实践中，通过筛选mmr缺陷的直接后果是dna复制错误而不是对mmr基因例如mlh1、msh2、msh6或pms2中选择的突变进行详细筛选从而测试mmr缺陷更为常见(peltomaki,1997)。被称为微卫星的短串联重复序列长度变异的变化(一种被称为微卫星不稳定性或msi的现象)最好地表现了这些dna复制错误。
微卫星通常是大片的一至五个核苷酸的dna基序相邻重复5至50次(即，串联重复)。它们广泛分布于整个完整的哺乳动物基因组中，并且最常位于基因组的非编码部分。由于这个原因，许多微卫星都是生物沉默的，这使得它们能够在世代中累积无害的突变，这能够用于dna指纹分析或其他鉴定目的。然而，在单个个体组织中但不在周围组织中的多个微卫星中的一个或多个微卫星重复单元的克隆丢失(缺失)或获得(插入)是缺陷复制的标志并强烈表明受损的mmr和发展癌症的倾向(pinoletal.,2005)。
目前，msi分析的金标准包括在癌症患者dna中对至少5种微卫星标志物的长度进行基于pcr的测试，所述微卫星标志物包括长度为25和26个核苷酸的2个单或同聚物(bat25、bat26)和3个二核苷酸重复序列的2个单或同聚物(d2s123、d5s346、d17s250)(bolandetal,1998)。这5种msi标志物的组由美国马里兰州贝塞斯达的国家癌症研究所研究会首次提出，因此现在被广泛称为贝塞斯达组。如果标志物中30％或更多的标志物(5种标志物的组中的至少2种)被测试为不稳定的，则用贝塞斯达组测试的样品被指定为具有高频率的msi或“msi-h”表型。如果五种标志物中的一种标志物(或肿瘤标志物中<30％的标志物)被评分为msi阳性，则该样品被指定为msi-低或“msi-l”。最后，如果没有发现标志物发生改变，则样品被认为是msi-稳定或“mss”(bolandetal,1998)。
尽管是目前的msi测试标准，贝塞斯达组倾向于表现出低灵敏度，特别是对于鉴于其最初开发的结肠直肠癌以外的癌症(bolandetal,1998)。因此，已经充分测试了备选标志物，包括例如在murphyetal,2006和garcia-alfonso2012和wo2013153130中提到的标志物。
目前这些已知方法的另一个缺点是它们的复杂性、需要超出标准实验室热循环仪的专用仪器以及它们自动化的可行性有限。目前现有的msi检测技术采用以下原理之一：(i)使用荧光标记的引物检测贝塞斯达组标志物，然后进行毛细管电泳；(ii)使用dsdna嵌入式染料高分辨率解链曲线分析5种贝塞斯达组标志物；(iii)质谱检测不同长度的等位基因；和(iv)大dna区域(例如外显子组)的下一代测序，然后计算突变的数量。
例如，(i)最初的基于pcr的贝塞斯达筛选策略需要专家观察者的解释，这妨碍了有效和直接的自动化。然后，(ii)使用dsdna嵌入式染料并且还使用长的贝塞斯达组标志物的高分辨率解链曲线分析，尽管原则上适用于标准pcr热循环仪，但在一次运行中筛选几种不同msi标志物的多重处理能力非常有限，因为每种标志物扩增子的解链温度需要足够不同以免产生重叠信号。此外，由于该策略依赖于在正常和突变长度等位基因之间形成异双链体，所以与其他替代策略相比，它也不太灵敏。接下来，(iii)基于质谱的方法(zhaoetal,2014)原则上也适用于自动化，但需要专门的仪器设备和高技能的人员进行数据解释。最后，(iv)通过下一代测序(ngs)检测msi状态并且计数观察到的突变的数量无疑具有在基因组或外显子组中观察非常多数量的位置的优势，而不仅仅是在选择性标志物具有对msi的高灵敏度。然而，尽管这种方法原则上也至少部分可自动化，但其目前非常昂贵，需要专门的ngs仪器，并且由于产生大量数据仍然是耗时且复杂的，这仍然需要通过专家进行分析。
因此，目前现有的测定msi状态的技术都有一定的缺陷，或者与其有限的检测能力、成本和周转时间有关，或者需要专门的附加设备以及训练有素的专家对结果的解释。本发明通过提供用于检测任何标准定量pcr热循环仪器能够使用的短同聚微卫星中核苷酸数量变化的高灵敏度、适合多重处理且完全可自动化的方法来解决上述问题。继续介绍本发明的这个优点和其他优点。
发明概述
本发明在所附独立权利要求中限定。优选实施方案在从属权利要求中限定。具体而言，本发明涉及检测长度等于或短于15bp的同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法，该方法包括以下步骤：
-通过扩增包含靶同聚重复序列的核酸序列产生扩增子；
-在存在至少一种信号产生寡核苷酸探针的情况下加热所产生的扩增子，所述信号产生寡核苷酸探针包含能够与靶同聚重复序列杂交的序列，并且检测由所述探针产生的信号在温度的函数中的强度变化以获得至少一条解链曲线；和
-从所述至少一条解链曲线推导存在于靶同聚重复序列中的核苷酸数量；
在优选的实施方案中，本发明的方法使用荧光标记的探针检测标准定量pcr热循环仪器中短同聚重复区域中的长度变异，而无需任何另外的设备进行pcr后分析。因此，在特别有利的实施方案中，信号产生剂是至少一种标记的(即信号产生)寡核苷酸探针，优选为分子信标探针，其包含与靶同聚重复序列互补的序列并且能够与所述靶同聚重复序列及其特异性侧翼序列杂交。最优选地，能够与靶同聚重复序列杂交的序列包含与所述靶同聚重复序列的突变体相同或完美互补的序列，所述突变体包含所述靶同聚重复序列中与其野生型相比的至少一个同核苷酸的缺失。
在进一步的方面，本发明提供用于检测长度等于或短于15bp的靶同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的试剂盒(优选以筒的形式)，所述试剂盒包含至少一种、优选多种分子信标寡核苷酸探针，每种分子信标寡核苷酸探针包含能够与包含长度等于或短于15bp的不同靶同聚核苷酸重复序列杂交的序列；所述试剂盒优选还包含校正聚合酶。有利地，所述分子信标探针中的每一种包含能够与不同靶同聚核苷酸重复序列杂交并且与所述不同靶同聚重复序列中的每一种的至少单个同核苷酸缺失突变序列相同或互补的序列。
最后，本发明还提供本文所提供的方法、试剂盒和/或筒用于检测(特别是在来自癌症患者的样品中)微卫星不稳定性(msi)的用途。
附图简要说明
结合附图参考以下的详述以更充分地理解本发明的本质，其中：
图1：显示表征tmem65特异性分子信标探针与tmem65同聚重复序列中具有不同数量的同核苷酸的三个靶序列杂交的温度函数的杂交动力学的解链曲线(图a)和解链峰(图b)；
图2：显示表征10个野生型(wt)和微卫星稳定(mss)样品(黑色曲线，tmem65重复长度11)和10个微卫星不稳定(msi-高[msi-h])样品(灰色曲线，tmem65重复长度10)中tmem65微卫星稳定性状态的解链峰；
图3：显示两个随机选择的mss样品mss1和mss2的tmem65探针的解链峰；
图4：显示了3个随机选择的msi-h样品(msi-h1-3)的tmem65探针的解链峰，每个针对msi稳定样品mss1获得的tmem65探针解链峰进行显示。
图5：显示abat-标志物特异性分子信标探针的解链峰，其包含(图a)对q5聚合酶的外切核酸酶活性具有抗性的茎，或(图b)q5聚合酶降解的茎。
发明详述
本发明涉及用于检测短(即比贝塞斯达组标志物bat25至少短10个核苷酸)的同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的极微小变化(例如+/-1nt)新的方法、试剂盒和筒以及其用途。与此相一致，本发明提供了用于检测短(<15bp，优选<12bp)同聚微卫星标志物的不稳定性的方法、试剂盒和筒以及其用途，所述标志物例如在wo2013153130中所述的那些标志物。
具体而言，本发明涉及检测长度等于或短于15bp、优选12bp的同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法，该方法包括以下步骤：
-通过扩增包含靶同聚重复序列的核酸序列产生扩增子；
-在存在至少一种信号产生寡核苷酸探针的情况下加热所产生的扩增子，所述信号产生寡核苷酸探针包含能够与靶同聚重复序列杂交的序列，并且检测由所述探针产生的信号在温度的函数中的强度变化以获得至少一条解链曲线；和
-从所述至少一条解链曲线推导存在于靶同聚重复序列中的核苷酸数量。
本文提供的方法具有完全可自动化的优点，并且适用于任何标准定量pcr热循环仪器，其允许由常规实验室人员执行而无需专门培训。除了上述的内容之外，该方法是高度灵敏的、适合多重处理的，能够提供所检测到的同聚核苷酸重复序列及其变体的相对量的估计。
目前现有的msi检测方法存在以下缺点：(a)为了测定重复长度，它们需要额外的专用设备来进行pcr后分析和/或这种分析通常需要由训练有素的专家进行解释；或(b)在使用dsdna嵌入染料的高分辨率解链曲线的情况下，缺点是避免来自不同扩增子的解链信号重叠的多重处理能力非常有限，并且此外，它不能定量不稳定(突变)序列相对于稳定(野生型)序列的量。
本申请通过使用对突变体荧光高度灵敏的标记探针进行(preform)解链曲线分析来克服这些缺点，其中每种标志物能够在不同的荧光通道中被检测到。在其灵敏度特别优选的实施方案中，探针中能够与靶同聚重复序列杂交的序列包含与所述靶同聚重复序列的突变序列相同或互补的序列，所述突变体包含所述靶同聚重复序列中与野生型(即预计)形式相比的至少一个同核苷酸的缺失。
与这些一致,在优选实施方案中，本发明提供了涉及检测长度等于或短于15bp的同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法，该方法包括以下步骤：
-通过扩增包含靶同聚重复序列及其特异性侧翼序列的核酸序列产生扩增子；
-检测由与靶同聚重复序列及其侧翼序列特异性杂交的探针产生的信号；和
-推导存在于靶同聚重复序列中的核苷酸数量；
所述方法特征在于，探针包含与所述靶同聚重复序列的突变序列相同或互补的序列，其中所述突变序列包含所述靶同聚重复序列中与靶同聚重复序列的预计野生型形式相比的至少一个同核苷酸的缺失。
如本文所用的术语“核酸”和如本文所用的它的等价的“多核苷酸”是指包含核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。核酸包括但不限于dna和rna，例如，包括基因组dna，线粒体或medna，cdna，mrna，rrna，trna，hnrna，微rna，lncrna及其各种修饰形式。通常可以从天然来源如从不同类型的生物获得的生物样品获得核酸。另一方面，也可以在任何已知的人为设计的方法(例如pcr)中合成、重组或以其他方式产生核酸。
自然地，在优选的实施方案中，扩增优选通过聚合酶链式反应或pcr使用用于进行pcr的工具如热循环仪来进行。有利的是，为了更好的自动化目的，优选使用用于进行qpcr的工具来进行pcr，所述qpcr提供对由信号产生试剂产生的信号的便利监测。
术语“定量pcr”或简称为“qpcr”在本文中给出基于聚合酶链式反应(pcr)的实验室技术的定义，其用于扩增并同时检测或定量靶向的dna分子。与反应产物在结束时被检测到即在热循环已经完成后被检测到的标准pcr相反，qpcr的关键特征是随着反应“实时”进行，在热循环期间检测到dna产物；因此，qpcr的替代名称是“实时pcr”。目前存在许多不同类型的qpcr。例如，当从逆转录(rt)步骤开始时，qpcr能够用于定量信使rna的数量，然后称为逆转录酶qpcr或rt-qpcr。如本文所用的术语“定量pcr”或简称为“qpcr”将优先于术语“实时pcr”或“rt-pcr”使用，以避免与逆转录pcr混淆，逆转录pcr也常常缩写为rt-pcr。大多数qpcr使用实时检测产物扩增的两种最常见方法之一：(a)非特异性荧光染料嵌入任何双链dna，或(2)由用荧光报道分子标记的寡核苷酸组成的序列特异性dna探针，所述荧光报道分子仅在探针与其互补靶序列杂交后才允许检测。在热循环期间产生的荧光信号由适当的光学检测系统检测并且从它们通过背景阈值的时刻开始追踪直到反应达到平台。通常可以通过分析获得的扩增曲线的形状(标准曲线策略)或通过确定信号何时升高到某个阈值以上(通常称为ct值，但是有时也称为cp值或cq值)来使用相对或绝对量化策略来估计靶序列的拷贝数。在相对定量中，使用ct或标准曲线分析在给定样品中估计的靶核酸水平表示为相对于另一参考样品(例如未处理的对照样品)中的相同靶标获得的值。相反，在绝对定量中，qpcr信号使用标准曲线与输入拷贝数相关，或者也可以根据最近的数字pcr方法计算。目前，第一种策略仍然比较普遍，并通过将获得的值与之前制作的标准曲线进行比较来基于靶dna量的估计。这些和其他qpcr量化策略在本领域中是广泛已知的，并且它们的计算可以根据给定的应用和qpcr系统以更小或更大的方式不同。
如本文所用的术语“用于进行定量pcr的工具”应理解为用于进行qpcr的试剂和元件的最小必需安排(arrangement)。它们通常将包括允许在从核酸源接收的核酸模板的实时pcr热循环中可检测的任何试剂。这些试剂包括但取决于qpcr的类型不限于pcr级聚合酶，至少一个引物组，可检测染料或探针，dntp，pcr缓冲液等。此外，“用于进行定量pcr的工具”通常将还包括本领域中已知的任何标准的最小部件装配件，其通常包括但不限于以下：(1)能够发生实时可检测的热循环的合适隔室(进一步称为“热循环qpcr隔室”)。这种隔室可以例如由适于扩增核酸的腔室形成，即由合适的材料制成并提供足够的内部温度调节，并且还包括至少一个允许实时检测在这种扩增期间产生的信号的壁，例如，透光的壁。此外，(2)用于改变该腔室或其他隔室中的温度的工具，如从各种现有的热循环机器广泛已知的。然后，(3)用于检测在qpcr热循环过程中产生的信号的工具，如耦合到计算机等的光学检测器。简言之，这种最小的装配件通常将包括本领域任何已知能够启动和维持热循环qpcr隔室中热循环反应、调节和调控温度以确保其中的稳定热循环条件等的系统；此外，它还将包括任何适当的检测设备、数据处理工具(例如，可选地连接到数据库的计算机)以及允许实时读取和监测qpcr反应的热循环的输出系统(通常在适当的图形用户界面中显示反应进程的计算机屏幕)；以及适用于操作机器和/或显示并且可能还帮助解释所获得的结果的任何软件包。
原则上，在可能的实施方案中，适用于进行解链曲线分析的任何靶特异性寡核苷酸探针能够用于本发明的方法中。优选的已知探针可以包含由荧光团和猝灭剂组成的对，并且还可以有利地形成诸如环或发夹的二级结构。
在优选的实施方案中，至少一种标记的寡核苷酸探针是分子信标寡核苷酸探针。分子信标探针(或分子信标)是具有内部淬灭的荧光团的发夹形分子，其荧光在它们与靶核酸序列结合时恢复。由于这个原因，分子信标不会被聚合酶的作用降解，并且能够用于通过解链曲线调用来研究它们与其靶标的杂交动力学。典型的分子信标探针长约25个核苷酸，但可以更长。通常，至少中间15个核苷酸与其核酸靶互补，而每个末端的5个核苷酸彼此互补，这允许信标装配成环或发夹结构。没有与其靶标杂交的分子信标可以分成4个结构部件：(1)环，其是与靶序列互补并杂交的18-30bp区域；(2)茎，其是由环的两个末端的彼此互补地结合的末端5-7个核苷酸形成的；(3)共价连接在分子信标的5'末端的荧光团；和(4)共价连接到分子信标的3'末端的猝灭剂。这样的结构确保当信标不与其靶标杂交并封闭在发夹结构中时，猝灭剂淬灭染料的荧光发射，从而不产生信号。但是当发生杂交时，在核酸靶标和分子信标的环之间形成双链体，其破坏发夹结构，从染料中除去猝灭剂，并最终导致产生荧光信号。
在上述实施方案的优选实施方案中，分子信标寡核苷酸探针包含与同聚重复序列突变体相同或互补的序列,所述同聚重复序列包含靶同聚重复序列中至少一个同核苷酸的缺失。这样的分子信标设计允许以高灵敏度特异性检测所选择的msi标志物，其中已经发生了聚合酶滑脱错误，同时对具有至少一个同核苷酸更长重复的野生型(即预计)标志物形式保持足够的灵敏度。应该指出的是，术语“靶同聚核苷酸重复序列”是指野生型或参考同聚重复序列，如其在没有msi存在的条件下预计的那样。相反，“突变同聚核苷酸重复序列”是指包含同聚重复序列中至少一个同核苷酸的插入或缺失的同聚核苷酸重复序列。
由于给定分子信标探针对一种同聚重复标志物及其不稳定(突变)变体的特异性，因此也可以设计多重测定，其中在一个反应管或隔室使用至少两种分子信标探针。
因此，在特别有利的实施方案中提供了这样的方法，其中使用与第一分子信标寡核苷酸探针进行不同标记的至少第二分子信标寡核苷酸探针，其中所述第二分子信标寡核苷酸探针包含能够与第二靶同聚核苷酸重复序列杂交的序列，所述第二靶同聚核苷酸重复序列不同于第一靶同聚核苷酸重复序列。
优选使用特别特定的分子信标探针。因此，在有利的实施方案中提供了这样的方法，其中能够与第二靶同聚核苷酸重复序列杂交的序列包含与突变序列相同或互补的序列，所述突变序列包含所述第二靶同聚重复序列中至少一个同核苷酸的缺失。
在同聚重复区域的扩增过程中，已知发生聚合酶滑脱。这会导致在拷贝原始数量的重复核苷酸方面的错误，导致人工缺失或插入在扩增的pcr产物中的积累。因此，在本发明方法的另一优选实施方案中，在包括校正聚合酶即具有3'-5'外切核酸酶活性的聚合酶的pcr中进行产生扩增子的步骤。许多这样的pcr级聚合酶是已知的并且可商购获得的。实例包括但不限于像q5、pfx、pfu、extaq等的聚合酶。
在上述实施方案的进一步发展中，为了保护寡核苷酸探针免受校正聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性可能构成的潜在威胁，有利的是以如下方式在结构上修饰信标：它们不能被消化。因此，在本发明方法的特别有利的实施方案中，特别是从测定稳定性的观点来看，至少一种标记的信号产生寡核苷酸探针包含保护所述探针免于聚合酶的3'-5'外切核酸酶活性的结构特征或修饰，所述结构特征或修饰优选选自：
-在探针的3'末端的反向dt；
-位于探针的3'末端的最后三个核苷酸中任一个之前的至少一个硫代磷酸酯键。
已经观察到，取决于校正聚合酶，一些校正聚合酶不消化某些分子信标，其茎由某些序列产生。这个出乎意料的观察结果可能是由于分子信标的茎取决于它们的序列具有不同的3d结构的事实。因此，可以假设某些校正聚合酶不能攻击其茎结构与校正聚合酶的催化中心不相容的分子信标。不管其机制如何，我们已经观察到提供一些类型的分子信标的茎能够使它们对某些校正聚合酶的3'-5'外切核酸酶活性完全免疫。根据以上内容，在替代实施方案中提供了这样的方法，其中序列特异性探针是分子信标寡核苷酸探针并且其中保护性结构特征或修饰是3'-5'核酸外切酶活性抗性茎。通过本领域已知的任何克隆或核酸重组技术，这样的茎可以容易地移植到感兴趣的分子信标。
本发明方法的主要优点之一是其直接的自动化和适应性，特别是在已知的标准qpcr系统上。因此，在特别优选的实施方案中提供了本发明的方法，其中以下步骤是在自动化系统中进行的：
-通过扩增包含靶同聚重复序列的核酸序列产生扩增子；
-在存在信号产生寡核苷酸探针的情况下加热所产生的扩增子，并且检测所述信号在温度的函数中的强度变化以获得至少一条解链曲线；和
-从所述至少一条解链曲线推导存在于靶同聚重复序列中的核苷酸数量。用于这样的自动化的特别合适的系统是biocartisidylla平台，其进一步提供了样品处理的自动化。
有利地，可以提供根据本发明上述实施方案的方法，其中所述方法在以下任何步骤之前进行：
-提供可能包含靶同聚重复序列的核酸源，优选所述源是生物样品；
-从核酸源释放和/或分离可能包含靶同聚重复序列的核酸；
-给产生扩增子的步骤提供可能包含靶同聚重复序列的所述释放的和/或纯化的核酸；
其中至少以下步骤也是在自动化系统中进行的：
-从核酸源释放和/或分离可能包含靶同聚重复序列的核酸；
-给产生扩增子的步骤提供可能包含靶同聚重复序列的所述释放的和/或纯化的核酸。
在进一步特别有利并且要求最小处理和技术准备实施方案中可以提供这样的方法，其中至少以下步骤是在可与所述自动化系统接合的筒中执行的：
-从核酸源释放和/或分离可能包含靶同聚重复序列的核酸；
-给产生扩增子的步骤提供可能包含靶同聚重复序列的所述释放的和/或纯化的核酸；
-通过扩增包含靶同聚重复序列的核酸序列产生扩增子；和
-在存在信号产生寡核苷酸探针的情况下加热所产生的扩增子，并且检测所述信号在温度的函数中的强度变化以获得至少一条解链曲线。
如本文所使用的，术语“筒”应理解为腔室和/或通道的独立装配件，其形成为单个物体，所述物体能够作为适用于接收或连接到这种筒更大的仪器内部或外部的一个适配件进行转移或移动。容纳在筒中的一些部件可以被牢固地连接，而其他部件可以灵活地连接并且可以相对于筒的其他组件移动。类似地，如本文所使用的，术语“流体筒”应理解为包括适于处理、加工、排出或分析流体、优选液体的至少一个腔室或通道的筒。此类筒的实例在wo2007004103中给出。有利地，流体筒可以是微流体筒。在流体筒的上下文中，术语“下游”和“上游”可以定义为设计在这样的筒中流体以其流动的方向。即，流体流向同一筒中的第二部分的筒中的流体路径的一部分应被解释为定位在第二部分的上游。类似地，流体稍后到达的部分相对于所述流体较早通过的部分定位在下游。
一般而言，如本文所用的术语“流体”或有时“微流体”是指处理流体的行为、控制和操纵的系统和安排，所述流体在几何上被限制为小的、在至少一个或两个维度上(例如宽度和高度或通道)通常亚毫米级。这种小体积流体以微尺度进行移动、混合、分开或以其他方式处理，需要小尺寸和低能耗。微流体系统包括诸如微型气动系统(压力源、液泵、微型阀等)和用于处理微升、纳升和皮升体积的微流体结构(微流体通道等)的结构。示例性流体系统记载于ep1896180、ep1904234和ep2419705中，并且能够因此被应用于本文所述发明的某些实施方案。
在根据上述列出的实施方案的特别期望的实施方案中，为了简化和便利对根据本发明的方法的结果的解释，解链曲线的分析也借助于计算机实现的软件以自动方式执行。可以给这样的软件指令以识别表征特定探针与特定靶标的杂交的确定的解链峰(或拐点)的特征位置，并通过绘制针对所述探针和靶对获得的解链曲线的负一阶导数而获得。因此，在另一优选实施方案中提供了本发明的方法，其中从至少一条解链曲线推导存在于靶同聚重复序列中的核苷酸数量的步骤是通过评估所述解链曲线的一阶导数的至少一个峰的位置或相对位置进行的，并且最优选以完全自动方式进行。
另一方面，本发明还提供用于进行根据本发明的方法的试剂盒。具体而言，本发明提供了用于检测长度等于或短于15bp的靶同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种分子信标寡核苷酸探针、优选多种分子信标寡核苷酸探针，每种分子信标寡核苷酸探针包含能够与包含长度等于或短于15bp的不同靶同聚核苷酸重复序列杂交的序列，并且优选所述试剂盒还包含校正聚合酶。优选地，所述多种分子信标探针中的每一种包含能够与特定靶同聚核苷酸重复序列(优选不同于其他分子信标靶同聚核苷酸重复序列)杂交并且与所述特定靶重复序列的突变形式相同或互补的序列，使得与野生型形式相比，所述突变形式在所述靶同聚重复序列中遗漏至少单个同核苷酸(即所述突变形式为缺失)。
在优选的实施方案中，以筒的形式提供试剂盒。因此，有利地，本发明提供试剂盒，其中所述至少一种、优选多种分子信标寡核苷酸探针，并且还优选校正聚合酶，提供于可与所述自动化系统接合的筒中。如上所述,筒和可与其接合的自动化系统的合适实例是biocartisidylla平台。该系统和类似可适用于本发明的系统的进一步的详细内容可见于wo2007004103、ep1896180、ep1904234和ep2419705。如从本文引用的文献中可以理解的，有利的筒不仅包括用于进行pcr的工具，而且还可以被设计为直接接收核酸源或样品，从所述核酸源释放核酸，并且提供(例如通过泵送)如此释放的核酸用于随后的基于pcr的测定。
如本文所用的术语“核酸源”应理解为包含或预计包含核酸的任何液体或固体物质。核酸源可以是例如包含合成或重组核酸的人工产生的溶液，其中例如含有连接产物、电泳标志物(所谓的“梯状标志物”)、引物原液等的溶液。然而，最常见的是，核酸源将是从生物或形成其或从其衍生的细胞获得的生物样品，优选获得自患者的临床样品。
如本文所用的术语“生物样品”(或简称为“样品”)旨在包括含有核酸和/或细胞材料的各种生物源，而不管它是从生物中新鲜获得(即新鲜组织样品)还是通过本领域已知的任何方法保存(例如ffpe样品)。生物样品的实例包括：诸如哺乳动物细胞以及真核微生物的细胞培养物，体液，体液沉淀物，灌洗样本，细针抽吸物，活检样品，组织样品，癌细胞，从患者获得的其他类型的细胞，来自组织的细胞或来自被测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养细胞或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血，骨髓，脑脊液(csf)，腹膜液，胸膜液，淋巴液，血清，血浆，尿，乳糜，粪便，射精，痰，乳头吸出物，唾液，拭子样本，洗涤液或灌洗液和/或刷子样本。
一旦将生物样品提供给系统或在进行本发明的方法期间，其通常将生物样品与组合物接触以提供其中核酸得到释放的裂解物。如本文所用的通过“接触”是指将样品和组合物合并、暴露、孵育或混合。“释放(releasing)”是指释放(liberating)、获得和/或逆转交联。为了从样品中释放核酸，可能需要来自组合物的蛋白酶活性和ph缓冲。释放可能需要组合物具有潜在的除研究样品中存在的核酸以外的组分的沉淀活性和去除/溶解固定剂。释放可能需要加热或高强度聚焦超声(hifu)等条件。在根据本发明精神的一个实施方案中，将生物样品引入与诸如诊断分析仪的自动化系统兼容的筒中，其中涉及发生与各种溶液接触和释放核酸的样品处理步骤。
此外，术语“用于从生物样品中释放或纯化核酸的工具”应理解为本领域已知用于从细胞或者生物样品中的其它结构释放核酸的任何多种或化学试剂和/或物理元件，并且，在纯化的情况下，将所述核酸与不想要的样品碎片充分分离成可接受的纯形式(其中术语“可接受”取决于这种纯化的核酸的进一步目的)，通常以水溶液的形式。适用于此目的的化学试剂包括例如本领域任何已知的用于组织或细胞破碎和/或液化并因此将其中包含的核酸释放到溶液中的洗涤剂和/或包含洗涤剂、离液剂、核酸酶抑制剂等的缓冲剂。类似地，为了核酸释放/纯化的目的，本领域已知用于各种样品处理方法的物理元件包括例如，二氧化硅固体载体如离心柱中的树脂，二氧化硅膜，珠等；进一步的机械破碎机或产生破坏性能量的机器，如超声波仪等。
根据上文，有利地，本发明还提供涉及自动化检测长度等于或短于15bp的同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的筒，该筒包括：
-用于接收生物样品的样品隔室；
-用于从接收在样品隔室中的生物样品释放或纯化核酸的工具，所述工具能够与所述样品隔室流体连通；
-位于样品隔室和用于释放或纯化核酸的工具下游并且被配置为接收至少一部分释放或纯化的核酸或在文库隔室中制备的核酸文库的至少一部分的pcr隔室，所述热循环pcr隔室进一步适合于扩增核酸并且允许检测在这种扩增期间或之后产生的信号
筒的特征在于它进一步包含至少一种、优选多种如上所述的分子信标寡核苷酸探针和校正聚合酶，优选在pcr隔室中包含至少一种、优选多种如上所述的分子信标寡核苷酸探针和校正聚合酶。
在优选的实施方案中，可以在所述筒中以点的形式提供分子信标寡核苷酸探针和/或校正聚合酶，这赋予根据本发明的这样的筒的货架期增加。
最后，本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法、试剂盒和筒用于检测微卫星不稳定性(msi)的用途，优选在获得自诊断为癌症或者预计患有癌症的患者的样品中。
实施例
1.tmem65中msi标志物的分子信标解链曲线
本文所述的方法的优选实施方案检测同聚核苷酸重复序列中长度为1nt的非常小的变化的能力将在本文中使用位于chr8:125325217的人tmem65标志物，并且含有11个腺嘌呤(a)的同聚重复序列进行证明。野生型(wt)同聚重复序列(粗体和下划线)及其tmem65的特定周围序列如下：
为了检测tmem65的重复序列中的核苷酸改变，设计了具有序列
为了测试tmem65特异性探针结合和识别wttmem65标志物序列及其两种不同突变对应物(缺失或插入一个同核苷酸)的能力，制备了代表3种不同的tmem65同聚重复的3种tmem65合成靶标。以下给出三种所述变体的序列作为与tmem65特异性分子信标探针(含多聚a重复序列)互补的dna链，所述分子信标探针与所述变体链杂交。互补tmem65变体链(含多聚t重复序列)如下：
tmem65_t10(1bp缺失):
tmem65_t11(参考):
tmem65_t12(1bp插入):
将tmem65特异性分子信标探针以200nm的浓度添加至3个分开的pcr管，每个pcr管在标准pcr反应缓冲液中含有浓度为2500nm的3种上述变体中的一种。然后将混合物在bio-radcfx96仪器中于95℃变性2分钟，然后冷却至45℃15分钟以使分子信标探针与其靶标杂交足够的时间。接下来，通过以0.3℃(每个循环5s)的步骤将混合物加热至75℃进行解链曲线分析，并且在每增加0.3℃后测量荧光。
解链曲线分析的结果显示在图1中，其中上面的图a显示了tmem65特异性探针对三种靶标的解链曲线(作为随时间的荧光)，并且其中下面的图b显示a中解链曲线的解链峰或负一阶导数。三个解链峰的tm值为：tmem65_t10为54.9℃、tmem65_t11为51.3℃和tmem65_t12为47.7℃。解链峰的deltatm值为：
tmem65_t10-tmem65_t11＝3.6℃
tmem65_t11-tmem65_t12＝3.6℃
tmem65_t10-tmem65_t12＝7.2℃
基于这些结果，可以得出结论，与参考序列(即，t10或t12重复对t11参考重复)相比，单个核苷酸的缺失或插入导致与参考序列的解链峰的tm相比较在tm中的几个℃(摄氏度)的差异。因此，tmem65基因中该重复序列的长度可以通过分析由所述分子信标探针杂交到其靶区域产生的解链峰来确定。
2.评估癌症患者样本中的tmem65msi标志物状态
将结肠直肠癌患者的ffpe样品提供给biocartisidylla流体筒。将筒关闭并装载到biocartisidylla平台上进行基于pcr的自动化遗传分析，然后开始自动化样品处理。首先，从ffpe样品中释放患者的dna，然后将其泵入筒的pcr隔室中。接下来，使用以下引物在每个盒中进行tmem65同聚重复序列周围区域的不对称pcr扩增：正向：5’-cagacttattccattcagatgaga-3’和反向：5’-gaagtgatgtttgaaagattaatgaga-3’。在上述tmem65特异性分子信标探针存在下进行pcr扩增。
pcr之后，pcr产物在95℃下在筒中变性2分钟，然后冷却至45℃15分钟以允许tmem65特异性分子信标探针与其靶标杂交的足够时间。接下来，在仍然在idylla系统上进行解链曲线分析的同时，通过以0.3℃的步骤(每个循环5s)将混合物从40℃加热至60℃并且同时在每增加0.3℃后监测荧光信号。计算解链峰为所得解链曲线的一阶导数的负值。
图2显示了从被认为是微卫星稳定(mss)的10个野生型样品(黑色曲线，tmem65重复长度11)和被认为是微卫星不稳定(msi-高[msi-h])的10个突变样品(灰色曲线，tmem65重复长度10)获得的结果。注意mss样品中野生型a11峰(在±49℃)的一致峰高，而在msi-h样品中野生型a11峰和突变体a10峰(在±53℃)具有可变高度。这反映了每个样品中存在的野生型和突变型等位基因的可变比例。
图3和4分别显示了mss和msi-hffpe样品的代表性实例。在图4中，在图a-c的每个图中描绘三个不同msi-h样品，mss1显示为野生型参考。由于突变体a10峰高(在±53℃)低于野生型a11峰高(在±49℃)，msi-h1样品含有比野生型等位基因更低的突变体。由于突变a10峰高(在±53℃)与野生型a11峰高(在±49℃)相似，msi-h2样品含有相似量的突变和野生型等位基因。由于突变a10峰高(在±53℃)高于野生型a11峰高(在±49℃)，因此msi-h3样品含有比野生型等位基因更高量的突变体。
本文呈现的结果表明，如本文所述使用分子信标探针的方法允许确定来自结直肠癌ffpe组织活检的dna中tmem65同聚重复序列中存在的核苷酸的数量。此外，该方法允许估计肿瘤活组织检查的dna中存在的野生型和突变tmem65重复等位基因的相对量。
3.在校正聚合酶存在下不同分子信标探针的表现
为了实现本文所述方法的更高灵敏度，在pcr扩增混合物中使用具有3'-5'外切核酸酶活性的校正(即纠错)聚合酶是有利的。然而，对于混合物中的许多分子信标，观察到测试的不同校正聚合酶可降解不同的信标，这导致信号部分或完全丧失，因此也干扰或阻止可靠的数据解释。
上面的实施例显示于图5中。上图a显示了用校正聚合酶q5和序列cgcaggaagctaaaaaaaaaacccttctgcg(具有作为标记为的texasred和作为猝灭剂的iowablackfq)的分子信标探针的来自2个临床ffpe样品的dna的解链峰，所述分子信标探针设计用于检测在msi标志物abat的潜在的同核苷酸丢失。连续较黑的峰对应于mss(稳定)样品，其中abat是野生型并包含11个腺嘌呤重复。带圆圈的线显示对来自msi-h样品的dna获得的双曲线，所述msi-h样品在曲线的右侧包含更高的缺失峰并且在左侧包含更小的wt峰。通常在msi-h肿瘤样品中观察到wt峰，因为几乎总是肿瘤组织受到肿瘤周围基质wtdna的污染。
当使用q5校正聚合酶和上述abat特异性分子信标时，可以用其他样品重复获得这样的稳定结果，而不需要进一步用任何额外的化学修饰保护所述信标。据推测，这可能源自所述信标茎的3d结构，其不能与q5聚合酶的外切核酸酶活性中心结合并被其消化。
用q5聚合酶获得了另一个特异于abat并具有序列ccgtccgaagctaaaaaaaaaacccttggacgg(相同标记和猝灭剂)的分子信标的完全不同的解链曲线，显示在图5下面的图b的左侧。该探针可在pcr过程中被q5聚合酶的核酸外切酶活性有效且反复降解。由于信标在pcr过程中降解，因此在pcr后解链曲线分析期间不能获得信号(该图是平坦的)。图b的右侧显示相同探针的qpcr曲线，其证明信标是功能性的并在pcr期间产生信号。由于该信号在pcr后解链中不再存在，这证明pcr期间产生的信号是由信标降解引起的。
观察到在使用q5聚合酶但使用特异性针对不同msi标志物(maker)的其他分子信标探针进行的pcr中，取决于如上所述针对两种abat特异性探针的茎中的哪一个存在于给定的信标中观察到相同的趋势。