本申请要求2015年9月17日提交的美国申请系列号62/220,196的优先权，该申请的内容在此以其整体引入作为参考。
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本发明一般涉及改造为表达嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)在治疗与肿瘤抗原的表达相关的疾病中的用途。
背景技术：
用自体t细胞尤其是用嵌合抗原受体(car)转导的t细胞进行的过继细胞转移(adoptcelltransfer,act)治疗已在血液癌症试验中显示前景。存在对功效改善的t细胞治疗尤其是cart细胞治疗的医学需要。
发明概述
本发明提供破坏甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如tet1、tet2、tet3)的组合物和方法，及这类组合物和方法在提高改造细胞(例如基因修饰的抗原特异性t细胞，如cart细胞)的功能活性中的用途。具体而言，本发明提供用于支持嵌合抗原受体(car)t细胞的治疗功效的方法和组合物。虽然不受限于理论，但tet基因(例如tet1、tet2或tet3)的单个等位基因的破坏导致与增强的增殖、效应细胞因子产生的调节和脱粒相关的5-羟甲基胞嘧啶的总水平降低，从而增加cart细胞增殖和/或功能。
因此，本发明提供改造为表达嵌合抗原受体(car)的细胞(例如细胞群体，如免疫效应细胞群体)，其中car包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号发放结构域，其中减少或消除了该细胞中tet1、tet2和/或tet3的表达和/或功能。在一个实施方案中，减少或消除了该细胞中tet2的表达和/或功能。在一些实施方案中，该抗原结合结构域结合选自以下的肿瘤抗原：tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tnag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素(mesothelin)、il-11ra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、肝配蛋白b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、岩藻糖基gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、邻-乙酰-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、legumain、hpve6,e7、magea1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(survivin)和端粒酶、pcta-1/半乳凝集素(galectin)8、melana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒末端逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5和igll1。在一个实施方案中，该肿瘤抗原是cd19。在一些实施方案中，该抗原结合结构域是例如wo2012/079000或wo2014/153270中所述的抗体或抗体片段
在一方面，本发明提供改造为表达car的细胞(例如细胞群体，如免疫效应细胞群体)，其中减少或消除了该细胞中tet1、tet2和/或tet3的表达和/或功能。在一个实施方案中，减少或消除了该细胞中tet2的表达和/或功能。在一些实施方案中，该car的跨膜结构域包含：(i)具有氨基酸序列seqidno:12的至少1个、2个或3个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与氨基酸序列seqidno:12具有95-99％同一性的序列；或(ii)seqidno:12的序列。
在一方面，本发明提供改造为表达car的细胞(例如细胞群体，如免疫效应细胞群体)，其中减少或消除了该细胞中tet1、tet2和/或tet3的表达和/或功能。在一个实施方案中，该car的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接，其中该铰链区包含seqidno:2或seqidno:6，或与其具有95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，该car的胞内信号发放结构域包含主信号发放结构域和/或共刺激信号发放结构域，其中主信号发放结构域包含选自cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、常见fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10或dap12的蛋白质的功能性信号发放结构域。
在一些实施方案中，该car的主信号发放结构域包含：(i)具有氨基酸序列seqidno:18或seqidno:20的至少1个、2个或3个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与氨基酸序列seqidno:18或seqidno:20具有95-99％同一性的序列；或(ii)seqidno:18或seqidno:20的序列。在一些实施方案中，该car的胞内信号发放结构域包含共刺激信号发放结构域，或主信号发放结构域和共刺激信号发放结构域，其中共刺激信号发放结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号发放结构域：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、特异性结合cd83的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46和nkg2d。
在一些实施方案中，该car的共刺激信号发放结构域包含具有氨基酸序列seqidno:14或seqidno:16的至少1个、2个或3个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与氨基酸序列seqidno:14或seqidno:16具有95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，该car的胞内结构域包含seqidno:14或seqidno:16的序列和seqidno:18或seqidno:20的序列，其中包含胞内信号发放结构域的序列在同一可读框中表达并表达为单条多肽链。在一些实施方案中，本发明的car进一步包含含有seqidno:2的序列的前导序列。
在一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，该t细胞是cd4+t细胞、cd8+t细胞或其组合。在一方面，本发明的细胞是人细胞。在一方面，本发明的细胞(例如改造免疫效应细胞，例如cart细胞)包含tet1、tet2和/或tet3的抑制剂。在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是：(1)靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)编码该基因编辑系统的一个或多个成分的核酸；或(2)其组合。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统选自crispr/cas9系统、锌指核酸酶系统、talen系统和大范围核酸酶系统。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统结合编码tet1、tet2和/或tet3的基因(例如tet2)的早期外显子或内含子中的靶序列。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统结合编码tet2的基因的靶序列，该靶序列在外显子4上游，例如在外显子1、外显子2或外显子3中，例如在外显子3中。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统结合编码tet1、tet2和/或tet3的基因(例如tet2)的晚期外显子或内含子中的靶序列。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统结合编码tet2的基因的靶序列，该靶序列在外显子8下游，例如在外显子9、外显子10或外显子11中，例如在外显子9中。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是靶向编码tet1、tet2和/或tet3的基因或其调节元件(例如tet2或其调节元件)内的一个或多个位点的基因编辑系统，其中基因编辑系统是包含含有与tet基因的靶序列杂交的靶向序列的grna分子的crispr/cas系统。在一些实施方案中，该靶向序列是表3中所列的靶向序列。在一些实施方案中，该靶序列是表5中所列的靶向序列。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是对tet1、tet2、tet3特异的sirna或shrna，或编码该sirna或shrna的核酸。在一些实施方案中，该sirna或shrna包含与tet2mrna的序列互补的序列，例如包含表4中所列的shrna的靶序列。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是小分子。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是蛋白质，例如是tet1、tet2和/或tet3的显性阴性结合配偶体(例如与tet1、tet2和/或tet3相互作用的组蛋白脱乙酰化酶(hdac))，或编码tet1、tet2和tet3的该显性阴性结合配偶体的核酸。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含car及tet1、tet2和/或tet3的抑制剂，其中该抑制剂是蛋白质，例如是显性阴性(例如无催化活性)tet1、tet2或tet3，或编码该显性阴性tet1、tet2或tet3的核酸。
在一方面，本发明提供提高表达car的细胞(例如前述要求中任一项的细胞，例如表达car19的细胞(例如ctl019))的治疗功效的方法，其包括降低该细胞中5-羟甲基胞嘧啶水平的步骤。在一些实施方案中，该步骤包括使该细胞与tet(例如tet1、tet2和/或tet3)抑制剂接触。在一些实施方案中，该tet抑制剂是tet2抑制剂。在一些实施方案中，本发明的tet(例如tet1、tet2和/或tet3)抑制剂选自：(1)靶向编码tet1、tet2或tet3的基因或其相应的调节元件内的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制tet1、tet2或tet3表达的核酸(例如sirna或shrna)；(3)蛋白质(例如显性阴性，例如无催化活性)tet1、tet2或tet3、或tet1、tet2或tet3的结合配偶体；(4)抑制tet1、tet2或tet3表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；和(6)(1)-(5)的任意组合。在一些实施方案中，本发明的tet抑制剂是tet2抑制剂。
在一方面，本发明提供提高表达car的细胞(例如前述要求中任一项的细胞，例如表达car19的细胞(例如ctl019))的治疗功效的方法，其包括降低该细胞中5-羟甲基胞嘧啶水平的步骤。在一些实施方案中，该步骤包括使该细胞与tet(例如tet1、tet2和/或tet3)抑制剂接触。在一些实施方案中，该接触发生在离体条件下。在一些实施方案中，该接触发生在体内。在一些实施方案中，该接触在将编码car的核酸递送入细胞之前发生在体内。在一些实施方案中，该接触在已对有需要的个体施用该细胞之后发生在体内。
在一方面，本发明提供提高表达car的细胞(例如前述要求中任一项的细胞，例如表达car19的细胞(例如ctl019))的治疗功效的方法，其包括使该细胞与tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂)接触的步骤。在一些实施方案中，该tet抑制剂是tet2抑制剂。在一些实施方案中，本发明的tet(例如tet1、tet2和/或tet3)抑制剂选自：(1)靶向编码tet1、tet2或tet3的基因或其相应的调节元件内的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制tet1、tet2或tet3表达的核酸(例如sirna或shrna)；(3)蛋白质(例如显性阴性，例如无催化活性)tet1、tet2或tet3、或tet1、tet2或tet3的结合配偶体；(4)抑制tet1、tet2或tet3表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；和(6)(1)-(5)的任意组合。在一些实施方案中，本发明的tet抑制剂是tet2抑制剂。
在一方面，本发明提供提高表达car的细胞(例如前述要求中任一项的细胞，例如表达car19的细胞(例如ctl019))的治疗功效的方法，其包括使该细胞与tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂)接触的步骤。在一些实施方案中，该步骤包括使该细胞与tet(例如tet1、tet2和/或tet3)抑制剂接触。在一些实施方案中，该接触发生在离体条件下。在一些实施方案中，该接触发生在体内。在一些实施方案中，该接触在将编码car的核酸递送入细胞之前发生在体内。在一些实施方案中，该接触在已对有需要的个体施用该细胞之后发生在体内。
在一方面，本发明提供治疗有需要的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述细胞，例如包含car的免疫效应细胞(例如t细胞或nk细胞)，并可选地对该个体施用tet1、tet2和/或tet3抑制剂。在一些实施方案中，该个体在启动表达car的细胞治疗之前接受tet1、tet2和/或tet3抑制剂预治疗。在一些实施方案中，该个体接受tet1、tet2和/或tet3抑制剂和表达car的细胞治疗的同时治疗。在一些实施方案中，该个体在表达car的细胞治疗之后接受tet1、tet2和/或tet3抑制剂治疗。在一些实施方案中，该个体患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病，例如增生性疾病、癌前期病症、癌症和与肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，该个体患有选自以下一种或多种的血液癌症：慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、b细胞型急性淋巴细胞白血病(b-all)、t细胞型急性淋巴细胞白血病(t-all)、慢性髓性白血病(cml)、b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样(blasticplasmacytoid)树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡型淋巴瘤、恶性淋巴增生性病症、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、waldenstrom巨球蛋白血症或白血病前期。
本发明提供本文所述组合物和/或方法在治疗癌症中的用途，其中癌症选自：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食管癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(cns)、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发癌症、该癌症的组合和该癌症的转移灶。
本发明提供tet1、tet2和/或tet3抑制剂用于治疗个体，其中该个体已接收、正接受或计划接受包含表达car的细胞的治疗。
本发明进一步提供制备表达car的细胞的方法，其包括将编码car的核酸引入细胞，使得该核酸(或其编码car的部分)在tet1、tet2和/或tet3基因内(例如在tet1、tet2和/或tet3基因的内含子或外显子内)整合入该细胞的基因组，使得减少或消除了tet1、tet2和/或tet3表达和/或功能。
本发明进一步提供制备表达car的细胞的方法，其包括使该表达car的细胞在离体条件下与tet1、tet2和/或tet3抑制剂接触。在一些实施方案中，该抑制剂是tet2抑制剂。
本发明进一步提供包含编码car的序列和编码tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂)的序列的载体。在一些实施方案中，该tet抑制剂是：(1)靶向编码tet1、tet2或tet3的基因或其相应的调节元件内的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制tet1、tet2或tet3表达的核酸(例如sirna或shrna)；(3)蛋白质(例如显性阴性，例如无催化活性)tet1、tet2或tet3、或tet1、tet2或tet3的结合配偶体；和(4)编码(1)-(3)中任一项的核酸，或其组合。在一些实施方案中，编码car的序列和编码tet抑制剂的序列由2a位点分隔开。
本发明进一步提供对tet基因或其调节元件(例如tet1、tet2或tet3基因或其调节元件)的序列特异的基因编辑系统。在一些实施方案中，该基因编辑系统对tet2基因的序列特异。在一些实施方案中，该基因编辑系统是(1)crispr/cas基因编辑系统、(2)锌指核酸酶系统、talen系统和大范围核酸酶系统。在一些实施方案中，该基因编辑系统是crispr/cas基因编辑系统。在一些实施方案中，该基因编辑系统包含：含有对tet基因或其调节元件的序列特异的靶向序列的grna分子和cas9蛋白质；含有对tet基因或其调节元件的序列特异的靶向序列的grna分子和编码cas9蛋白质的核酸；编码含有对tet基因或其调节元件的序列特异的靶向序列的grna分子的核酸和cas9蛋白质；或编码含有对tet基因或其调节元件的序列特异的靶向序列的grna分子的核酸和编码cas9蛋白质的核酸。在一些实施方案中，该基因编辑系统进一步包含模板dna。在一些实施方案中，该模板dna包含编码car(例如本文所述car)的核酸序列。
本发明进一步提供用于离体制备表达car的细胞的组合物，其包含tet抑制剂，例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂。在一些实施方案中，该tet抑制剂选自n-[3-[7-(2,5-二甲基-2h-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1,4-二氢-2h-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺、2-[(2,6-二氯-3-甲基苯基)氨基]苯甲酸和2-羟基戊二酸酯。
本发明进一步提供包含本文所述一个或多个细胞的细胞群体，其中该细胞群体包含百分比高于不包含其中减少或消除了该细胞中tet1、tet2和/或tet3的表达和/或功能的一个或多个细胞的细胞群体的tscm细胞(例如cd45ra+cd62l+ccr7+cd27+cd95+t细胞)。
附图简述
图1：对患者(upcc04409-10)施用表达cd19的cart细胞用于治疗cll。通过采集血液随时间推移监测患者upcc04409-10中的cart细胞。测定细胞中bbz表达量(红色)。测定来自vbeta5.1tcr家族的序列的拷贝数(蓝色)。两个测量都从在第二次输注cart细胞后的所示天数采集的样品进行。
图2a和2b：从cart输注后第28天(图2a)或第51天(图2b)采集的样品测定了来自患者upcc04409-10的t细胞受体库。这证明tcrbv05-01家族t细胞受体第51天的丰度表明随时间推移发生克隆扩增。
图3：随时间推移(第50天和第51天)针对car19和2个不同tcr家族基因的同时表达分析了从患者upcc04409-10分离的t细胞，并与输入施用物质(产品)相比较：上图为tcr家族vb13.1；下图显示tcr家族vb5.1。数据证明，car19阳性细胞包含在第50和51天之间快速富集的单个tcr家族基因(vb5.1)。
图4：从cart输注后第51天收集的样品测定了来自患者upcc04409-10的cd8阳性细胞的t细胞受体库。这证明tcrbv05-01家族t细胞受体第51天的丰度表明cd8阳性细胞随时间推移发生克隆扩增。
图5：对来自患者upcc04409-10的t细胞受体进行测序，显示α和β链的序列(氨基酸序列公开为seqidno:1297-1298，核苷酸序列公开为seqidno:1299-1301，全都分别按出现的顺序)。
图6：从来自患者upcc04409-10的t细胞产生了超声片段化dna。用此材料来扩增邻近car19插入的基因组序列。将所示基因鉴定为相对于所输注的产品(d0)在基因组中邻近car19处富集。在所示cart输注后不同时间点(d＝天；m＝月)，观察了邻近基因的不同相对丰度，tet2丰度在外周血(pbmc)和car+cd8+t细胞样品中都在第51天达到峰值。
图7：将car19基因插入位点定位至tet2基因。更具体而言，插入发生在tet2基因的外显子9和10之间。tet2的催化结构域位于外显子11中。此位置处的插入可导致异常mrna转录物的表达或减少功能性(野生型)tet2的表达。
图8：使用图右侧所示的跨越tet2或car19或二者的所示区域的引物，通过rtpcr评价了来自从患者upcc04409-10分离的mrna的ter基因转录物。rxn3包含设计用于扩增跨域外显子9和10的tet2转录物区域的引物。rxn6、7、8、9和10是设计用于扩增car19慢病毒的所示区域的引物。rxn12-16是包含tet2转录物的外显子9序列以及来自car19慢病毒构建体的序列的引物对。这些数据显示转录物是从包含tet2序列以及car19序列二者的tet2基因座产生。
图9：显示源自图10a和10b中发现的tet2基因座的转录物的示意图。此图显示在患者样品中检测到的此tet2/car19融合的剪接变体。此分析揭示，car19插入tet2产生了在外显子11上游包含终止密码子的转录物。已证明外显子11对tet2功能重要。这表明car19的插入破坏了tet2功能。这还表明tet2功能的破坏导致此单个cart克隆的有利扩增。
图10a和10b：示意tet2催化活性(图10a)。tet家族蛋白质将5-甲基胞嘧啶(5-mc)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)，然后转化为5-甲酰基胞嘧啶(5-fmc)，产生脱甲基胞嘧啶。甲基化dna是已知影响转录谱的表观遗传学状态。评价了来自患者upcc04409-10的t细胞的甲基化状态(图10b)。针对tcrvb5.1(其在tet2处包含car19插入)染色患者的t细胞，通过流式细胞术在tcrvb5.1阳性(红色)和tcrvb5.1阴性(蓝色)群体中评价5-hmc和5-fmc。此数据显示在tet2基因中包含car19插入的细胞缺乏脱甲基化。
图11：tet2shrna降低正常人t细胞中的5-hmc水平。将tet2和表达mcherry的错乱对照(scramblecantrol)shrna构建体引入正常人t细胞。在用抗cd3/cd28小球扩增后第6天通过facs通过胞内染色测定5-hmc水平。tet2的敲减降低了总体5-hmc水平。
图12：tet2shrna扩增tscmt细胞。将tet2和表达mcherry的错乱对照shrna构建体引入正常人t细胞。在用抗cd3/cd28小球扩增后第11天通过facs染色测定cd45ra+cd62l+ccr7+cd27+cd95+tscmt细胞。tet2的敲减促进了具有tscm表型的t细胞的扩增。
图13a：用于定量car+细胞的门控策略。
图13b：用靶向tet2的crispr/cas系统电穿孔的细胞中的car表达水平，与未转染细胞相比较。
图14：car转导和tet2编辑后cd4+和cd8+细胞的定量。
图15：tet2抑制对cart细胞的cd3/cd28小球扩增的影响。
图16：tet2抑制对cart细胞抗原依赖性白介素-2(il-2)产生的影响。
图17：tet2抑制对cart细胞抗原依赖性干扰素γ产生的影响。
图18：tet2抑制对抗原驱动的car+t细胞增殖的影响。
图19：tet2抑制对抗原驱动的t细胞增殖的影响。
图20：tet2抑制对抗原驱动的cd4+t细胞增殖的影响。
图21：tet2抑制对抗原驱动的car+cd4+t细胞增殖的影响。
图22：tet2抑制对抗原驱动的cd8+t细胞增殖的影响。
图23：tet2抑制对抗原驱动的car+cd8+t细胞增殖的影响。
图24：通过ngs测量的通过引入靶向tet2的crispr/cas系统产生的％编辑和％移码编辑。
图25：加入包含所示tet2外显子3靶向grna(按出现顺序分别为seqidno:1302-1326)的rnp后在t细胞中观察到的出现频率最高的前5种插入缺失(indel)。显示偏离未修饰的wt序列的变化，插入以小写字母(“a”、“t”、“g”和“c”)表示，缺失以破折号(“-”)显示。插入缺失频率显示在最右列中。
图26：加入包含所示tet2外显子9靶向grna(按出现顺序分别为seqidno:1327-1356)后在t细胞中观察到的出现频率最高的前5种插入缺失。显示偏离未修饰的wt序列的变化，插入以小写字母(“a”、“t”、“g”和“c”)表示，缺失以破折号(“-”)显示。插入缺失频率显示在最右列中。
图27：用于测定jurkat细胞中响应编码shrnatet2抑制剂的慢病毒的tet2敲减的实验方案示意图。
图28：shrna感染的jurkat细胞中的rfp表达。在嘌呤霉素处理后第6天通过facs测定rfp表达。基于rfp表达，通过嘌呤霉素处理选择了超过99％引入shrna的jurkat细胞。
图29：tet2shrna感染的jurkat细胞中tet2的敲减效率。进行了qrt-pcr实验。还测量了tet1和tet3的表达水平。β-肌动蛋白作为内部对照来定量所测试样品间的相对基因表达。为了提高qrt-pcr可靠性，在此实验中使用了两个β-肌动蛋白引物和一个rplp1引物。
图30：jurkat细胞中响应shrna的tet2蛋白质敲减。进行了western印迹实验。
图31a：来自患者的具有tet2破坏的car+cd8+t细胞中的atac峰的venn图，与在匹配时间点来自同一患者的不含tet2破坏的car-cd8+t细胞相比较。箱形图显示两个细胞群体之间atac富集的差异。
图31b：与其对应物相比，atac峰相关的go项在具有tet2破坏的细胞群体中更封闭。
图32a：通过定量pcr测量的shrna对来自健康供体的原代cd8+t细胞中tet2的沉默。将对gapdh归一化的表达(平均值，sem)呈现为相对于非靶向对照shrna的倍数变化。
图32b和32c：与a中所述相同的健康供体中经cd3/cd28刺激扩增后第14天中央记忆(图32b)和效应cd8+t细胞(图32c)的相对频率。
发明详述
定义
除非另有说明，本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。
术语“一”和“一个”指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法宾语。作为实例，“一个元件”指一个元件或一个以上元件。
在提到可测量值如量、时间等时，术语“约”意在涵盖偏离所指定的值±20％、或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变异，因为这类变异对进行多公开的方法是适当的。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“car”指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两条多肽，在处于免疫效应细胞中时，其为该细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性和胞内信号产生。在一些实施方案中，car至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及含有源自下文定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号发放结构域的胞质信号发放结构域(本文中也称为“胞内信号发放结构域”)。在一些方面，该组多肽相互连接。在一些实施方案中，该组多肽包含二聚化开关，在存在二聚化分子时，该二聚化开关可以使多肽相互偶联，例如可以使抗原结合结构域与胞内信号发放结构域偶联。在一方面，该刺激分子是与t细胞受体复合物结合的ζ链。在一方面，该胞质信号发放结构域进一步包含源自下文定义的至少一个共刺激分子的一个或多个功能性信号发放结构域。在一方面，该共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1bb(即cd137)、cd27和/或cd28。在一方面，该car包含嵌合融合蛋白质，该嵌合融合蛋白质包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及含有源自刺激分子的功能性信号发放结构域的胞内信号发放结构域。在一方面，该car包含嵌合融合蛋白质，该嵌合融合蛋白质包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及含有源自共刺激分子的功能性信号发放结构域和源自刺激分子的功能性信号发放结构域的胞内信号发放结构域。在一方面，该car包含嵌合融合蛋白质，该嵌合融合蛋白质包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及含有源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号发放结构域和源自刺激分子的功能性信号发放结构域的胞内信号发放结构域。在一方面，该car包含嵌合融合蛋白质，该嵌合融合蛋白质包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及含有源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号发放结构域和源自刺激分子的功能性信号发放结构域的胞内信号发放结构域。在一方面，该car在car融合蛋白质氨基端(n端)包含可选的前导序列。在一方面，该car进一步在胞外抗原结合结构域n端包含前导序列，其中该前导序列在细胞加工和car定位至细胞膜期间可选地从抗原结合结构域(例如scfv)切割。
包含靶向特异性肿瘤标志x(如本文所述的那些)的抗原结合结构域(例如scfv或tcr)的car也称为xcar。例如，包含靶向cd19的抗原结合结构域的car称为cd19car。
术语“信号发放结构域”指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息发挥作用，以通过产生第二信使或通过响应这类信使作为效应物发挥作用来经确定的信号传导途径调节细胞活动。
本文所用的术语“抗体”指源自特异性结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免球蛋白，且可以源自天然来源或源自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指抗体的至少一个部分，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2，fv片段，scfv抗体片段，二硫键连接的fv(sdfv)，由vh和ch1结构域组成的fd片段，线性抗体，单结构域抗体如sdab(vl或vh)，骆驼vhh结构域，形成自抗体片段的多特异性抗体如包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段，及分离的cdr或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-nar和bis-scfv中(参见例如hollinger和hudson,naturebiotechnology23:1126-1136,2005)。还可将抗原结合片段移植入基于诸如iii型纤连蛋白(fn3)的多肽的支架(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scfv”指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白质，其中轻链和重链可变区例如通过合成接头(例如短的柔性多肽接头)连续连接，且能够表达为单链多肽，其中scfv保留它所衍生自的完整抗体的特异性。除非另有说明，本文所用的scfv可以具有任一顺序的vl和vh可变区，例如就多肽的n端和c端而言，scfv可包含vl-接头-vh或可包含vh-接头-vl。
本发明的car的包含抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，该连续多肽链包含例如单结构域抗体片段(sdab)、单链抗体(scfv)、人源化抗体或双特异性抗体(harlow等,1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等,1989,in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等,1988,science242:423-426)。在一方面，本发明的car组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，该car包含含有scfv的抗体片段。可以用许多众所周知的方案(包括kabat等(1991),“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(“kabat”编号方案)；al-lazikani等,(1997)jmb273,927-948(“chothia”编号方案)中所述的那些)中的任一种或其组合来确定给定cdr的确切氨基酸序列边界。
本文所用的术语“结合结构域”或“抗体分子”指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
本发明的car的包含抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，该连续多肽链包含例如单结构域抗体片段(sdab)、单链抗体(scfv)、人源化抗体或双特异性抗体(harlow等,1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等,1989,in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等,1988,science242:423-426)。在一方面，本发明的car组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，该car包含含有scfv的抗体片段。
术语“抗体重链”指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两类多肽链中的较大者，其通常决定该抗体所属种类。
术语“抗体轻链”指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两类多肽链中的较小者。κ和λ轻链指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”指用重组dna技术产生的抗体，例如通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为指通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，该dna分子表达抗体蛋白质或指定该抗体的氨基酸序列，其中用本领域可用和公知的重组dna或氨基酸序列技术获得该dna或氨基酸序列。
术语“抗原”或“ag”指引起免疫反应的分子。此免疫反应可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞活化，或二者。技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)都可作为抗原。此外，抗原可以源自重组dna或基因组dna。技术人员将理解，本文中使用包含编码引出免疫反应的蛋白质从而编码如该术语的“抗原”的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任意dna。此外，本领域技术人员将理解，抗原无需仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，这些核苷酸序列以多种组合排列以编码引出所希望的免疫反应的多肽。此外，技术人员将理解，抗原无需完全由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物成分的流体。
术语“抗癌效应”指可表现为多种方式的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数目减少、转移数减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少或癌性病症相关的多种生理症状改善。“抗癌效应”也可以表现为肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防癌症在第一个地方发生中的能力。术语“抗肿瘤效应”指可表现为多种方式的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活减少。
术语“自体的(自身的)”指源自与随后将它重新引入的个体相同的个体的任何材料。
术语“同种异基因的”指源自与该材料所引入的个体相同的物种的不同动物的任何材料。在一个或多个基因座上的基因不同时称两个或多个个体相互是同种异基因的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异基因材料可在遗传上不像至足以发生抗原相互作用。
术语“异种的”指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”指表征为异常细胞失控生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统至身体其他部分。本文中描述了多种癌症的实例，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、直肠癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如两个术语都涵盖实体和流体(例如弥漫或循环)肿瘤。本文所用的术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶化的癌症和肿瘤。
本文所用的术语“源自”指第一和第二分子间的关系。它通常指第一分子和第二分子间的结构相似性，不暗含或包含对源自第二分子的第一分子的过程或来源限制。例如，在源自cd3ζ分子的胞内信号发放结构域的情况下，该胞内信号发放结构域保留足够的cd3ζ结构，使得其具有所需要的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它不暗含或包含对产生胞内信号发放结构域的具体过程的限制，例如，它不意味着为了提供胞内信号发放结构域，必须以cd3ζ序列开始，删除不想要的序列，或施加突变，以达到胞内信号发放结构域。
短语“与本文所述肿瘤抗原的表达相关的疾病”包括但不限于与本文所述肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达本文所述肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括例如，增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤或癌前期病症，如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达本文所述肿瘤抗原的细胞相关的非癌相关适应症。在一方面，与本文所述肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症(hematologicalcancer)。在一方面，与本文所述肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌症。与本文所述肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括但不限于例如与本文所述肿瘤抗原的表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病症或增生性疾病。与本文所述肿瘤抗原的表达相关的非癌相关适应症包括但不限于例如自身免疫病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mrna。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白质(例如野生型或突变体)，该肿瘤抗原蛋白质可以按正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，该表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测到水平的肿瘤抗原蛋白质，随后产生基本检测不到的肿瘤抗原蛋白质。
术语“保守序列修饰”指氨基酸修饰，其不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可通过本领域已知的标准技术引入本发明的抗体或抗体片段，如位点定向诱变和pcr介导诱变。保守氨基酸取代是这样的取代，其中用具有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其他氨基酸残基替换本发明的car内的一个或多个氨基酸残基，并可以用本文所述的功能测定测试该改变的car。
术语“刺激”指由刺激分子(例如tcr/cd3复合物或car)与其关联配体(或在car的情况下为肿瘤抗原)结合从而介导信号转导事件(如但不限于经tcr/cd3复合物的信号转导或经适当nk受体或car信号发放结构域的信号转导)而诱发的初级反应。刺激可以介导某些分子的表达改变。
术语“刺激分子”指由免疫细胞(例如t细胞、nk细胞、b细胞)表达的提供胞质信号发放序列的分子，该胞质信号发放序列针对免疫细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激方式调节免疫细胞的活化。在一方面，该信号是由例如tcr/cd3复合物与加载了肽的mhc分子的结合起始的初级信号，且导致包括但不限于增殖、活化、分化等的t细胞反应的介导。以刺激方式发挥作用的初级胞质信号发放序列(也称为“初级信号发放结构域”)可以包含已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号发放基序。在本发明中尤其有用的包含itam的胞质信号发放序列的实例包括但不限于源自cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12的那些。在本发明的具体car中，本发明的任意一个或多个car中的胞内信号发放结构域包含胞内信号发放序列，例如cd3ζ的初级信号发放序列。在本发明的具体car中，cd3ζ的初级信号发放序列是seqidno:18所提供的序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的具体car中，cd3ζ的初级信号发放序列是seqidno:20所提供的序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“apc”指在其表面展示与主要组织相容性复合物(mhc)复合物复合的外来抗原的免疫系统细胞如辅助细胞(如b细胞、树突细胞等)。t细胞可以用它们的t细胞受体(tcr)识别这些复合物。apc加工抗原并将它们呈递给t细胞。
本文所用的术语“胞内信号发放结构域”指分子的胞内部分。胞内信号发放结构域产生促进包含car的细胞(例如cart细胞)的免疫效应子功能的信号。例如cart细胞中的免疫效应子功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域可以包含初级胞内信号发放结构域。示例性初级胞内信号发放结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号发放结构域包括源自负责共刺激信号或不依赖抗原的刺激的分子的那些。例如，在cart的情况下，初级胞内信号发放结构域可以包含t细胞受体的胞质序列，共刺激胞内信号发放结构域可以包含来自共同受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号发放结构域可以包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号发放基序。包含itam的初级胞质信号发放序列的实例包括但不限于源自cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12的那些。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“cd3ζ”或“tcrζ”定义为genban检索号bag36664.1所提供的蛋白质，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基，“ζ刺激结构域”或备选地“cd3ζ刺激结构域”或“tcrζ刺激结构域”定义为来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递t细胞活化所必需的起始信号。在一方面，ζ的胞质结构域包含genbank检索号bag36664.1的残基52至164或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基，该等同残基是其功能直向同源物。在一方面，“ζ刺激结构域”或“cd3ζ刺激结构域”是seqidno:18所提供的序列。在一方面，“ζ刺激结构域”或“cd3ζ刺激结构域”是seqidno:20所提供的序列。
术语“共刺激分子”指t细胞上的关联结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而通过t细胞介导共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子是除促成有效免疫反应的抗原受体或其配体外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于mhci类分子，btla和toll配体受体，以及ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。这类共刺激分子的其他实例包括cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和与cd83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号发放结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以出现在以下蛋白质家族中：tnf受体蛋白质、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号发放淋巴细胞活化分子(slam蛋白质)和活化nk细胞受体。这类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd30、cd40、icos、baffr、hvem、icam-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、nkg2d、slamf7、nkp80、nkp30、nkp44、nkp46、cd160、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
胞内信号发放结构域可以包含它所衍生自的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号发放结构域，或其功能性片段或衍生物。
术语“4-1bb”指具有genbank检索号aaa62478.2所提供的氨基酸序列或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基的tnfr超家族成员；“4-1bb共刺激结构域”定义为genbank检索号aaa62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。在一方面，“4-1bb共刺激结构域”是seqidno:14所提供的序列或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。
本文所用的术语“免疫效应细胞”指涉及免疫反应例如涉及促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的实例包括t细胞(例如α/βt细胞和γ/δt细胞)、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞。
本文所用的术语“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进对靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或反应指t或nk细胞的促进靶细胞生长或增殖的杀伤或抑制的特性。在t细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的实例。
术语“编辑”指以多核苷酸(如基因、cdna或mrna)中的特异性核苷酸序列为模板，在生物学过程中合成具有确定核苷酸序列(例如rrna、trna和mrna)或确定氨基酸序列和源自其的生物学特性的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cdna或rna编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同，且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna的转录模板)都可以称为编码该基因或cdna的蛋白质或其他产物。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括相互为简并形式且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。在编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子的程度上，短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可以包含内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，指对达到特定生物学结果有效的本文所述化合物、制剂、材料或组合物的量。
术语“内源的”指来自器官、细胞、组织或系统内部或在器官、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源的”指来自器官、细胞、组织或系统外部或在器官、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
术语“表达”指启动子驱动的具体核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”指包含分离的核酸且可以用来将该分离的核酸递送入细胞内部的物质的组成。许多载体为本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为进一步包括便于将核酸转入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸含有与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括所有本领域已知的那些，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中的独特性在于能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送入宿主细胞的dna，所以它们是基因递送载体的最有效方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”指源自至少一部分慢病毒基因组的载体，尤其包括milone等,mol.ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自oxfordbiomedica的
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子间，例如两个核酸分子(如两个dna分子或两个rna分子)间，或两个多肽分子间的亚单位序列同一性。在两个分子中的亚单位位置都由相同的单体亚单位占据时，例如如果两个dna分子中的位置都由腺嘌呤占据时，则它们在该位置处是同源的或同一的。两个序列间的同源性是配对或同源的位置数的直接函数；例如，如果两个序列中一半(例如长度为10个亚单位的聚合物中的5个位置)的位置是同源的，则两个序列50％同源；如果90％的位置(例如10个中的9个)匹配或同源，则两个序列90％同源。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中用具有希望得到的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基替换来自受体互补决定区(cdr)的残基。在一些情况下，用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基。此外，人源化抗体/抗体片段可包含不见于受体抗体中也不见于输入cdr或构架序列中的残基。这些修饰可进一步改良和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个(通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr，全部或显著部分的fr区是人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步详情参见jones等,nature,321:522-525,1986；reichmann等,nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
“全人”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子具有人来源或包含与该抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列。
术语“分离的”指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质部分或完全分开的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本纯的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本发明的背景中，使用以下常见核酸碱基缩写。“a”指腺嘌呤，“c”指胞嘧啶，“g”指鸟嘌呤，“t”指胸腺嘧啶，“u”指尿嘧啶。
术语“有效连接的”或“转录控制”指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致后者的表达。例如，在将第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能关系中时，该第一核酸序列与该第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列有效连接。有效连接的dna序列可以相互相邻，例如在有必要连接两个蛋白质编码区时处于同一可读框中。
术语免疫原组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内、或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非另有明确限制，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参考核酸相似的结合特性，且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，具体的核酸序列还暗含其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确显示的序列。具体而言，可通过产生其中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选定(或全部)密码子的第三位的序列来达到简并密码子取代(batzer等,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；及rossolini等,mol.cell.probes8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，蛋白质或肽的序列可包含的最大氨基酸数目不设限制。多肽包括含有两个或多个通过肽键相互连接的氨基酸的任意肽或蛋白质。如本文所使用，该术语指短链(其在本领域中还常称为例如肽、寡肽和寡聚物)和更长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其中存在许多类型)二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白质等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
术语“启动子”指细胞的合成机器或所引入的合成机器识别、起始多核苷酸序列的特异性转录所需的dna序列。
术语“启动子/调节序列”指表达与该启动子/调节序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，在其他情况下，此序列还可以包含表达基因产物所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
术语“组成型”启动子指在与编码或指定基因产物的多核苷酸序列有效连接时导致在细胞的大多数或全部生理条件下在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子指在与编码或指定基因产物的多核苷酸序列有效连接时导致基本仅在细胞中存在对应该启动子的诱导物时在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子指在与编码或由基因指定的多核苷酸序列有效连接时导致基本仅在细胞是对应该启动子的组织类型的细胞时在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指完整地或作为片段(例如mhc/肽)表达在癌细胞表面且可用于使药理学活性剂优先靶向癌细胞的分子(通常是蛋白质、糖类或脂质)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞都表达的标志，例如谱系标志(lineagemarker)，例如b细胞上的cd19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过量表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍过量表达或更多。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比包含缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将完整地或作为片段(例如mhc/肽)在癌细胞表面专一性表达，在正常细胞表面不合成或表达。在一些实施方案中，本发明的car包括含有结合mhc呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)。通常，源自内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(mhc)i类分子的口袋，并由cd8+t淋巴细胞上的t细胞受体(tcr)识别。mhci类复合物由所有有核细胞组成性表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/mhc复合物代表用于免疫治疗的一类独特的细胞表面靶标。已描述了在人白细胞抗原(hla)-a1或hla-a2背景中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的tcr样抗体(参见例如sastry等,jvirol.201185(5):1935-1942；sergeeva等,blood,2011117(16):4262-4272；verma等,jimmunol2010184(4):2156-2165；willemsen等,genether20018(21):1601-1608；dao等,scitranslmed20135(176):176ra33；tassev等,cancergenether201219(2):84-100)。例如，可从筛选文库如人scfv噬菌体展示文库鉴定tcr样抗体。
术语“肿瘤支持抗原”或“癌症支持抗原”可互换地指表达在细胞表面的分子(通常是蛋白质、糖类或脂质)，其本身不是癌性的，但通过促进其生长或存活(例如抵抗免疫细胞)来支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基底细胞和骨髓来源抑制细胞(mdsc)。肿瘤支持抗原本身无需在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上。
本文在scfv背景中所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指包含单独或组合使用的诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一个实施方案中，该柔性多肽接头是gly/ser接头，且包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(seqidno:28)。在一个实施方案中，该柔性多肽接头包括但不限于(gly4ser)4(seqidno:29)或(gly4ser)3(seqidno:30)。在另一实施方案中，该接头包括多个重复的(gly2ser)、(glyser)或(gly3ser)(seqidno:31)。wo2012/138475中所述的接头也包含在本发明的范围之内，其在此引入作为参考。
本文所用的5'帽(也称为rna帽、rna7-甲基鸟嘌呤帽或rnam7g帽)是在转录开始后很快添加至真核信使rna“前端”或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽包含与所转录的第一个核苷酸连接的末端基团。它的存在对核糖体识别和保护免受rna酶降解至关重要。加帽与转录偶联并与转录共发生，使得相互影响。转录开始后不久，与rna聚合酶结合的帽合成复合物结合正在合成的mrna的5'端。此酶复合物催化mrna帽花所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰帽化部分来调节mrna的功能性，如它的稳定性或翻译效率。
本文所用的“体外转录的rna”指在体外合成的rna，优选mrna。通常，体外转录的rna是从体外转录载体产生的。体外转录载体包含用来产生体外转录的rna的模板。
本文所用的“poly(a)”是通过聚腺苷酸化附着至mrna的一系列腺嘌呤。在用于瞬时转染的构建体的优选实施方案中，polya在50至5000(seqidno:34)之间，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。poly(a)序列可以化学修饰或酶促修饰，以调节mrna功能性，如定位、稳定性或翻译效率。
本文所用的“聚腺苷酸化”指聚腺苷酰部分或其修饰变体与信使rna分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使rna(mrna)分子都在3’端聚腺苷酸化。3'poly(a)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mrna的腺嘌呤核苷酸(通常为数百个)的长序列。在高级真核生物中，poly(a)尾添加至包含特异性序列聚腺苷酸化信号的转录物上。poly(a)尾和与它结合的蛋白质帮助保护mrna免受外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对转录终止、mrna从细胞核输出和翻译也很重要。聚腺苷酸化在dna转录为rna后很快发生在细胞核中，但也可以随后发生在细胞质中。转录终止后，通过与rna聚合酶结合的内切核酸酶复合物切割mrna链。切割位点的特征通常在于在切割位点附近存在碱基序列aauaaa。切割mrna后，在切割位点3’端添加腺嘌呤残基。
本文所用的“瞬时”指非整合转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中表达时间小于基因在宿主细胞中整合入基因组或包含在稳定质粒复制子内时的表达时间。
本文所用的术语“治疗”指由于施用一种或多种治疗(例如一种或多种治疗剂，如本发明的car)而减少或改善增生性障碍的进展、严重度和/或持续时间，或改善增生性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在具体实施方案中，术语“治疗”指改善增生性障碍的至少一个可测量的物理参数，如肿瘤的生长，其并非必然是患者可辨别出的。在其他实施方案中，术语“治疗”指在物理上(通过例如稳定可辨别的症状)、生理上(通过例如稳定物理参数)或在二者上抑制增生性障碍的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”指在将信号从细胞的一个部分传递至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨细胞膜传递信号的分子和分子复合物。
术语“个体”旨在包括其中可引出免疫反应的活体生物(例如哺乳动物、人)。
术语“基本纯的”细胞指基本不含其他细胞类型的细胞。基本纯的细胞也可以指已从在其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分开的细胞。在一些情况下，基本纯的细胞群体指同质细胞群体。在其他情况下，此术语简单地指已从在其天然状态下天然与之结合的其他细胞分开的细胞。在一些方面，该细胞是体外培养的。在其他方面，该细胞不是体外培养的。
本文所用的术语“治疗”指处理。通过减少、抑制、缓解或消除疾病状态来获得治疗效果。
本文所用的术语“预防”指疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
在本发明的背景中，“肿瘤抗原”或“过度增生性障碍抗原”或“过度增生性障碍相关抗原”指具体的过度增生性障碍常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性障碍抗原源自包括但不限于以下的癌症：原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染”或“转化”或“转导”指通过其来将外源核酸转移入或引入宿主细胞的方法。“转染”或“转化”或“转导”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代个体细胞及其后代。
术语“特异性结合”指识别并结合样品中存在的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但该抗体或配体不实质性识别或结合样品中的其他分子。
本文所用的术语“可调节嵌合抗原受体(rcar)”指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种多肽，在处于rcarx细胞中时，其为rcarx细胞提供对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性和可调节的胞内信号产生或增殖，其可以优化rcarx细胞的免疫效应子特性。rcarx细胞至少部分依赖于抗原结合结构域来提供对包含该抗原结合结构域所结合的抗原的靶细胞的特异性。在一个实施方案中，rcar包含二聚化开关，在存在二聚化分子时，该二聚化开关可以使胞内信号发放结构域与抗原结合结构域偶联。
本文所用的术语“膜锚”或“膜绑定结构域”指足以将胞外或胞内结构域锚定至质膜的多肽或部分，例如豆蔻酰基团。
本文在例如提到rcar时所用的术语“开关结构域”指在二聚化分子存在下与另一开关结构域结合的实体，通常是基于多肽的实体。该结合导致与第一开关结构域连接(例如融合)的第一实体和与第二开关结构域连接(例如融合)的第二实体的功能偶联。第一和第二开关结构域统称为二聚化开关。在一些实施方案中，该第一和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并统称为同二聚化开关。在一些实施方案中，该第一和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽，并统称为异二聚化开关。在一些实施方案中，该开关是胞内的。在一些实施方案中，该开关是胞外的。在一些实施方案中，该开关结构域是基于多肽的实体，例如基于fkbp或frb，该二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素类似物(rapalogue)。在一些实施方案中，该开关结构域是基于多肽的实体，例如结合myc肽的scfv，该二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个mycscfv的myc配体或myc配体的多聚体。在一些实施方案中，该开关结构域是基于多肽的实体，例如myc受体，该二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
本文在例如提到rcar时所用的术语“二聚化分子”指促进第一开关结构域与第二开关结构域结合的分子。在一些实施方案中，该二聚化分子并非天然存在于个体中，或不以导致显著二聚化的浓度存在。在一些实施方案中，该二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素(rapamycin)或雷帕霉素类似物，例如rad001。
术语“生物等同的”指产生等同于由参考剂量或参考量的参考化合物(例如rad001)产生的效果的效果所需的参考化合物(例如rad001)之外的活性剂的量。在一个实施方案中，该效果是例如通过p70s6激酶抑制测量、例如在体内或体外测定中评价、例如通过本文所述测定(例如boulay测定)测量的mtor抑制水平。在一个实施方案中，该效果是通过细胞分选测量的pd-1阳性/pd-1阴性t细胞的比例的改变。在一个实施方案中，mtor抑制剂的生物等同量或剂量是达到与参考剂量或参考量的参考化合物相同的p70s6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mtor抑制剂的生物等同量或剂量是达到与参考剂量或参考量的参考化合物相同水平的pd-1阳性/pd-1阴性t细胞比例改变的量或剂量。
在与mtor抑制剂(例如变构mtor抑制剂，例如rad001或雷帕霉素，或催化mtor抑制剂)结合使用时，术语“低免疫增强剂量”指部分但并非完全抑制例如通过p70s6激酶活性抑制测量的mtor活性的mtor抑制剂剂量。本文中讨论用于评价mtor活性的方法，例如通过p70s6激酶的抑制。该剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫反应。在一个实施方案中，mtor抑制剂的低免疫增强剂量导致pd-1阳性t细胞数减少和/或pd-1阴性t细胞数增加，或pd-1阴性t细胞/pd-1阳性t细胞的比例提高。在一个实施方案中，mtor抑制剂的低免疫增强剂量导致幼稚t细胞数增加。在一个实施方案中，mtor抑制剂的低免疫增强剂量导致以下一项或多项：
例如记忆t细胞(例如记忆t细胞前体)上一个或多个以下标志的表达增加：cd62l高、cd127高、cd27+和bcl2；
例如记忆t细胞(例如记忆t细胞前体)上klrg1的表达减少；和
记忆t细胞前体，例如具有以下特征中的任一项或任意组合的细胞的数目增加：cd62l高增加、cd127高增加、cd27+增加、klrg1减少和bcl2；
其中例如与未治疗的个体相比，任意上述改变例如至少瞬时发生。
本文所用的“难治的”指对治疗无反应的疾病，例如癌症。在一些实施方案中，难治性癌症可以在治疗之前或在治疗开始时对治疗有抗性。在其他实施方案中，该难治性癌症可以在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
本文所用的“复发的”指疾病(例如癌症)或疾病(如癌症)的病征和症状在改善一段时间后例如在之前的治疗(例如癌症治疗)处理后复发。
范围：在本公开通篇中，可以以范围型式呈现本发明的多种方面。应理解，范围型式的描述仅是为了方便和简洁，不应解释为对本发明范围的无灵活性的限制。因此，应认为范围的描述包含明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，如1至6的范围的描述应视为包含明确公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一实例，如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的事物，且包括如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论该范围宽度如何这都适用。
本文所用的术语“tet”指10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶家族的基因家族和由该基因编码的蛋白质。tet包括例如tet1、tet2和tet3。
本文所用的术语“tet2”指tet甲基胞嘧啶双加氧酶2基因和由该基因编码的蛋白质tet2甲基胞嘧啶双加氧酶，其催化甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶。它有时也称为“kiaa1546”、“flj20032”和“tet癌基因家族成员2”。所编码的蛋白质涉及成髓作用，此基因的缺陷与几种骨髓增生性障碍相关。在人基因组中，tet2定位于染色体4q24。目前，已鉴定出六种tet2同种型，它们的genebank号是：nm_001127208.2、xm_005263082.1、xm_006714242.2、nm_017628.4、xm_011532044.1和xm_011532043.1。
人tet2的蛋白质序列的实例作为uniprot检索号q6n021提供：
tet2基因定位于4号染色体位置grch38.p2(gcf_000001405.28)(nc_000004.12(105145875至105279803)；geneid54790。
下文提供编码tet2的核酸序列的实例。已鉴定出人tet2的6种同种型。下文提供mrna序列(在一些实施方案中，在每个序列中，可以用u替换t)。在一些实施方案中，tet2包括由以下各序列编码的蛋白质：
本文所用的术语“tet抑制剂”或“tet[x]抑制剂”(例如“tet1抑制剂”、“tet2抑制剂”或“tet3抑制剂”)指减少或消除相应tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的功能和/或表达的分子或一组分子(例如系统)。在一些实施方案中，tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂是抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达，例如减少或消除tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的分子。在一些实施方案中，tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂是抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)功能的分子。抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的实例是例如本文所述的基因编辑系统，其靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因或其调节元件内的核酸，使得改变基因编辑系统结合位点处或其附近的核酸修饰来减少或消除tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的表达。抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的另一实例是能够与tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)mrna杂交并导致tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)翻译减少或消除的核酸分子，例如rna分子，例如短发夹rna(shrna)或短干扰rna(sirna)。tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂还包括编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的分子的核酸(例如编码反义tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)shrna或sirna的核酸，或编码反义tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因编辑系统的一个或多个(例如全部)成分的核酸)。抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)功能的分子的实例是抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的一种或多种活性的分子，例如蛋白质或小分子。一个实例是tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的小分子抑制剂。另一个实例是显性阴性tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)蛋白质。另一个实例是tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合配偶体例如所结合的组蛋白脱乙酰化酶(hdac)的显性阴性形式。另一个实例是抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合配偶体的分子，例如小分子，例如tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合的hdac抑制剂。tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂还包括编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)功能抑制剂的核酸。
本文与基因编辑或tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制结合使用的术语“系统”指一起作用以实现所希望的功能的一组分子，例如一个或多个分子。
本文所用的术语“基因编辑系统”指通过该系统在所靶向的基因组dna位点处或其附近指导和实现一个或多个核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一个或多个分子。基因编辑系统为本领域已知，并在下文中更充分地描述。
本文在tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合配偶体的背景中所用的术语“结合配偶体”指与tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)蛋白质相互作用(例如结合)的分子，例如蛋白质。不受限于理论，认为tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合一种或多种hdac蛋白质。认为这类hdac蛋白质是tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合配偶体的实例。
“显性阴性”基因产物或蛋白质是干扰另一基因产物或蛋白质功能的基因产物或蛋白质。受影响的另一基因产物可以与该显性阴性蛋白质相同或不同。显性阴性基因产物可以具有许多形式，包括截短、具有点突变的全长蛋白质或其片段、或全长野生型或突变体蛋白质或其片段与其他蛋白质的融合。所观察到的抑制水平可以非常低。例如，与一种或多种功能性蛋白质相比，它可以需要大量过量的显性阴性蛋白质涉及过程，以观察到效应。它可以在正常生物测定条件下难以观察到效应。在一个实施方案中，显性阴性tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)是无催化活性的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)。在另一实施方案中，显性阴性tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合配偶体是无催化活性的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)结合hdac抑制剂。
描述
本发明提供tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂及其使用方法。具体而言，本发明提供包含tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的表达car的t细胞，及tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)与cart细胞结合的用途。下文更详细地描述本发明的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂，连同其使用方法。下文进一步描述car、cart细胞和使用方法。
tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂
本发明提供组合物，例如tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂，及用于通过使用本文所述的这类组合物和/或其他手段来增强免疫效应细胞功能(例如表达car的细胞的功能)的方法。本领域已知的任意tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂都可以用作本发明的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂。下文描述tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的实例。
基因编辑系统
根据本发明，基因编辑系统可用作tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂。本发明还考虑使用编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因编辑系统的一种或多种成分的核酸。
crispr/cas9基因编辑系统
天然存在的crispr/cas系统见于约40％已测序的真细菌基因组和90％已测序的古细菌(archaea)基因组中。grissa等(2007)bmcbioinformatics8:172。此系统是一类原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件如质粒和噬菌体的抗性，提供一种获得性免疫形式。barrangou等(2007)science315:1709-1712；marragini等(2008)science322:1843-1845。
crispr/cas系统已修饰用于真核生物如小鼠或灵长类中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。wiedenheft等(2012)nature482:331-8。这是通过例如将包含特别设计的crispr的质粒和一种或多种适当的cas引入真核细胞来达到。
crispr序列(有时称为crispr基因座)包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的crispr中，间隔区通常包含对细菌而言为外来的序列，如质粒或噬菌体序列；在示例性tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)crispr/cas系统中，间隔区源自tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因序列或其调节元件的序列。
来自crispr基因座的rna组成性表达并加工为小rna。这些小rna包含侧翼为重复序列的间隔区。rna指导其他cas蛋白质在rna或dna水平沉默外源遗传元件。horvath等(2010)science327:167-170；makarova等(2006)biologydirect1:7。间隔区因此作为rna分子的模板，类似于sirna。pennisi(2013)science341:833-836。
由于这些系统天然存在于许多不同类型的细菌中，crispr的确切排列及cas基因及其产物的结构、功能和数目在物种与物种之间稍有不同。haft等(2005)ploscomput.biol.1:e60；kunin等(2007)genomebiol.8:r61；mojica等(2005)j.mol.evol.60:174-182；bolotin等(2005)microbiol.151:2551-2561；pourcel等(2005)microbiol.151:653-663；和stern等(2010)trends.genet.28:335-340。例如，cse(cas亚型，大肠杆菌(e.coli))蛋白质(例如casa)形成功能性复合物cascade，cascade将crisprrna转录物加工为cascade保留的间隔区-重复序列单位。brouns等(2008)science321:960-964。在其他原核生物中，cas6加工crispr转录物。大肠杆菌中基于crispr的噬菌体失活需要cascade和cas3，而不是cas1或cas2。嗜热火球菌(pyrococcusfuriosus)和其他原核生物中的cmr(casramp模块)与识别并切割互补靶rna的小crisprrna形成功能性复合物。更简单的crispr系统依赖于cas9蛋白质，cas9蛋白质具有两个活性切割位点，一个用于双链体的一条链。组合cas9和经修饰的crispr基因座rna可用于基因编辑系统。pennisi(2013)science341:833-836。
crispr/cas系统因此可用于修饰(例如缺失一个或多个核酸)tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因，或tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因调节元件，或引入提前终止，从而减少功能性tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的表达。crispr/cas系统还可以像rna干扰一样使用，以可逆方式关闭tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因。在哺乳动物细胞中，例如，rna可以指导cas蛋白质至tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)启动子，在空间上阻断rna聚合酶。
真核细胞中用于基因编辑的crispr/cas系统通常涉及：(1)包含靶向序列(其能够与基因组dna靶序列杂交)和能够结合cas(例如cas9酶)的序列的向导rna分子(grna)；和(2)cas(例如cas9)蛋白质。靶向序列和能够结合cas(例如cas9酶)的序列可以放置在相同或不同的分子上。如果放置在不同分子上，则各包含允许分子例如通过杂交结合的杂交结构域。
本发明的示例性grna分子包含(例如由其组成)具有以下序列(其中“n”指靶向序列(例如，如本文中例如表3中所述)的残基，可由15-25个核苷酸组成，例如由20个核苷酸组成)的第一核酸：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuaugcuguuuug(seqidno:40)；
和具有以下序列的第二核酸序列：
aacuuaccaaggaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc，可选地在3’端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如7个)附加的u核苷酸(seqidno:41)。
第二核酸分子还可以由以上序列的片段组成，其中这种片段能够与第一核酸杂交。这种核酸分子的实例是：
aacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc,可选地在3’端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如7个)附加的u核苷酸(seqidno:42)。
本发明的另一示例性grna分子包含(例如由其组成)具有以下序列(其中“n”指靶向序列(例如，如本文中例如表3中所述)的残基，可由15-25个核苷酸组成，例如由20个核苷酸组成)的第一核酸：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc(seqidno:43),可选地在3’端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如7个)附加的u核苷酸。可以使用本领域已知的技术，例如美国公开号20140068797、wo2015/048577和cong(2013)science339:819-823中所述的技术，产生抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的人工crispr/cas系统。也可以产生抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的本领域已知的其他人工crispr/cas系统，例如tsai(2014)naturebiotechnol.,32:6569-576、美国专利号8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945和8,697,359中所述的系统，其内容在此以其整体引入作为参考。这类抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的系统可以通过例如将crispr/cas系统改造为包含含有与tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2基因)的序列杂交的靶向序列的grna分子来产生。在一些实施方案中，该grna包含与tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2基因)的15-25个核苷酸(例如20个核苷酸)完全互补的靶向序列。在一些实施方案中，将该tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2基因)的15-25个核苷酸(例如20个核苷酸)放置在紧挨crispr/cas系统的cas蛋白质所识别的原型间隔区邻近基序(pam)序列5’(例如，其中该系统包含化脓性葡萄球菌(s.pyogenes)？酿脓葡萄球菌cas9蛋白质，该pam序列包含ngg，其中n可以是a、t、g或c中的任一种)。在一些实施方案中，该grna的靶向序列包含(例如由其组成)与表2中所列序列互补的rna序列。在一些实施方案中，该grna包含表3中所列的靶向序列。
在一个实施方案中，可将外来dna连同crispr/cas系统引入细胞，例如，编码例如本文所述的car的dna；取决于外来dna的序列和染色体序列，此方法可以用于将编码例如本文所述的car的dna整合在crispr/cas系统所靶向的位点处或其附近。如本文在实施例中所示，但不受限于理论，这种整合可以导致car的表达以及tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因的破坏。这种外来dna分子在本文中称为“模板dna”。在一些实施方案中，该模板dna进一步在编码目的分子(例如编码本文所述的car)的模板dna核酸的5’、3’、或5’和3’包含同源臂，其中该同源臂与靶序列侧翼基因组dna序列互补。
在一个实施方案中，本发明的crispr/cas系统包含cas9(例如酿脓葡萄球菌cas9)及含有与tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因的序列杂交的靶向序列的grna。在一个实施方案中，该crispr/cas系统包含编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)grna的核酸和编码cas蛋白质(例如cas9，例如酿脓葡萄球菌cas9)的核酸。在一个实施方案中，该crispr/cas系统包含tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)grna和编码cas蛋白质(例如cas9，例如酿脓葡萄球菌cas9)的核酸。
下文表2中列出了可以针对其产生包含互补靶向序列的grna用于本发明的tet2基因组靶序列的实例。在一些实施方案中，该grna包含下表的靶序列的rna互补序列(例如，对于sgtet2_1，grna可包含ccuuggacaccuucuccucc(seqidno:44))。在一些实施方案中，该grna包含下文表2的靶序列的rna类似物(例如，对于sgtet2_1，grna可包含ggaaccuguggaagaggagg(seqidno:45)。在一些实施方案中，该tet2抑制剂是编码对tet特异的grna分子的核酸，其中该核酸包含例如u6或h1启动子控制下的来自下文表2的靶序列的序列：
表2
下文表3中提供用于本发明的多种实施方案来抑制tet(例如tet2)的grna靶向序列的实例。在一些实施方案中，本发明的crispr/cas系统包含含有靶向序列的grna分子，该靶向序列包含表3中所列的序列。在一些实施方案中，本发明的crispr/cas系统包含含有靶向序列的grna分子，该靶向序列是表3中所列的序列。
表3
talen基因编辑系统
talen是通过将tal效应子dna结合结构域与dna切割结构域融合而人工产生的。转录激活因子样效应(tale)可以改造为结合所希望的任何dna序列，包括hla或tcr基因的部分。通过将tale与dna切割结构域组合，可以产生对所希望的任何dna序列(包括hla或tcr基因的部分)特异的限制酶。然后可将这些组合引入细胞，其中它们可用于基因组编辑。boch(2011)naturebiotech.29:135-6；和boch等(2009)science326:1509-12；moscou等(2009)science326:3501。
tale是由黄单胞菌属(xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。dna结合结构域包含重复、高度保守的33-34个氨基酸的序列(第12和13个氨基酸除外)。这两个位置高度可变，显示与特异性核苷酸识别强相关。它们因此可以改造为结合所希望的dna序列。
为了产生talen，将tale蛋白质与核酸酶(n)(其是例如野生型或突变foki核酸内切酶)融合。针对其在talen中的用途对foki进行了几个突变；这些突变例如改善了切割特异性或活性。cermak等(2011)nucl.acidsres.39:e82；miller等(2011)naturebiotech.29:143-8；hockemeyer等(2011)naturebiotech.29:731-734；wood等(2011)science333:307；doyon等(2010)naturemethods8:74-79；szczepek等(2007)naturebiotech.25:786-793；和guo等(2010)j.mol.biol.200:96。
foki结构域作为二聚体发挥作用，需要两个构建体，该构建体具有正确取向和间隔开，对靶基因组中的位点独特的dna结合结构域。taledna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单talen结合位点间的碱基数对达到高水平活性似乎都是重要参数。miller等(2011)naturebiotech.29:143-8。
可在细胞内使用tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)talen来产生双链断裂(dsb)。如果修复机制通过非同源末端连接不正确的修复断裂，则可在断裂位点处引入突变。例如，不正确的修复可以引入移码突变。备选地，可将外来dna(例如编码例如本文所述car的dna)连同talen引入细胞；取决于外来dna的序列和染色体序列，此方法可以用于将编码例如本文所述的car的dna整合在talen所靶向的位点处或其附近。如本文在实施例中所示，但不受限于理论，这种整合可以导致car的表达以及tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因的破坏。这种外来dna分子在本文中称为“模板dna”。在一些实施方案中，该模板dna进一步在编码目的分子(例如编码本文所述的car)的模板dna核酸的5’、3’、或5’和3’包含同源臂，其中该同源臂与靶序列侧翼基因组dna序列互补。
可以用本领域已知的任意方法构建对tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)中的序列特异的talen，包括多种使用模块成分的方案。zhang等(2011)naturebiotech.29:149-53；geibler等(2011)plosone6:e19509；us8,420,782；us8,470,973，其内容在此以其整体引入作为参考。
抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的锌指核酸酶
“zfn”或“锌指核酸酶”指锌指核酸酶，其是可用于修饰(例如缺失其一个或多个核酸)所希望的核酸序列(例如tet，例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的人工核酸酶。
与talen一样，zfn包含与dna结合结构域融合的foki核酸酶结构域(或其衍生物)。在zfn的情况下，该dna结合结构域包含一个或多个锌指。carroll等(2011)geneticssocietyofamerica188:773-782；和kim等(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:1156-1160。
锌指是通过一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可以包含例如cys2his2，且可以识别约3bp的序列。可组合多种具有已知特异性的锌指来产生识别约6、9、12、15或18bp的序列的多指多肽。可用多种选择和模块组装技术来产生识别特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统、及哺乳动物细胞。
与talen一样，zfn必须二聚化来切割dna。因此，需要一对zfn来靶向非回文dna位点。两个单zfn必须结合dna的相反链，它们的核酸酶正确间隔开。bitinaite等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:10570-5。
还是与talen一样，zfn可以在dna中产生双链断裂，如果不正确地修复，则该双链断裂可产生移码突变，导致细胞中tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的表达和量减少。zfn也可以与同源重组一起使用来突变tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因，或在所靶向的序列处或其附近引入编码car的核酸。如上文所讨论，该编码car的核酸可以作为模板dna的部分引入。在一些实施方案中，该模板dna进一步在编码目的分子(例如编码本文所述的car)的模板dna核酸的5’、3’、或5’和3’包含同源臂，其中该同源臂与靶序列侧翼基因组dna序列互补。
可以用本领域已知的任意方法构建对tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因中的序列特异的zfn。参见例如provasi(2011)naturemed.18:807-815；torikai(2013)blood122:1341-1349；cathomen等(2008)mol.ther.16:1200-7；和guo等(2010)j.mol.biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230，其内容在此以其整体引入作为参考。在一些实施方案中，该zfn基因编辑系统(例如靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的基因编辑系统)还可以包含编码zfn基因编辑系统的一种或多种成分的核酸。
不受限于理论，认为靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的基因编辑系统(例如crispr/cas基因编辑系统)的使用可允许例如通过引起导致表达截短的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的编辑事件来抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的一种或多种功能。同样，不受限于理论，这类截短的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)蛋白质可以保留tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的一种或多种功能(例如支架功能)，同时抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的一种或多种其他功能(例如催化功能)，且这样可以是优选的。在这方面，可尤其优选靶向tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3基因，例如tet2基因)的晚期外显子或内含子的基因编辑系统。在一方面，本发明的基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向tet基因的晚期外显子或内含子。在一方面，本发明的基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向外显子8下游的外显子或内含子。在一方面，该基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向tet2基因的外显子8或外显子9，例如外显子9。
不受限于理论，在其他实施方案中，还可以优选靶向tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3基因，例如tet2基因)的早期外显子或内含子，例如以在所靶向的基因中引入导致无基因产物表达或表达完全无功能的基因产物的提前终止密码子。在这方面，可以尤其优选靶向tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3基因，例如tet2基因)的早期外显子或内含子的基因编辑系统。在一方面，本发明的基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向tet基因的早期外显子或内含子。在一方面，本发明的基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向外显子4上游的外显子或内含子。在一方面，该基因编辑系统tet抑制剂(例如tet1、tet2和/或tet3抑制剂，例如tet2抑制剂)靶向tet2基因的外显子1、外显子2或外显子3，例如外显子3。
不受限于理论，在其他实施方案中，还可优选靶向tet基因(例如tet1、tet2和/或tet3基因，例如tet2基因)的序列，其对tet(例如tet2基因)的一种或多种同种型特异但不影响tet(例如tet2)的一种或多种其他同种型。在一些实施方案中，可以优选特异性靶向包含催化结构域的tet(例如tet2)同种型。
tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的dsrna(例如sirna或shrna)抑制剂
根据本发明，可以用双链rna(“dsrna”)例如sirna或shrna作为tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂。本发明还考虑使用编码该tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的核酸。
在一个实施方案中，该tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂是对编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的核酸(例如编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的基因组dna或mrna)特异的核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna。
本发明的一个方面提供包含dsrna(例如sirna或shrna)的组合物，该dsrna包含与tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)核酸序列(例如编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的基因组dna或mrna)的序列互补(例如100％互补)的至少15个连续核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，例如21个连续核苷酸。在一个实施方案中，该至少15个连续核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，例如21个连续核苷酸包含表4中所列的shrna靶序列或编码tet2shrna的核酸的连续核苷酸。应理解，一些靶序列和/或shrna分子作为dna呈现，但靶向这些序列或包含这些序列的dsrna可以是rna，或本文中公开和/或本领域已知的任意核苷酸、修饰核苷酸或取代，只要该分子仍可以介导rna干扰。
在一个实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子的核酸分子与启动子(例如h1或u6来源的启动子)有效连接，使得抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子在表达car的细胞内表达。参见例如genetransfer:deliveryandexpressionofdnaandrna(friedmann和rossi编辑).coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,usa,2007中的tiscorniag.,“developmentoflentiviralvectorsexpressingsirna,”第3章；brummelkamptr,等(2002)science296:550–553；miyagishim等(2002)nat.biotechnol.19:497–500。在一个实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的dsrna分子的核酸分子存在于同一载体(例如慢病毒载体)上，该载体包含编码car的成分(例如所有成分)的核酸分子。在这种实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的dsrna分子的核酸分子在载体(例如慢病毒载体)上定位于编码car的成分(例如所有成分)的核酸的5’或3’。编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子的核酸分子可以与编码car的成分(例如所有成分)的核酸相同或不同的方向转录。在一个实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子的核酸分子存在于不同于包含编码car的成分(例如所有成分)的核酸分子的载体的载体上。在一个实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子的核酸分子在表达car的细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达的dsrna分子的核酸分子稳定整合入表达car的细胞的基因组。
下文提供编码shrna序列的核酸序列的实例。靶序列指tet2基因组dna(或周围dna)内的序列。编码tet2shrna的核酸编码用于本发明的shrna分子。在一些实施方案中，该tet2抑制剂是对下文所列靶序列特异或对其mrna互补序列特异的sirna或shrna。在一些实施方案中，该tet2抑制剂是由下文表4的编码tet2shrna的核酸编码的shrna。在一些实施方案中，该tet2抑制剂是包含下文表4的编码tet2shrna的核酸的核酸，例如该核酸处于u1或h1启动子控制下，使得产生tet2shrna。在一些实施方案中，本发明提供包含这样的序列的sirna或shrna，该序列是shrna靶序列(例如，表4的任意shrna的shrna靶序列)的rna类似物(即用u核酸残基替换所有t核酸残基)。
表4
可以设计其他tet2dsrna抑制剂(例如shrna和sirna分子)，并用本领域已知和本文中描述的方法测试。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1358。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1359。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1360。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1361。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1362。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向序列seqidno:1363。在一些实施方案中，该dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)靶向编码tet2的mrna的序列。
在一些实施方案中，该抑制剂是编码以上实施方案中任一个的dsrnatet2抑制剂(例如shrna或sirna)的核酸(例如dna)。在一些实施方案中，将该核酸(例如dna)放置在载体上，例如，例如本文所述的任意常规表达系统上，例如慢病毒载体上。
不受限于理论，靶向tetmrna(例如tet1、tet2和/或tet3基因，例如tet2mrna)序列的dsrnatet抑制剂(例如sirna或shrna)对tet(例如tet2)的一种或多种同种型特异但不影响tet(例如tet2)的一种或多种其他同种型(例如，由于靶向独特的剪接连接点，或靶向存在于tet(例如tet2)的一种或多种同种型中但不存在于tet(例如tet2)的一种或多种其他同种型中的结构域)。在一些实施方案中，可以优选特异性靶向包含催化结构域的tet(例如tet2)同种型。
小分子
tet抑制剂
在一些实施方案中，tet抑制剂是抑制tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)表达和/或功能的小分子。
tet2抑制剂
在一些实施方案中，tet2抑制剂是抑制tet2表达和/或功能的小分子。例如，本发明的tet2抑制剂是2-羟基戊二酸酯(cas#2889-31-8)。
在另一实例中，本发明的tet2抑制剂具有以下结构：
在另一实例中，本发明的tet抑制剂是n-[3-[7-(2,5-二甲基-2h-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1,4-二氢-2h-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(cas#839707-37-8)，且具有以下结构：
在另一实例中，本发明的tet2抑制剂是2-[(2,6-二氯-3-甲基苯基)氨基]苯甲酸(cas#644-62-2)，且具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的tet2抑制剂是前述任一种的可药用盐。
hdac抑制剂
任何已知的hdac抑制剂都可用于本发明。hdac抑制剂的非限制性实例包括：voninostat
蛋白质
显性阴性tet2
根据本发明，可以用显性阴性tet2同种型和编码该显性阴性tet2的核酸作为tet2抑制剂。在一些实施方案中，该显性阴性tet2缺乏tet2的催化功能。显性阴性tet2的实例是包含具有突变r1261g(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变r1261a(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变s1290a(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有wsmyyn(seqidno:1357的氨基酸1291-1296)至ggsggs(seqidnno:67)的突变(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变m1293a和y1294a(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变y1295a(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变s1303n(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变h1382y(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变d1384a(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。显性阴性tet2的实例是包含具有突变d1384v(按照seqidno:1357的编号)的seqidno:1357或由其组成的蛋白质。在一些实施方案中，该显性阴性tet2可以包含任意前述突变的组合。这类突变还描述于例如chen等,nature,493:561-564(2013)；hu等,cell,155:1545-1555(2013)中，其内容在此以其整体引入作为参考。
显性阴性tet2结合配偶体
不受限于理论，认为tet2与一种或多种hdac(例如免疫效应细胞中(例如t细胞中)表达的一种或多种hdac)相互作用(例如结合)，且这类tet2:hdac复合物可有助于细胞中的tet2活性。在一些实施方案中，本发明的tet2抑制剂是显性阴性tet2结合配偶体，例如显性阴性tet2结合hdac。在其他实施方案中，本发明的tet2抑制剂包含编码显性阴性tet2结合配偶体(例如显性阴性tet2结合hdac)的核酸。
编码tet2抑制剂的载体
如本文所述，本发明提供例如本文所述的载体，其编码tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂，如基因编辑系统、shrna或sirna、或tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的显性阴性抑制剂(例如，如本文中所述)。
在一些实施方案中，进一步包含例如car，该核酸可进一步包含编码例如本文所述的car的序列。在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文所述的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的核酸序列且包含编码本文所述的car分子的核酸序列的载体。在一些实施方案中，将核酸序列放置在分开的载体上。在其他实施方案中，该两个或多个核酸序列由同一可读框中的单个核酸分子编码且编码为单条多肽链。在这方面，该两个或多个car可以例如由一个或多个肽切割位点(例如自切割位点或胞内蛋白酶的底物)分开。肽切割位点的实例包括以下，其中gsg残基是可选的：
这些肽切割位点在本文中统称为“2a位点”。在一些实施方案中，该载体包含编码本文所述car的核酸序列和编码本文所述shrna或sirnatet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的核酸序列。在一些实施方案中，该载体包含编码本文所述car的核酸序列和编码本文所述基因编辑系统(例如crispr/cas系统)tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的核酸序列。
使用tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂的方法
本发明提供提高表达car的细胞(例如表达本文所述car的细胞，例如表达car19的细胞(例如ctl019))的治疗功效的方法，其包括提高该细胞中5-羟甲基胞嘧啶水平的步骤。在一些实施方案中，该方法包括减少或消除tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的功能或表达。在一些实施方案中，该方法包括使该细胞与本文所述tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂接触。
本发明还提供制备表达car的细胞，例如具有改善的功能(例如，具有改善的功效，例如肿瘤靶向或增殖)的表达car的细胞的方法，其包括减少或消除该细胞中tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的表达或功能的步骤。在一些实施方案中，该方法包括使该细胞与本文所述tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂接触。在一些实施方案中，该接触离体进行。在一些实施方案中，该接触在体内进行。在一些实施方案中，该接触在将该细胞修饰为表达car(例如本文所述的car)之前、与之同时、或在之后进行。
在一些实施方案中，本发明提供用于抑制表达car的细胞(例如表达本文所述car的细胞，例如表达car19的细胞(例如表达ctl019的细胞))中的tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)功能或表达的方法，该方法包括降低该细胞中5-羟甲基胞嘧啶水平的步骤。在一些实施方案中，该方法包括减少或消除tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的功能或表达。在一些实施方案中，该方法包括使该细胞与本文所述tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)抑制剂接触。
在一个实施方案中，本发明提供方法，例如上文所述的方法，其包括在tet基因或其调节元件内的位点处将编码car的核酸引入细胞(例如免疫效应细胞，例如t细胞)，使得tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的表达被破坏。tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因内位点处的整合可以例如用上文所述tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)靶向基因编辑系统来达到。
在一个实施方案中，本发明提供方法，例如上文所述的方法，其包括将基因编辑系统引入细胞的步骤，例如靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的crispr/cas基因编辑系统，例如包含具有与tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)基因的靶序列互补的靶向序列的grna分子的crispr/cas系统。在一些实施方案中，将该crispr/cas系统作为grna和cas酶的核糖核蛋白复合物引入该细胞，例如通过电穿孔引入。在一个实施方案中，该方法包括包括将编码crispr/cas系统的一种或多种成分的核酸引入该细胞。在一个实施方案中，将该核酸放置在编码car(例如本文所述的car)的载体上。
在一个实施方案中，本发明提供方法，例如上文所述的方法，其包括将靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的抑制性dsrna(例如shrna或sirna)引入细胞的步骤。在一个实施方案中，该方法包括将编码靶向tet(例如tet1、tet2和/或tet3，例如tet2)的抑制性dsrna(例如shrna或sirna)的核酸引入该细胞。在一个实施方案中，将该核酸放置在编码car(例如本文所述的car)的载体上。
下文描述car和cart细胞的其他成分及本发明相关方法。
本文提供用于用本发明的car改造的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)治疗诸如癌症的疾病的物质组合物和使用方法。
在一方面，本发明提供许多包含针对与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的特异性结合改造的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段、tcr或tcr片段)的嵌合抗原受体(car)。在一方面，本发明提供改造为表达car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，其中该改造的免疫效应细胞显示抗癌特性。在一方面，用car转化细胞，且该car表达在该细胞表面。在一些实施方案中，用编码car的病毒载体转导该细胞(例如t细胞、nk细胞)。在一些实施方案中，该病毒载体是反转录病毒载体。在一些实施方案中，该病毒载体是慢病毒载体。在一些这类实施方案中，该细胞可以稳定表达car。在另一实施方案中，用编码car的核酸(例如mrna、cdna、dna)转染该细胞(例如t细胞、nk细胞)。在一些这类实施方案中，该细胞可以瞬时表达car。
在一方面，本文所述的car的抗原结合结构域是scfv抗体片段。在一方面，这类抗体片段是功能性的，因为它们保留了同等的结合亲和力，例如它们以与它们所衍生自的igg抗体相当的亲和力结合同一抗原。在另一方面，该抗体片段具有更低的结合亲和力，例如它以比它所衍生自的抗体低的结合亲和力结合同一抗原，但是功能性的，因为它提供本文所述的生物学反应。在一个实施方案中，该car分子包含对靶抗原具有10-4m至10-8m，例如10-5m至10-7m，例如10-6m或10-7m的结合亲和力kd的抗体片段。在一个实施方案中，该抗体片段具有比参考抗体(例如本文所述抗体)低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1000倍的结合亲和力。
在一方面，这类抗体片段是功能性的，因为它们提供可包括但不限于技术人员可理解的免疫反应的激活、源自其靶抗原的信号转导的抑制、激活活性的抑制等的生物学反应。
在一方面，该car的抗原结合结构域是scfv抗体片段，其与它所衍生自的scfv的鼠序列相比进行了人源化。
在一方面，本发明的car的抗原结合结构域(例如scfv)由核酸分子编码，该核酸分子的序列针对在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。在一方面，本发明的整个car构建体由核酸分子编码，该核酸分子的序列针对在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。密码子优化指同义密码子(即编码同一氨基酸的密码子)在编码dna中出现的频率在不同物种中有偏差的发现。这种密码子简并性允许通过多种核苷酸序列编码相同的多肽。多种密码子优化方法为本领域已知，包括例如至少美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
在一方面，本发明的car将特异性抗体的抗原结合结构域与胞内信号发放分子组合。例如，在一些方面，该胞内信号发放分子包括但不限于cd3ζ链、4-1bb和cd28信号发放模块及其组合。在一方面，该抗原结合结构域结合本文所述的肿瘤抗原。
此外，本发明提供car和表达car的细胞，及其在用于治疗涉及表达本文所述肿瘤抗原的细胞或组织的癌症或任意恶性肿瘤或自身免疫病等疾病的药物或方法中的用途。
在一方面，本发明的car可以用于消除表达本文所述肿瘤抗原的正常细胞，从而可适合用作细胞移植之前的细胞调理治疗。在一方面，该表达本文所述肿瘤抗原的正常细胞是正常干细胞，该细胞移植是干细胞移植。
在一方面，本发明提供改造为表达嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，其中该改造的免疫细胞应细胞显示抗肿瘤特性。优选的抗原是本文所述癌症相关抗原(例如肿瘤抗原)。在一方面，该car的抗原结合结构域包含部分人源化的抗体片段。在一方面，该car的抗原结合结构域包含部分人源化的scfv。因此，本发明提供包含人源化抗原结合结构域并改造入细胞(例如t细胞或nk细胞)的car及其用于过继治疗的方法。
在一方面，本发明的car包含选自cd137(4-1bb)信号发放结构域、cd28信号发放结构域、cd27信号发放结构域、cd3ζ信号结构域及其任意组合的至少一个胞内结构域。在一方面，本发明的car包含来自cd137(4-1bb)或cd28以外的一个或多个共刺激分子的至少一个胞内信号发放结构域。
表1中列出了本发明的car的多种成分的一些实例的序列，其中aa代表氨基酸，na代表编码相应肽的核酸。
表1.car的多种成分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
癌症相关抗原
本发明提供改造为包含指导免疫效应细胞至癌症的一种或多种car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)。这是通过car上对癌症相关抗原特异的抗原结合结构域来达到。存在两类本发明的car可以靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)表达在癌细胞表面上的癌症相关抗原；和(2)本身在胞内但这种抗原(肽)的片段通过mhc(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞表面上的癌症相关抗原。
因此，本发明提供靶向以下癌症相关抗原(肿瘤抗原)的car：cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1(clecl1)、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tnag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-11ra、psca、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、prss21、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、肝配蛋白b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、岩藻糖基gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、邻-乙酰-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、tshr、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、legumain、hpve6,e7、mage-a1、magea1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白和端粒酶、pcta-1/半乳凝集素8、melana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5和igll1。
肿瘤支持抗原
本文所述的car可以包含结合肿瘤支持抗原(例如本文所述肿瘤支持抗原)的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段、tcr或tcr片段)。在一些实施方案中，该肿瘤支持抗原是存在于基底细胞或骨髓来源抑制细胞(mdsc)上的抗原。基底细胞可以在微环境中分泌生长因子来促进细胞分裂。mdsc细胞可以抑制t细胞增殖和活化。不希望受限于理论，在一些实施方案中，该表达car的细胞破坏肿瘤支持细胞，从而直接抑制肿瘤生长或存活。
在一些实施方案中，该基底细胞抗原选自以下一种或多种：骨髓基底细胞抗原2(bst2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)和生腱蛋白。在一个实施方案中，该fap特异性抗体是sibrotuzumab、与sibrotuzumab竞争结合、或具有与sibrotuzumab相同的cdr。在一些实施方案中，该mdsc抗原选自以下一种或多种：cd33、cd11b、c14、cd15和cd66b。因此，在一些实施方案中，该肿瘤支持抗原选自以下一种或多种：骨髓基底细胞抗原2(bst2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)或生腱蛋白、cd33、cd11b、c14、cd15和cd66b。
嵌合抗原受体(car)
本发明涵盖包含编码car的序列的重组dna构建体，其中该car包含特异性结合本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段、tcr或tcr片段)，其中抗原结合结构域的序列与编码胞内信号发放结构域的核酸序列相邻且在同一可读框中。该胞内信号发放结构域可以包含共刺激信号发放结构域和/或主信号发放结构域，例如ζ链。该共刺激信号发放结构域指car的包含共刺激分子的至少部分胞内结构域的部分。
在具体方面，本发明的car构建体包含scfv结构域，其中该scfv之前可以是如seqidno:2中所提供的可选的前导序列，之后是如seqidno:4或seqidno:6或seqidno:8或seqidno:10中所提供的可选的铰链序列、如seqidno:12中所提供的跨膜区、包含seqidno:14或seqidno:16的胞内信号发放结构域、及包含seqidno:18或seqidno:20的cd3ζ序列，例如，其中该结构域相邻且在同一可读框中，以形成单个融合蛋白。
在一方面，示例性car构建体包含可选的前导序列(例如本文所述前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如本文所述抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述铰链)、跨膜结构域(例如本文所述跨膜结构域)和胞内刺激结构域(例如本文所述胞内刺激结构域)。在一方面，示例性car构建体包含可选的前导序列(例如本文所述前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如本文所述抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述铰链)、跨膜结构域(例如本文所述跨膜结构域)和胞内共刺激信号发放结构域(例如本文所述胞内共刺激信号发放结构域)和/或胞内主信号发放结构域(例如本文所述主信号发放结构域)。
示例性前导序列作为seqidno:2提供。示例性铰链/间隔序列作为seqidno:4或seqidno:6或seqidno:8或seqidno:10提供。示例性跨膜结构域序列作为seqidno:12提供。4-1bb蛋白质的胞内信号发放结构域的示例性序列作为seqidno:14提供。cd27的胞内信号发放结构域的示例性序列作为seqidno:16提供。示例性cd3ζ结构域序列作为seqidno:18或seqidno:20提供。
在一方面，本发明涵盖包含编码car的核酸分子的重组核酸构建体，其中该核酸分子包含编码例如本文所述抗原结合结构域的核酸序列，该核酸序列与编码胞内信号发放结构域的核酸序列相邻且在同一可读框中。
在一方面，本发明涵盖包含编码car的核酸分子的重组核酸构建体，其中该核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码胞内信号发放结构域的核酸序列相邻且在同一可读框中。可用于该car的示例性胞内信号发放结构域包括但不限于例如cd3-ζ、cd28、cd27、4-1bb等的一个或多个胞内信号发放结构域。在一些情况下，该car可以包含cd3-ζ、cd28、4-1bb等的任意组合。
编码所希望得到的分子的核酸序列可以用本领域已知的重组方法获得，例如通过筛选来自表达该核酸分子的细胞的文库，通过从已知包含该核酸分子的载体衍生该核酸分子，或通过用标准技术直接从包含该核酸分子的细胞和组织分离。备选地，目的核酸可以合成产生而不是克隆产生。
本发明包括可直接转导入细胞的表达car的反转录病毒和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可直接转染入细胞的rna构建体。产生用于转染的mrna的方法涉及用特别设计的引物体外转录(ivt)模板，然后添加polya，以产生包含3’和5’非翻译序列(utr)(例如本文所述3’和/或5’utr)、5’帽(例如本文所述5’帽)和/或内部核糖体进入位点(ires)(例如本文所述ires)、待表达的核酸及polya尾(长度通常为50-2000个碱基(seqidno:32))的构建体。这样产生的rna可以有效转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，该模板包含car的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将rnacar载体转导入细胞，例如t细胞或nk细胞。
抗原结合结构域
在一方面，本发明的car包含另称为抗原结合结构域的靶标特异性结合元件。该部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择识别这样的配体的抗原结合结构域，该配体作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志发挥作用。因此，可作为本发明的car中的抗原结合结构域的配体发挥作用的细胞表面标志的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫病和癌细胞相关的那些。
在一方面，可通过将特异性结合所希望的抗原的抗原结合结构域改造入car的方式来使car介导的t细胞反应指向目的抗原。
在一方面，car的包含抗原结合结构域的部分含有靶向肿瘤抗原(例如本文所述肿瘤抗原)的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是结合该抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，如重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(vl)和骆驼来源纳米抗体的可变结构域(vhh)，本领域已知作为抗原结合结构域发挥作用的备选支架，如重组纤连蛋白结构域、t细胞受体(tcr)或其片段，例如单链tcr，等等。在一些情况下，抗原结合结构域源自最终将在其中使用car的相同物种是有益的。例如，对于在人类中使用，car的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基是有益的。
在一个实施方案中，该cd19car是美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；xu等,leuklymphoma.201354(2):255-260(2012)；cruz等,blood122(17):2965-2973(2013)；brentjens等,blood,118(18):4817-4828(2011)；kochenderfer等,blood116(20):4099-102(2010)；kochenderfer等,blood122(25):4129-39(2013)；或16thannumeetamsocgencellther(asgct)(五月15-18,saltlakecity)2013,abst10(其中每一篇在此以其整体引入作为参考)中所述的cd19car。在一个实施方案中，抗cd19的抗原结合结构域是例如pct公开wo2012/079000(在此以其整体引入作为参考)中所述的car、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如cdr)。在一个实施方案中，抗cd19的抗原结合结构域是例如pct公开wo2014/153270；kochenderfer,j.n.等,j.immunother.32(7),689-702(2009)；kochenderfer,j.n.等,blood,116(20),4099-4102(2010)；pct公开wo2014/031687；bejcek,cancerresearch,55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190(其中每一篇在此以其整体引入作为参考)中所述的car、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如cdr)。
在一个实施方案中，抗间皮素的抗原结合结构域是或可源自例如pct公开wo2015/090230中所述的抗体、抗原结合片段或car的抗原结合结构域，例如cdr、scfv、或vh和vl(在一个实施方案中，该car是wo2015/090230中所述的car，其内容在此以其整体引入作为参考)。在一些实施方案中，抗间皮素的抗原结合结构域是或可源自例如pct公开wo1997/025068、wo1999/028471、wo2005/014652、wo2006/099141、wo2009/045957、wo2009/068204、wo2013/142034、wo2013/040557或wo2013/063419(其中每一篇在此以其整体引入作为参考)中所述的抗体、抗体片段或car的抗原结合部分，例如cdr、scfv、或vh和vl。
在一个实施方案中，抗cd123的抗原结合结构域是或源自例如pct公开wo2014/130635(在此以其整体引入作为参考)中所述的抗体、抗原结合片段或car的抗原结合部分，例如cdr、scfv、或vh和vl。在一个实施方案中，抗cd123的抗原结合结构域是或源自例如pct公开wo2016/028896(在此以其整体引入作为参考)中所述的抗体、抗原结合片段或car的抗原结合部分，例如cdr、scfv、或vh和vl；在一些实施方案中，该car是wo2016/028896中所述的car。在一个实施方案中，抗cd123的抗原结合结构域是或源自例如pct公开wo1997/024373、wo2008/127735(例如26292、32701、37716或32703的cd123结合结构域)、wo2014/138805(例如csl362的cd123结合结构域)、wo2014/138819、wo2013/173820、wo2014/144622、wo2001/66139、wo2010/126066(例如old4、old5、old17、old19、new102或old6中任一个的cd123结合结构域)、wo2014/144622或us2009/0252742(其中每一篇在此以其整体引入作为参考)中所述的抗体、抗原结合片段或car的抗原结合部分，例如cdr、scfv、或vh和vl。
在一个实施方案中，抗cd22的抗原结合结构域是例如haso等,blood,121(7):1165-1174(2013)；wayne等,clincancerres16(6):1894-1903(2010)；kato等,leukres37(1):83-88(2013)；creativebiomart(creativebiomart.net):mom-18047-s(p)中所述的抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cs-1的抗原结合结构域是elotuzumab(bms)的抗原结合部分，例如cdr。参见例如tai等,2008,blood112(4):1329-37；tai等,2007,blood.110(5):1656-63。
在一个实施方案中，抗cll-1的抗原结合结构域是例如pct公开wo2016/014535(其内容在此以其整体引入)中所述的抗体、抗原结合片段或car的抗原结合部分，例如cdr或vh和vl。在一个实施方案中，抗cll-1的抗原结合结构域是可从r&d,ebiosciences,abcam获得的抗体(例如pe-cll1-hu目录号353604(biolegend)和pe-cll1(clec12a)目录号562566(bd))的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd33的抗原结合结构域是例如bross等,clincancerres7(6):1490-1496(2001)(gemtuzumabozogamicin,hp67.6),caron等,cancerres52(24):6761-6767(1992)(lintuzumab,hum195),lapusan等,investnewdrugs30(3):1121-1131(2012)(ave9633),aigner等,leukemia27(5):1107-1115(2013)(amg330,cd33bite),dutour等,advhematol2012:683065(2012),和pizzitola等,leukemiadoi:10.1038/lue.2014.62(2014)中所述的抗体的抗原结合部分，例如cdr。靶向cd33的示例性car分子在本文中描述，并在wo2016/014576中，例如在wo2016/014576的表2中提供(在此以其整体引入)。
在一个实施方案中，抗gd2的抗原结合结构域是例如mujoo等,cancerres.47(4):1098-1104(1987)；cheung等,cancerres45(6):2642-2649(1985),cheung等,jclinoncol5(9):1430-1440(1987),cheung等,jclinoncol16(9):3053-3060(1998),handgretinger等,cancerimmunolimmunother35(3):199-204(1992)中所述的抗体的抗原结合部分，例如cdr。在一些实施方案中，抗gd2的抗原结合结构域是选自mab14.18、14g2a、ch14.18、hu14.18、3f8、hu3f8、3g6、8b6、60c3、10b8、me36.1和8h9的抗体的抗原结合部分，参见例如wo2012033885、wo2013040371、wo2013192294、wo2013061273、wo2013123061、wo2013074916和wo201385552。在一些实施方案中，抗gd2的抗原结合结构域是美国专利号20100150910或pct公开号wo2011160119中所述抗体的抗原结合部分。
在一个实施方案中，抗bcma的抗原结合结构域是例如wo2012163805、wo200112812和wo2003062401中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2012/0163805(其内容在此以其整体引入作为参考)的抗原结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2016/014565(其内容在此以其整体引入作为参考)的抗原结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2014/122144(其内容在此以其整体引入作为参考)的抗原结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2016/014789(其内容在此以其整体引入作为参考)的car分子和/或bcma结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2014/089335(其内容在此以其整体引入作为参考)的car分子和/或bcma结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。在一些实施方案中，用来自pct公开号wo2014/140248(其内容在此以其整体引入作为参考)的car分子和/或bcma结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl序列)产生其他示例性bcmacar构建体。
在一个实施方案中，抗tn的抗原结合结构域是例如us2014/0178365,us8,440,798,brooks等,pnas107(22):10056-10061(2010),和stone等,oncoimmunology1(6):863-873(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗psma的抗原结合结构域是例如parker等,proteinexprpurif89(2):136-145(2013),us20110268656(j591scfv)；frigerio等,europeanjcancer49(9):2223-2232(2013)(scfvd2b)；wo2006125481(mabs3/a12、3/e7和3/f11及单链抗体片段(scfva5和d7))中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗ror1的抗原结合结构域是例如hudecek等,clincancerres19(12):3153-3164(2013)；wo2011159847；和us20130101607中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗flt3的抗原结合结构域是例如wo2011076922、us5777084、ep0754230、us20090297529中所述抗体和几种市售目录抗体(r&d,ebiosciences,abcam)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗tag72的抗原结合结构域是例如hombach等,gastroenterology113(4):1163-1170(1997)中所述抗体和abcamab691的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗fap的抗原结合结构域是例如ostermann等,clinicalcancerresearch14:4584-4592(2008)(fap5)、美国专利公开号2009/0304718中所述抗体和sibrotuzumab(参见例如hofheinz等,oncologyresearchandtreatment26(1),2003；和tran等,jexpmed210(6):1125-1135(2013))的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd38的抗原结合结构域是daratumumab(参见例如groen等,blood116(21):1261-1262(2010))、mor202(参见例如us8,263,746)、或us8,362,211中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd44v6的抗原结合结构域是例如casucci等,blood122(20):3461-3472(2013)中所述的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cea的抗原结合结构域是例如chmielewski等,gastoenterology143(4):1095-1107(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗epcam的抗原结合结构域是选自mt110、epcam-cd3双特异性ab(参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/nct00635596)、edrecolomab、3622w94、ing-1和adecatumumab(mt201)的抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗prss21的抗原结合结构域是美国专利号8,080,650中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗b7h3的抗原结合结构域是抗体mga271(macrogenics)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗kit的抗原结合结构域是例如us7915391、us20120288506中所述抗体和几种市售目录抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗il-13ra2的抗原结合结构域是例如wo2008/146911、wo2004087758、几种市售目录抗体和wo2004087758中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd30的抗原结合结构域是例如us7090843b1和ep0805871中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗gd3的抗原结合结构域是例如us7253263、us8,207,308、us20120276046、ep1013761、wo2005035577和us6437098中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd171的抗原结合结构域是例如hong等,jimmunother37(2):93-104(2014)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗il-11ra的抗原结合结构域是可从abcam(目录号ab55262)或novusbiologicals(目录号epr5446)获得的抗体的抗原结合部分，例如cdr。在另一实施方案中，抗il-11ra的抗原结合结构域是肽，参见例如huang等,cancerres72(1):271-281(2012)。
在一个实施方案中，抗psca的抗原结合结构域是例如morgenroth等,prostate67(10):1121-1131(2007)(scfv7f5)；nejatollahi等,jofoncology2013(2013),articleid839831(scfvc5-ii)；和美国专利公开号20090311181中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗vegfr2的抗原结合结构域是例如chinnasamy等,jclininvest120(11):3953-3968(2010)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗lewisy的抗原结合结构域是例如kelly等,cancerbiotherradiopharm23(4):411-423(2008)(hu3s193ab(scfvs))；dolezal等,proteinengineering16(1):47-56(2003)(nc10scfv)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd24的抗原结合结构域是例如maliar等,gastroenterology143(5):1375-1384(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗pdgfr-β的抗原结合结构域是抗体abcamab32570的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗ssea-4的抗原结合结构域是抗体(cellsignaling)或其他市售抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd20的抗原结合结构域是抗体rituximab、ofatumumab、ocrelizumab、veltuzumab或ga101的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体imgn853或us20120009181、us4851332、lk26:us5952484中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗erbb2(her2/neu)的抗原结合结构域是抗体trastuzumab或pertuzumab的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗muc1的抗原结合结构域是抗体sar566658的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗egfr的抗原结合结构域是抗体cetuximab、panitumumab、zalutumumab、nimotuzumab或matuzumab的抗原结合部分，例如cdr。在一个实施方案中，抗egfrviii的抗原结合结构域是或可源自例如pct公开号wo2014/130657中所述抗体、抗原结合片段或cat的抗原结合结构域(例如cdr、scfv、或vh和vl)(在一个实施方案中，该cat是wo2014/130657中所述的car，其内容在此以其整体引入)。
在一个实施方案中，抗ncam的抗原结合结构域是抗体克隆2-2b:mab5324(emdmillipore)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗肝配蛋白b2的抗原结合结构域是例如abengozar等,blood119(19):4565-4576(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗igf-i受体的抗原结合结构域是例如us8344112b2、ep2322550a1、wo2006/138315或pct/us2006/022995中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗caix的抗原结合结构域是抗体克隆303123(r&dsystems)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗lmp2的抗原结合结构域是例如us7,410,640或us20050129701中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗gp100的抗原结合结构域是抗体hmb45、nkibetab或wo2013165940或us20130295007中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗酪氨酸酶的抗原结合结构域是例如us5843674或us19950504048中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗epha2的抗原结合结构域是例如yu等,molther22(1):102-111(2014)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗gd3的抗原结合结构域是例如us7253263、us8,207,308、us20120276046、ep1013761a3、20120276046、wo2005035577或us6437098中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗岩藻糖基gm1的抗原结合结构域是例如us20100297138或wo2007/067992中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗sle的抗原结合结构域是抗体g193(对于lewisy)的抗原结合部分，例如cdr，参见scottam等,cancerres60:3254-61(2000)，还如neeson等,jimmunol五月，2013190(meetingabstractsupplement)177.10中所述。
在一个实施方案中，抗gm3的抗原结合结构域是抗体ca2523449(mab14f7)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗hmwmaa的抗原结合结构域是例如kmiecik等,oncoimmunology3(1):e27185(2014)(pmid:24575382)(mab9.2.27)、us6528481、wo2010033866或us20140004124中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗邻-乙酰-gd2的抗原结合结构域是抗体8b6的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗tem1/cd248的抗原结合结构域是例如marty等,cancerlett235(2):298-308(2006)；zhao等,jimmunolmethods363(2):221-232(2011)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cldn6的抗原结合结构域是抗体imab027(ganymedpharmaceuticals)的抗原结合部分，例如cdr，参见例如clinicaltrial.gov/show/nct02054351。
在一个实施方案中，抗tshr的抗原结合结构域是例如us8,603,466、us8,501,415或us8,309,693中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗gprc5d的抗原结合结构域是抗体fab6300a(r&dsystems)或ls-a4180(lifespanbiosciences)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd97的抗原结合结构域是例如us6,846,911；degroot等,jimmunol183(6):4127-4134(2009)中所述抗体或来自r&d的抗体mab3734的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗alk的抗原结合结构域是例如mino-kenudson等,clincancerres16(5):1561-1571(2010)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗多聚唾液酸的抗原结合结构域是例如nagae等,jbiolchem288(47):33784-33796(2013)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗plac1的抗原结合结构域是例如ghods等,biotechnolapplbiochem2013doi:10.1002/bab.1177中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗globoh的抗原结合结构域是抗体vk9或例如kudryashovv等,glycoconjj.15(3):243-9(1998),lou等,procnatlacadsciusa111(7):2482-2487(2014)；mbr1:bremere-g等jbiolchem259:14773–14777(1984)中所述抗体的抗原结合部分。
在一个实施方案中，抗ny-br-1的抗原结合结构域是例如jager等,applimmunohistochemmolmorphol15(1):77-83(2007)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗wt-1的抗原结合结构域是例如dao等,scitranslmed5(176):176ra33(2013)；或wo2012/135854中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗mage-a1的抗原结合结构域是例如willemsen等,jimmunol174(12):7853-7858(2005)(tcr样scfv)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗精子蛋白质17的抗原结合结构域是例如song等,targetoncol2013年8月14日(pmid:23943313)；song等,medoncol29(4):2923-2931(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗tie2的抗原结合结构域是抗体ab33(cellsignalingtechnology)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗mad-ct-2的抗原结合结构域是例如pmid:2450952；us7635753中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12f9(novusbiologicals)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗melana/mart1的抗原结合结构域是例如ep2514766a2或us7,749,719中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗肉瘤易位断点的抗原结合结构域是例如luo等,embomol.med.4(6):453-461(2012)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗trp-2的抗原结合结构域是例如wang等,jexpmed.184(6):2207-16(1996)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cyp1b1的抗原结合结构域是例如maecker等,blood102(9):3287-3294(2003)中所述抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗rage-1的抗原结合结构域是抗体mab5328(emdmillipore)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是目录号ls-b95-100(lifespanbiosciences)的抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗肠羧基酯酶的抗原结合结构域是目录号ls-b6190-50(lifespanbiosciences)的抗体4f12的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗muthsp70-2的抗原结合结构域是lifespanbiosciences单克隆目录号ls-c133261-100(lifespanbiosciences)的抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd79a的抗原结合结构域是可从abcam获得的抗体抗cd79a抗体[hm47/a9](ab3121)、可从cellsignallingtechnology获得的抗体cd79a抗体#3351或可从sigmaaldrich获得的在兔中产生的抗体hpa017748-抗cd79a抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd79b的抗原结合结构域是抗体polatuzumabvedotin、dornan等,“therapeuticpotentialofananti-cd79bantibody-drugconjugate,anti-cd79b-vc-mmae,forthetreatmentofnon-hodgkinlymphoma”blood.2009年9月24日；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.epub2009年7月24日中所述抗cd79b、或“4507pre-clinicalcharacterizationoftcell-dependentbispecificantibodyanti-cd79b/cd3asapotentialtherapyforbcellmalignancies”abstractsof56thashannualmeetingandexposition,sanfrancisco,cadecember6-92014中所述双特异性抗体抗cd79b/cd3的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd72的抗原结合结构域是myers和uckun,“ananti-cd72immunotoxinagainsttherapy-refractoryb-lineageacutelymphoblasticleukemia.”leuklymphoma.1995年6月；18(1-2):119-22中所述抗体j3-109或polson等,“antibody-drugconjugatesforthetreatmentofnon–hodgkin'slymphoma:targetandlinker-drugselection”cancerresmarch15,200969；2358中所述抗cd72(10d6.8.1,migg1)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗lair1的抗原结合结构域是可从prospec获得的抗体ant-301lair1抗体或可从biolegend获得的抗人cd305(lair1)抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗fcar的抗原结合结构域是可从sinobiologicalinc获得的抗体cd89/fcar抗体(catalog#10414-h08h)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗lilra2的抗原结合结构域是可从abnova获得的抗体lilra2单克隆抗体(m17)克隆3c7或可从lifespanbiosciences获得的小鼠抗lilra2抗体单克隆(2d7)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗cd300lf的抗原结合结构域是可从biolegend获得的抗体小鼠抗cmrf35样分子1抗体单克隆[up-d2]或可从r&dsystems获得的大鼠抗cmrf35样分子1抗体单克隆[234903]的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗clec12a的抗原结合结构域是noordhuis等,“targetingofclec12ainacutemyeloidleukemiabyantibody-drug-conjugatesandbispecificcll-1xcd3biteantibody”53rdashannualmeetingandexposition,2011年12月10-13日中所述抗体双特异性t细胞衔接物(bite)scfv抗体和adc及mcla-117(merus)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗bst2(也称为cd317)的抗原结合结构域是可从antibodies-online获得的抗体小鼠抗cd317抗体单克隆[3h4]或可从r&dsystems获得的小鼠抗cd317抗体单克隆[696739]的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗emr2(也称为cd312)的抗原结合结构域是可从lifespanbiosciences获得的抗体小鼠抗cd312抗体单克隆[ls-b8033]或可从r&dsystems获得的小鼠抗cd312抗体单克隆[494025]的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗ly75的抗原结合结构域是可从emdmillipore获得的抗体小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体单克隆[hd30]或可从lifetechnologies获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体单克隆[a15797]的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗gpc3的抗原结合结构域是nakanok,ishigurot,konishih等generationofahumanizedanti-glypican3antibodybycdrgraftingandstabilityoptimization.anticancerdrugs.2010年11月；21(10):907–916中所述抗体hgc33、或mdx-1414、hn3或yp7(三者都描述于feng等,“glypican-3antibodies:anewtherapeutictargetforlivercancer.”febslett.2014年1月21日；588(2):377-82中)的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗fcrl5的抗原结合结构域是elkins等,“fcrl5asatargetofantibody-drugconjugatesforthetreatmentofmultiplemyeloma”molcancerther.2012年10月；11(10):2222-32中所述抗fcrl5抗体的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，抗igll1的抗原结合结构域是可从lifespanbiosciences获得的抗体小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽i抗体单克隆[at1g4]、可从biolegend获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽i抗体单克隆[hsl11]的抗原结合部分，例如cdr。
在一个实施方案中，该抗原结合结构域包含来自上文所列抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链cdr：hccdr1、hccdr2和hccdr3，和/或来自上文所列抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链cdr：lccdr1、lccdr2和lccdr3。在一个实施方案中，该抗原结合结构域包含上文所列抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在另一方面，该抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中修饰该抗体的特定序列或区域来提高与人中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，该抗原结合结构域是人源化的。
人源化抗体可用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于：cdr移植(参见例如欧洲专利号ep239,400；国际公开号wo91/09967；及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其中每一个在此以其整体引入作为参考)，镶饰或重塑(参见例如欧洲专利号ep592,106和ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等,1994,proteinengineering,7(6):805-814；及roguska等,1994,pnas,91:969-973，其中每一个在此以其整体引入作为参考)，链改组(参见例如美国专利号5,565,332，在此以其整体引入作为参考)，及例如美国专利申请公开号us2005/0042664、美国专利申请公开号us2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号wo9317105、tan等,j.immunol.,169:1119-25(2002)、caldas等,proteineng.,13(5):353-60(2000)、morea等,methods,20(3):267-79(2000)、baca等,j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997)、roguska等,proteineng.,9(10):895-904(1996)、couto等,cancerres.,55(23supp):5973s-5977s(1995)、couto等,cancerres.,55(8):1717-22(1995)、sandhujs,gene,150(2):409-10(1994)和pedersen等,j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)中公开的技术，其中每一个在此以其整体引入作为参考。通常，将用来自cdr供体抗体的相应残基取代构架区中的构架残基来改变(例如改善)抗原结合。通过本领域公知的方法来鉴定这些构架取代，例如通过模拟cdr和构架残基的相互作用来鉴定对抗原结合重要的构架残基，通过序列比价来鉴定特定位置处的不常见构架残基。(参见例如queen等,美国专利号5,585,089；及riechmann等,1988,nature,332:323，在此以其整体引入作为参考)。
人源化抗体或抗体片段具有一个或多个保留在其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。本文提供的人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的cdr，及其中构架所包含的氨基酸残基完全或大部分源自人种系的构架区。多种用于人源化抗体或抗体片段的技术为本领域公知，且可以通过用相应的人抗体序列取代啮齿类cdr或cdr序列(即cdr移植)(ep239,400；pct公开号wo91/09967；及美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容在此以其整体引入作为参考)，基本按winter及其同事的方法进行(jones等,nature,321:522-525(1986)；riechmann等,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等,science,239:1534-1536(1988))。在这类人源化抗体和抗体片段中，用来自非人物种的相应序列取代基本非(substantiallylessthan)完整人可变结构域。人源化抗体常是人抗体，其中用来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代了一些cdr残基及可能取代一些构架(fr)残基。抗体和抗体片段的人源化还可以通过镶饰或重塑(ep592,106；ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等,proteinengineering,7(6):805-814(1994)；及roguska等,pnas,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)来达到，其内容在此以其整体引入作为参考。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择是降低抗原性。按照所谓的“最佳契合”法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。然后接受与啮齿类序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人构架(fr)(sims等,j.immunol.,151:2296(1993)；chothia等,j.mol.biol.,196:901(1987)，其内容在此以其整体引入作为参考)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。同一构架可以用于几种不同的人源化抗体(参见例如nicholson等mol.immun.34(16-17):1157-1165(1997)；carter等,proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等,j.immunol.,151:2623(1993)，其内容在此以其整体引入作为参考)。在一些实施方案中，重链可变区的构架区(例如全部四个构架区)源自vh4_4-59种系序列。在一个实施方案中，该构架区可以包含例如从相应鼠序列上的氨基酸进行的一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如取代。在一个实施方案中，轻链可变区的构架区(例如全部四个构架区)源自vk3_1.25种系序列。在一个实施方案中，该构架区可以包含例如从相应鼠序列上的氨基酸进行的一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如取代。
在一些方面，本发明的car组合物的包含抗体片段的部分是人源化的，保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，通过用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型是常用的，并为本领域技术人员熟知。可以使用说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。这些序列的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列执行功能中可能的作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序列选择并组合fr残基，使得达到所希望得到的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的亲和力提高。通常，cdr残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可保留与原抗体相似的抗原特异性，例如，在本发明中，结合本文所述人癌症相关抗原的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的结合本文所述人癌症相关抗原的亲和力和/或特异性。
在一方面，本发明的抗原结合结构域表征为抗体或抗体片段的具体功能特征或特性。例如，在一方面，本发明的car组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合本文所述肿瘤抗原。
在一方面，本文所述抗癌症相关抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scfv)。在一方面，本文所述抗癌症相关抗原结合结构域是fv、fab、(fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如lanzavecchia等,eur.j.immunol.17,105(1987))。在一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合本文所述癌症相关抗原。
在一些情况下，可以按照本领域已知的方法(参见例如bird等,(1988)science242:423-426和huston等,(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)制备scfv。可以通过用柔性多肽接头连接vh和vl区来产生scfv分子。scfv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如ser-gly接头)。接头长度可极大地影响scfv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果利用短的多肽接头(例如5-10个氨基酸之间)，则阻止了链内折叠。还需要链间折叠来将两个可变区带到一起形成功能性表位结合部位。接头取向和大小的实例参见例如hollinger等1993procnatlacad.sci.u.s.a.90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，及pct公开号wo2006/020258和wo2007/024715，在此引入作为参考。
scfv在其vl和vh区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一实施方案中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复组，如(gly4ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(seqidno:22)。在一个实施方案中，接头可以是(gly4ser)4(seqidno:29)或(gly4ser)3(seqidno:30)。接头长度的变异可保留或增强活性，在活性研究中产生更优的功效。
在另一方面，该抗原结合结构域是t细胞受体(“tcr”)或其片段，例如单链tcr(sctcr)。制备这类tcr的方法为本领域已知，参见例如willemsenra等,genetherapy7:1369–1377(2000)；zhangt等,cancergenether11:487–496(2004)；aggen等,genether.19(4):365-74(2012)(参考文献在此以其整体引入)。例如，可以改造包含通过接头(例如柔性接头)连接的来自t细胞克隆的vα和vβ基因的sctcr。此方法对本身在胞内但这种抗原(肽)的片段通过mhc呈递在癌细胞表面的癌症相关靶标非常有用。
双特异性car
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子表征为对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，该第一和第二表位在同一抗原(例如同一蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在一个实施方案中，该第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，该第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，该第一和第二表位在不同抗原(例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scfv或其片段，及对第二表位具有结合特异性的scfv或其片段。
在某些实施方案中，该抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的流程为本领域已知；包括但不限于例如：例如us5731168中所述的“杵入臼”法；例如wo09/089004、wo06/106905和wo2010/129304中所述的静电引导fc配对；例如wo07/110205中所述的链交换改造结构域(seed)异二聚体形成；例如wo08/119353、wo2011/131746和wo2013/060867中所述的fab臂交换；例如us4433059中所述双抗体缀合物，例如，用具有胺基反应性基团和巯基反应性基团的异双功能试剂通过抗体交联产生双特异性结构；例如us4444878中所述通过还原和氧化两条重链间二硫键的循环重组来自不同抗体的半抗体(fab的重链-轻链对)而产生的双特异性抗体决定簇；例如us5273743中所述三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个fab'片段；例如us5534254中所述生物合成结合蛋白质，例如通过c端尾优选通过二硫键或胺基反应性化学交联交联的scfv对；例如us5582996中所述双功能抗体，例如通过替换恒定结构域的亮氨酸拉链(例如c-fos和c-jun)二聚化的具有不同结合特异性的fab片段；例如us5591828中所述双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如通常结合轻链的在一种抗体的ch1区和另一种抗体的vh区之间通过多肽间隔区连接的两种抗体(两种fab片段)的vh-ch1区；例如us5635602中所述的双特异性dna-抗体缀合物，例如通过一段双链dna交联抗体或fab片段；例如us5637481中所述双特异性融合蛋白，例如包含两个其间具有亲水性螺旋肽接头的scfv和全长恒定区的表达构建体；例如us5837242中所述多价和多特异性结合蛋白，例如具有含ig重链可变区的结合区的第一结构域和含ig轻链可变区的结合区的第二结构域的多肽的二聚体，通常称为双抗体(还涵盖针对双特异性、三特异性或四特异性分子创造的高级结构)；例如us5837821中所述连接在一起的vl和vh链进一步以肽间隔区连接至抗体铰链区和ch3区的微型抗体构建，其可以二聚化形成双特异性/多价分子；以任一取向用短肽接头(例如5或10个氨基酸)或完全无接头连接的vh和vl结构域，其可以形成二聚体来形成双特异性双抗体；例如us5844094中所述的三聚体和四聚体；例如us5864019中所述在c端通过肽键与可交联基团连接的vh结构域(或家族成员中的vl结构域)串进一步与vl结构域结合形成一系列fv(或scfv)；及如例如us5869620中所述，使用scfv或双抗体类型的型式，将含有通过肽接头连接的vh和vl结构域二者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合为多价结构以形成例如同二价、异二价、三价和四价结构。其他示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法可见于例如以下中：us5910573、us5932448、us5959083、us5989830、us6005079、us6239259、us6294353、us6333396、us6476198、us6511663、us6670453、us6743896、us6809185、us6833441、us7129330、us7183076、us7521056、us7527787、us7534866、us7612181、us2002004587a1、us2002076406a1、us2002103345a1、us2003207346a1、us2003211078a1、us2004219643a1、us2004220388a1、us2004242847a1、us2005003403a1、us2005004352a1、us2005069552a1、us2005079170a1、us2005100543a1、us2005136049a1、us2005136051a1、us2005163782a1、us2005266425a1、us2006083747a1、us2006120960a1、us2006204493a1、us2006263367a1、us2007004909a1、us2007087381a1、us2007128150a1、us2007141049a1、us2007154901a1、us2007274985a1、us2008050370a1、us2008069820a1、us2008152645a1、us2008171855a1、us2008241884a1、us2008254512a1、us2008260738a1、us2009130106a1、us2009148905a1、us2009155275a1、us2009162359a1、us2009162360a1、us2009175851a1、us2009175867a1、us2009232811a1、us2009234105a1、us2009263392a1、us2009274649a1、ep346087a2、wo0006605a2、wo02072635a2、wo04081051a1、wo06020258a2、wo2007044887a2、wo2007095338a2、wo2007137760a2、wo2008119353a1、wo2009021754a2、wo2009068630a1、wo9103493a1、wo9323537a1、wo9409131a1、wo9412625a2、wo9509917a1、wo9637621a2、wo9964460a1。上文引用的申请的内容在此以其整体引入作为参考。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scfv)内，vh可以在vl的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scfv)按其vh(vh1)在其vl(vl1)上游排列，下游抗体或抗体片段(例如scfv)按其vl(vl2)在其vh(vh2)上游排列，使得整个双特异性抗体分子具有排列vh1-vl1-vl2-vh2。在其他实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scfv)按其vl(vl1)在其vh(vh1)上游排列，下游抗体或抗体片段(例如scfv)按其vh(vh2)在其vl(vl2)上游排列，使得整个双特异性抗体分子具有排列vl1-vh1-vh2-vl2。可选地，将接头放置在两个抗体或抗体片段(例如scfv)之间，例如，如果构建体排列为vh1-vl1-vl2-vh2，则放置在vl1和vl2之间，或者如果构建体排列为vl1-vh1-vh2-vl2，则放置在vh1和vh2之间。接头可以是本文所述接头，例如(gly4-ser)n接头，其中n为1、2、3、4、5或6，优选4(seqidno:72)。通常，两个scfv之间的接头应足够长，以避免两个scfv的结构域之间的错配。可选地，将接头放置在第一scfv的vl和vh之间。可选地，将接头放置在第二scfv的vl和vh之间。在具有多个接头的构建体中，任意两个或多个接头可以相同或不同。因此，在一些实施方案中，双特异性car包含按本文所述排列的vl、vh和可选的一个或多个接头。
稳定性和突变
可以参考常规对照scfv分子或全长抗体的生物物理特性(例如热稳定性)评价本文所述抗癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv分子(例如可溶性scfv))的稳定性。在一个实施方案中，人源化scfv在所述测定中具有比对照结合分子(例如常规scfv分子)高约0.1℃、约0.25℃、约0.5℃、约0.75℃、约1℃、约1.25℃、约1.5℃、约1.75℃、约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃、约6℃、约6.5℃、约7℃、约7.5℃、约8℃、约8.5℃、约9℃、约9.5℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃或约15℃的热稳定性。
本文所述抗癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)提高的热稳定性随后赋予整个car构建体，导致car构建体的治疗特性改善。与常规抗体相比，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的热稳定性可以提高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体相比，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)具有提高1℃的热稳定性。在另一实施方案中，与常规抗体相比，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)具有提高2℃的热稳定性。在另一实施方案中，与常规抗体相比，该scfv具有提高4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15℃的热稳定性。比较可以在本文公开的scfv分子和衍生该scfvvh和vl的抗体的scfv分子或fab片段之间进行。热稳定性可以用本领域已知的方法测量。例如，在一个实施方案中，可以测量tm。下文更详细地描述用于测量tm的方法和测定蛋白质稳定性的其他方法。
scfv中的突变(通过可溶性scfv的人源化或定向诱变产生)可以改变scfv的稳定性，并提高scfv和car构建体的总体稳定性。用诸如tm、变性温度和聚集温度的测量结果将人源化scfv的稳定性与鼠scfv比较。
突变体scfv的结合能力可以用本领域已知和本文中描述的测定来测定。
在一个实施方案中，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)包含至少一个产生自人源化过程的突变，使得突变的scfv赋予car构建体提高的稳定性。在另一实施方案中，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个产生自人源化过程的突变，使得突变的scfv赋予car构建体提高的稳定性。
评价蛋白质稳定性的方法
可以用例如下文所述方法评估抗原结合结构域的稳定性。这类方法允许测定多个热解折叠转换，其中最不稳定的结构域先解折叠或限制共同解折叠的多结构域单位(例如显示单个解折叠转换的多结构域蛋白质)的总体稳定性阈值。可以以许多其他方式鉴定最不稳定的结构域。可以进行诱变来探测哪个结构域限制总体稳定性。此外，可以通过dsc或其他分光法在已知最不稳定的结构域固有地解折叠的条件下进行多结构域蛋白质的蛋白酶抗性(fontana等,(1997)fold.des.,2:r17-26；dimasi等(2009)j.mol.biol.393:672-692)。一旦鉴定出最不稳定的结构域，即可以用编码此结构域(或其部分)的序列作为该方法中的测试序列。
a)热稳定性
可以用本领域已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术分析组合物的热稳定性。在某些实施方案中，通过分析光谱学来评价热稳定性。
示例性分析光谱学方法是差示扫描量热法(dsc)。dsc利用对伴随大多数蛋白质或蛋白质结构域解折叠的热吸收敏感的量热计(参见例如sanchez-ruiz等,biochemistry,27:1648-52,1988)。为了测定蛋白质的热稳定性，将蛋白质样品插入量热计，提高温度，直至fab或scfv解折叠。蛋白质解折叠的温度是总体蛋白质稳定性的指示。
另一示例性分析光谱学方法是圆二色性(cd)光谱学。cd光谱学将组合物的光活性测量为逐渐提高的温度的函数。圆二色性(cd)光谱学测量由于结构不对称而产生的左旋偏振光和右旋偏振光的光吸收的差异。紊乱或解折叠结构产生与有序或折叠结构的cd光谱非常不同的cd光谱。cd光谱反映了蛋白质对逐渐提高的温度的变性效应的敏感性，因此是蛋白质热稳定性的指示(参见vanmierlo和steemsma,j.biotechnol.,79(3):281-98,2000)。
用于测量热稳定性的另一示例性分析光谱学方法是荧光发射光谱学(参见vanmierlo等steemsma,上文)。用于测量热稳定性的另一示例性分析光谱学方法是核磁共振(nmr)光谱学(参见例如vanmierlo和steemsma,上文)。
组合物的热稳定性可以通过生物化学方法测量。用于评估人稳定性的示例性生物化学方法是热挑战测定。在“热挑战测定”中，使组合物经受一系列提高的温度设定的时间。例如，在一个实施方案中，使测试scfv分子或包含scfv分子的分子经受一系列逐渐提高的温度例如1-1.5小时。然后通过相关生物学学测定来测定蛋白质的活性。例如，如果蛋白质是结合蛋白质(例如scfv或包含scfv的多肽)，则可以通过功能性或定量elisa测定该结合蛋白质的结合活性。
这种测定可以用大肠杆菌和高通量筛选以高通量型式和实施例中公开的那些进行。可以用本领域已知的方法创建例如包含抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv变体)的抗原结合结构域的文库，可诱导表达，并使例如抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)经受热挑战。可测定经挑战的测试样品的结合，可放大并进一步表征那些稳定的抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域。
通过用任意上述技术(例如分析光谱学技术)测量组合物的熔解温度(tm)来评价热稳定性。熔解温度是热转换中点处的温度，其中组合物的50％分子处于折叠状态(参见例如dimasi等(2009)j.molbiol.393:672-692)。在一个实施方案中，抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv变体)的tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，igg的tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，多价抗体的tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。
还用分析量热技术(例如dsc)通过测量组合物的比热或热容(cp)来评价热稳定性。组合物的比热是使1mol水的温度提高1℃所需的能量(例如按kcal/mol计)。大的cp是变性或无活性蛋白质组合物的标志。通过在其热转换之前和之后测定组合物的比热来测量组合物的热容(δcp)变化。还可以通过测量或测定包括gibbs解折叠自由能(δg)、解折叠焓(δh)或解折叠熵(δs)的其他热动力学稳定性参数来评价热稳定性。用一种或多种上述生物化学测定(例如热挑战测定)来测定50％组合物保持其活性(例如结合活性)的温度(即tc值)。
此外，可以进行本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的突变，以与本文所述癌症相关抗原的未突变抗原结合结构域(例如scfv)相比，改变本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的热稳定性。在将本文所述癌症相关抗原的人源化抗原结合结构域(例如scfv)掺入car构建体时，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如人源化scfv)赋予本发明的整体car热稳定性。在一个实施方案中，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)包含赋予本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)热稳定性的单突变。在另一实施方案中，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)包含赋予本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)热稳定性的多突变。在一个实施方案中，本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)中的多突变对本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的热稳定性具有累加效应。
b)％聚集
组合物的稳定性可以通过测量其聚集倾向来测定。聚集可以通过许多非限制性生物化学或生物物理技术来测量。例如，可以用层析(例如大小排阻层析(sec))评价组合物的聚集。sec根据大小分离分子。用允许离子和小分子进入其内部但不允许大的离子和分子进入的聚合物凝胶半固体小球装柱。在将蛋白质组合物加至柱顶时，紧密折叠的蛋白质(即非聚集蛋白质)通过比大的蛋白质聚集体可获得的溶剂体积大的溶剂体积分布(distribute)。因此，大的聚集体更快地移动通过柱，这样，可将混合物分开或分级分离为其组分。每个级分可以在它从凝胶洗脱时分开定量(例如通过光散射)。因此，可通过将级分的浓度与加至凝胶的蛋白质的总浓度相比较来测定组合物的％聚集。稳定的组合物基本作为单级分从柱洗脱，在洗脱图谱或层析图中基本表现为单峰。
c)结合亲和力
组合物的稳定性可以通过测定其靶标结合亲和力来评估。本领域已知多种用于测定结合亲和力的方法。用于测定结合亲和力的示例性方法利用表面等离振子共振。表面等离振子共振是一种光学现象，其允许通过例如用biacore系统(pharmaciabiosensorab,uppsala,swedenandpiscataway,n.j.)检测生物传感基质内蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用。进一步的描述参见jonsson,u.等(1993)ann.biol.clin.51:19-26；jonsson,u.,i(1991)biotechniques11:620-627；johnsson,b.等(1995)j.mol.recognit.8:125-131；及johnnson,b.等(1991)anal.biochem.198:268-277。
在一方面，car的抗原结合结构域包含与本文所述抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，且该抗原结合结构域保留所希望得到的本文所述抗原结合结构域的功能特性。
在一个具体方面，本发明的car组合物包含抗体片段。在另一方面，该抗体片段包含scfv。
在多个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如vh和/或vl)内，例如一个或多个cdr区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个氨基酸来改造car的抗原结合结构域。在一个具体方面，本发明的car组合物包含抗体片段。在另一方面，该抗体片段包含scfv。
本领域普通技术人员将理解，本发明的抗体或抗体片段可进一步修饰，使得它们在氨基酸序列上不同(例如不同于野生型)，但在所希望得到的活性上没有不同。例如，可以对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的附加核苷酸取代。例如，可以用来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替换分子中的非必需氨基酸残基。在另一实施方案中，可以用顺序和/或组成不同的一串结构相似的侧链家族成员替换一串氨基酸，例如，可以进行保守取代，其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。
本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
两个或多个核酸或多肽序列背景中的百分比同一性指两个或多个相同的序列。如用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目检所测量，在为了比较窗或指定区域内的最大对应性而比较和比对时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域内或在未指定时在整个序列内具有60％同一性，可选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则两个序列“基本同一”。可选地，同一性存在于长度至少50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域内，或更优选地，存在于长度100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内。
对于序列比较，通常用一个序列作为参考序列，并将测试序列与之相比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，根据需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定备选参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。用于比较的序列比对方法为本领域公知。用于比较的最佳序列比对可以例如通过smith和waterman,(1970)adv.appl.math.2:482c的局部同源性算法、通过needleman和wunsch,(1970)j.mol.biol.48:443的同源性比对算法、通过pearson和lipman,(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi中的gap、bestfit、fasta和tfasta)、或通过手动比对和目检(参见例如brent等,(2003)currentprotocolsinmolecularbiology)来进行。
适合用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是分别描述于altschul等,(1977)nuc.acidsres.25:3389-3402和altschul等,(1990)j.mol.biol.215:403-410中的blast和blast2.0算法。用于执行blast分析的软件通过nationalcenterforbiotechnologyinformation公开可得。
也可以使用pam120权重余数表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，用整合入align程序(2.0版)的e.meyers和w.miller,(1988)comput.appl.biosci.4:11-17的算法测定两个氨基酸序列的百分比同一性。此外，可以使用blossom62矩阵或pam250矩阵，缺口权重16、14、12、10、8、6或4，长度权重1、2、3、4、5或6，用整合入gcg软件包中的gap程序(可在www.gcg.com上获得)的needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:444-453测定两个氨基酸序列间的百分比同一性。
在一方面，本发明考虑起始抗体或片段(例如scfv)氨基酸序列的产生功能等同的分子的修饰。例如，可以修饰包含在car中的抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的vh或vl，以保留抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如scfv)的起始vh或vl构架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑整个car构建体的修饰，例如car构建体的多个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以产生功能等同的分子。可以修饰car构建体，以保留起始car构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
跨膜结构域
对于跨膜结构域，在多种实施方案中，可以将car设计为包含附着于car的胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包含与跨膜区相邻的一个或多个附加氨基酸，例如与衍生该跨膜蛋白质的蛋白质的胞外区结合的一个或多个氨基酸(例如胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至多15个氨基酸)和/或与衍生该跨膜蛋白质的蛋白质的胞内区结合的一个或多个附加氨基酸(例如胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至多15个氨基酸)。在一方面，该跨膜结构域是与car的其他结构域之一结合的跨膜结构域，例如，在一个实施方案中，该跨膜结构域可以来自与衍生信号发放结构域、共刺激结构域或铰链结构域的蛋白质相同的蛋白质。在另一方面，该跨膜结构域并非源自与衍生car的任何其他结构域的蛋白质相同的蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代来修饰该跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白质的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一方面，该跨膜结构域能够与表达car的细胞的细胞表面上的另一car异二聚化。在不同方面，可以修饰或取代该跨膜结构域的氨基酸序列，以最小化与存在于同一表达car的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或重组来源。在来源为天然来源时，该结构域可以源自任意膜结合或跨膜蛋白质。在一方面，无论何时car结合于靶标，该跨膜结构域都能够发放信号至一个或多个胞内结构域。在本发明中尤其使用的跨膜结构域可以至少包含例如以下的一个或多个跨膜区：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd27、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包含例如以下的一个或多个跨膜区：kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkg2d、nkg2c。
在一些情况下，该跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附着至car的胞外域，例如car的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，该铰链可以是人ig(免疫球蛋白)铰链(例如igg4铰链、igd铰链)、gs接头(例如本文所述gs接头)、kir2ds2铰链或cd8a铰链。在一个实施方案中，该铰链或间隔区包含(例如由其组成)氨基酸序列seqidno:4。在一方面，该跨膜结构域包含(例如由其组成)seqidno:12的跨膜结构域。
在一方面，该铰链或间隔区包含igg4铰链。例如，在一个实施方案中，该铰链或间隔区包含氨基酸序列
no:6)的铰链。在一些实施方案中，该铰链或间隔区包含由核苷酸序列
编码的铰链。
在一方面，该铰链或间隔区包含igd铰链。例如，在一个实施方案中，该铰链或间隔区包含氨基酸序列
wawsvlrvpappspqpatytcvvshedsrtllnasrslevsyvtdh(seqidno:8)的铰链。在一些实施方案中，该铰链或间隔区包含由核苷酸序列
cctctgtcacatgtactctaaatcatcctagcctgcccccacagc
编码的铰链。
在一方面，该跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可见于重组跨膜结构域的每一端。
可选地，长度2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以形成car的跨膜结构域和胞质区之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了尤其适合的接头。例如，在一方面，该接头包含氨基酸序列ggggsggggs(seqidno:10)。在一些实施方案中，该接头由核苷酸序列ggtggcggaggttctggaggtggaggttcc(seqidno:11)编码。
在一方面，该铰链或间隔区包含kir2ds2铰链。
胞质结构域
car的胞质结构域或胞质区包含胞内信号发放结构域。胞内信号发放结构域通常负责激活car所引入的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”指细胞的专化功能。例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子分泌。因此，术语“胞内信号发放结构域”指转导效应子功能信号并指导细胞执行专化功能的蛋白质部分。虽然通常可利用整个胞内信号发放结构域，但在许多情况下没有必要使用整条链。在使用胞内信号发放结构域的截短部分的程度上，可以用这种截短部分替换完整链，只要它转导效应子功能信号。术语胞内信号发放结构域因此意在包括胞内信号发放结构域的足以转导效应子功能信号的截短部分。
用于本发明的car的胞内信号发放结构域的实例包括在抗原受体衔接后协同发挥作用来起始信号转导的t细胞受体(tcr)和共同受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
已知通过tcr单独产生的信号不足以完全激活t细胞，还需要第二和/或共刺激信号。因此，可以说t细胞激活由两类不同的胞质信号发放序列介导：通过tcr起始抗原依赖性主激活的那些(主胞内信号发放结构域)和以不依赖抗原的方式发挥作用来提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质结构域，例如共刺激结构域)。
主信号发放结构域以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的主激活。以刺激方式发挥作用的主胞内信号发放结构域可以包含称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号发放基序。
尤其用于本发明的包含itam的主胞内信号发放结构域的实例包括cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12的那些。在一个实施方案中，本发明的car包含胞内信号发放结构域，例如cd3ζ的主信号发放结构域。
在一个实施方案中，主信号发放结构域包含经修饰的itam结构域，例如与天然itam结构域相比具有改变(例如提高或降低)的活性的突变itam结构域。在一个实施方案中，主信号发放结构域包含含有经修饰的itam的主胞内信号发放结构域，例如含有优化和/或截短的itam的主胞内信号发放结构域。在一个实施方案中，主信号发放结构域包含一个、两个、三个、四个或多个tiam基序。
car的胞内信号发放结构域可以包含cd3ζ信号发放结构域本身，或者可将它与任何其他希望得到的一个或多个胞内信号发放结构域组合用于本发明的car的背景中。例如，car的胞内信号发放结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激信号发放结构域。共刺激信号发放结构域指car的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效反应所需的除抗原受体或其配体之外的表面分子。这类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体等。例如，已证明cd27共刺激在体外增强人cart细胞的扩增、效应子功能和存活，在体内增强人t细胞的持续存在和抗肿瘤活性(song等blood.2012；119(3):696-706)。这类共刺激分子的其他实例包括cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、nkg2d、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp和cd19a。
本发明的car的胞质部分内的胞内信号发放序列可以按随机或指定的顺序相互连接。可选地，长度例如2至10个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以形成胞内信号发放序列之间的连接。在一个实施方案中，可以用甘氨酸-丝氨酸双联体作为适宜的接头。在一个实施方案中，可以用单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)作为适宜的接头。
在一方面，将胞内信号发放结构域设计为包含两个或多个(例如2、3、4、5或更多个)共刺激信号发放结构域。在一个实施方案中，该两个或多个(例如2、3、4、5或更多个)共刺激信号发放结构域由接头分子(例如本文所述接头分子)分隔开。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域包含两个共刺激信号发放结构域。在一些实施方案中，该接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，该接头是丙氨酸残基。
在一方面，将胞内信号发放结构域设计为包含cd3ζ的信号发放结构域和cd28的信号发放结构域。在一方面，将胞内信号发放结构域设计为包含cd3ζ的信号发放结构域和4-1bb的信号发放结构域。在一方面，4-1bb的信号发放结构域是seqidno:14的信号发放结构域。在一方面，cd3ζ的信号发放结构域是seqidno:18的信号发放结构域。
在一方面，将胞内信号发放结构域设计为包含cd3ζ的信号发放结构域和cd27的信号发放结构域。在一方面，cd27的信号发放结构域包含氨基酸序列qrrkyrsnkgespvepaepcryscpreeegstipiqedyrkpepacsp(seqidno:16)。在一方面，cd27的信号发放结构域由核酸序列aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc(seqidno:17)编码。
在一方面，本文所述表达car的细胞可进一步包含第二car，例如包含例如抗同一靶标或不同靶标(例如本文所述癌症相关抗原之外的靶标或不同的本文所述癌症相关抗原)的不同抗原结合结构域的第二car。在一个实施方案中，该第二car包含抗与癌症相关抗原表达在同一癌细胞类型上的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，该表达car的细胞包含靶向第一抗原且含有具有共刺激信号发放结构域但不具有主信号发放结构域的胞内信号发放结构域的第一car，及靶向第二不同抗原且含有具有主信号发放结构域但不具有共刺激信号发放结构域的胞内信号发放结构域的第二car。不希望受限于理论，将共刺激信号发放结构域(例如4-1bb、cd28、cd27或ox-40)放置在第一car上和将主信号发放结构域(例如cd3ζ)放置在第二car上可以限制car对表达两种靶标的细胞的活性。在一个实施方案中，表达car的细胞包含含有结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的第一癌症相关抗原car，及靶向不同靶抗原(例如与第一靶抗原表达在相同癌细胞类型上的抗原)且含有抗原结合结构域、跨膜结构域和主信号发放结构域的第二car。在另一实施方案中，表达car的细胞包含含有结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和主信号发放结构域的第一car，及靶向除第一靶抗原之外的抗原(例如与第一靶抗原表达在相同癌细胞类型上的抗原)且含有抗该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号发放结构域的第二car。
在一个实施方案中，表达car的细胞包含本文所述xcar和抑制性car。在一个实施方案中，该抑制性car包含结合见于正常细胞(例如也表达cll的正常细胞)上但不见于癌细胞上的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，该抑制性car包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性car的胞内结构域可以是pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4或tgfβ的胞内结构域。
在一个实施方案中，在表达car的细胞包含两个或多个不同car时，该不同car的抗原结合结构域可以是这样，使得抗原结合结构域不与彼此相互作用。例如，表达第一和第二car的细胞可以具有不与第二car的抗原结合结构域(例如，第二car的抗原结合结构域是vhh)形成结合的第一car的抗原结合结构域(例如作为片段，例如scfv)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(sdab)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规四链抗体的单个结构域、改造的结构域和除源自抗体的那些之外的单结构域支架。sdab分子可以是任意现有的或任意以后的单结构域分子。sdab分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。此术语还包括来自除骆驼和鲨鱼之外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一方面，sdab分子可以源自见于鱼中的免疫球蛋白的可变区，例如源自见于鲨鱼血清中的称为新抗原受体(nar)的免疫球蛋白同种型的可变区。wo03/014161等streltsov(2005)proteinsci.14:2901-2909中描述了产生源自nar(“ignar”)的可变区的单结构域分子的方法。
根据另一方面，sdab分子是称为缺乏轻链的重链的天然存在的单结构域抗原结合分子。这类单结构域分子公开于例如wo9404678和hamers-casterman,c.等(1993)nature363:446-448中。为了清晰性的原因，本文中将源自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域称为vhh或纳米抗体，以将它与四链免疫球蛋白的常规vh区分开。这种vhh分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、羊驼、单峰驼、羊驼和大羊驼中的物种。除骆驼科外的其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子；这类vhh在本发明的范围之内。
sdab分子可以是重组的、cdr移植的、人源化的、骆驼源化的、去免疫化的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还已发现，可以不希望得到具有多个包含在受体的抗原结合结构域间相互作用的抗原结合结构域的嵌合膜包埋(embed)受体的细胞，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其关联抗原的能力。因此，本文公开的是具有包含最小化这类相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受体的细胞。本文还公开编码包含最小化这类相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受体的核酸，以及这类细胞和核酸的制备和和使用方法。在一个实施方案中，该第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受体之一的抗原结合结构域包含scfv，另一个的抗原结合结构域包含单vhh结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单vh结构域，或源自人或小鼠序列的单vh结构域。
在一些实施方案中，所要求发明包含第一和第二car，其中该第一和第二car之一不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域是scfv，另一个的抗原结合结构域不是scfv。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含单vh结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单vh结构域或源自人或小鼠序列的单vh结构域。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含骆驼vhh结构域。
在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含scfv，另一个的抗原结合结构域包含单vh结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单vh结构域或源自人或小鼠序列的单vh结构域。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含scfv，另一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，该第一和第二car之一的抗原结合结构域包含scfv，另一个的抗原结合结构域包含骆驼vhh结构域。
在一些实施方案中，在存在于细胞表面上时，该第一car的抗原结合结构域与其关联抗原的结合未因存在该第二car而实质性减少。在一些实施方案中，该第二car存在下该第一car的抗原结合结构域与其关联抗原的结合是缺乏该第二car情况下该第一car的抗原结合结构域与其关联抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，在存在于细胞表面上时，该第一和第二car的抗原结合结构域与彼此的结合少于两个抗原结合结构域都是scfv抗原结合结构域时的结合。在一些实施方案中，该第一和第二car的抗原结合结构域与彼此的结合少于两个抗原结合结构域都是scfv抗原结合结构域时的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一方面，本文所述表达car的细胞可进一步表达另一活性剂(agent)，例如增强表达car的细胞的活性的活性剂。例如，在一个实施方案中，该活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如pd1)可以降低表达car的细胞引起免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂例如是本文所述分子，例如包含与为细胞提供阳性(positive)信号的第二多肽(例如本文所述胞内信号发放结构域)结合的第一多肽(例如抑制性分子)的活性剂。在一个实施方案中，该活性剂包含例如抑制性分子(如pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ、或这些中任一个的片段(例如这些中任一个的至少一部分胞外结构域))的第一多肽，及是本文所述胞内信号发放结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，例如本文所述的41bb、cd27或cd28)和/或主信号发放结构域(例如本文所述cd3ζ信号发放结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该活性剂包含pd1或其片段(例如pd1的至少一部分胞外结构域)的第一多肽，及本文所述胞内信号发放结构域(例如本文所述cd28信号发放结构域和/或本文所述cd3ζ信号发放结构域)的第二多肽。pd1是还包括cd28、ctla-4、icos和btla的cd28家族受体的抑制性成员。pd1表达在活化的b细胞、t细胞和骨髓细胞上(agata等1996int.immunol8:765-75)。已显示pd1的两个配体pd-l1和pd-l2在结合pd1时下调t细胞活化(freeman等2000jexpmed192:1027-34；latchman等2001natimmunol2:261-8；carter等2002eurjimmunol32:634-43)。pd-l1在人癌症中丰度高(dong等2003jmolmed81:281-7；blank等2005cancerimmunol.immunother54:307-314；konishi等2004clincancerres10:5094)。可通过抑制pd1与pd-l1的局部相互作用来逆转免疫抑制。
在一个实施方案中，该活性剂包含抑制性分子(例如程序性死亡1(pd1))的胞外结构域(ecd)，该胞外结构域与跨膜结构域和胞内信号发放结构域(如41bb和cd3ζ)融合(本文中也称为pd1car)。在一个实施方案中，在与本文所述xcar组合使用时，该pd1car改善t细胞的持续存在。在一个实施方案中，该car是包含如seqidno:26中下划线所示的pd1胞外结构域的pd1car。在一个实施方案中，该pd1car包含氨基酸序列seqidno:26。
在一个实施方案中，该pd1car包含下文提供的氨基酸序列(seqidno:39)。
在一个实施方案中，该活性剂包含编码pd1car(例如本文所述pd1car)的核酸序列。在一个实施方案中，pd1car的核酸序列如下文所示，pd1ecd在下文seqidno:27中下划线。
在另一方面，本发明提供表达car的细胞(例如cart细胞)群体。在一些实施方案中，该表达car的细胞群体包含表达不同car的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，该cart细胞群体可以包含表达具有抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的car的第一细胞，及表达具有不同抗原结合结构域(例如抗不同的本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域，例如抗不同于第一细胞表达的car的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原的本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域)的car的第二细胞。作为另一实例，表达car的细胞群体可以包含表达含有抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的car的第一细胞，及表达含有抗本文所述癌症相关抗原之外的靶标的抗原结合结构域的car的第二细胞。在一个实施方案中，表达car的细胞群体包含例如表达含有主胞内信号发放结构域的car的第一细胞，及表达含有第二信号发放结构域的car的第二细胞。
在另一方面，本发明提供细胞群体，其中该群体中的至少一个细胞表达具有抗本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的car，且第二细胞表达另一活性剂，例如增强表达car的细胞的活性的活性剂。例如，在一个实施方案中，该活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如pd1)可以降低表达car的细胞引起免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂例如是本文所述分子，例如包含与为细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述胞内信号发放结构域)结合的第一多肽(例如抑制性分子)的活性剂。在一个实施方案中，该活性剂包含例如抑制性分子(如pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ、或这些中任一个的片段)的第一多肽，及是本文所述胞内信号发放结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，例如本文所述的41bb、cd27或cd28)和/或主信号发放结构域(例如本文所述cd3ζ信号发放结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该活性剂包含pd-1或其片段的第一多肽，及本文所述胞内信号发放结构域(例如本文所述cd28信号发放结构域和/或本文所述cd3ζ信号发放结构域)的第二多肽。
在一方面，本发明提供方法，其包括与另一活性剂(例如激酶抑制剂，如本文所述激酶抑制剂)组合施用表达car的细胞(例如cart细胞)群体(例如表达不同car的细胞的混合物)。在另一方面，本发明提供方法，其包括与另一活性剂(例如激酶抑制剂，如本文所述激酶抑制剂)组合施用细胞群体，其中该群体中的至少一个细胞表达具有本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的car，且第二细胞表达另一活性剂，例如增强表达car的细胞的活性的活性剂。
可调节型嵌合抗原受体
在一些实施方案中，希望得到其中可以控制car活性的可调节型car(rcar)，以优化car治疗的安全性和有效性。存在许多可调节car活性的方式。例如，可以用诱导性凋亡(使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶(参见例如di等,negnl.j.med.2011nov.3；365(18):1673-1683))作为本发明的car治疗中的安全性开关。在一方面，rcar包含一组多肽(在最简单的实施方案中通常为两条)，其中将本文所述标准car的成分(例如抗原结合结构域和胞内信号发放结构域)分隔在分开的多肽或成员上。在一些实施方案中，该组多肽包含在存在二聚化分子时可使多肽相互偶联(例如可使抗原结合结构域与胞内信号发放结构域偶联)的二聚化开关。
在一方面，rcar包含两个多肽或成员：1)包含胞内信号发放结构域(例如本文所述主胞内信号发放结构域)和第一开关结构域的胞内信号发放成员；2)包含本文所述抗原结合结构域(例如靶向本文所述肿瘤抗原)和第二开关结构域的抗原结合成员。可选地，该rcar包含本文所述跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域可放置在胞内信号发放成员上、抗原结合成员上、或二者上。(除非另有说明，在本文中描述rcar的成员或元件时，顺序可以如所提供，但也包括其他顺序。换言之，在一个实施方案中，顺序如文中所示，但在其他实施方案中，顺序可以不同。例如，跨膜区一侧的元件的顺序可以不同于实例，例如开关结构域相对于胞内信号发放结构域的放置可以不同，例如相反)。
在一个实施方案中，该第一和第二开关结构域可以形成胞内或胞外二聚化开关。在一个实施方案中，该二聚化开关可以是同二聚化开关，例如，其中该第一和第二开关结构域是相同的，或异二聚化开关，例如其中该第一和第二开关结构域相互不同。
在一些实施方案中，rcar可以包含“多开关”。多开关可以包含异二聚化开关结构域或同二聚化开关结构域。多开关独立地包含第一成员(例如抗原结合结构域)和第二成员(例如胞内信号发放成员)上的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)开关结构域。在一个实施方案中，该第一成员可以包含多个第一开关结构域(例如基于fkbp的开关结构域)，该第二成员可以包含多个第二开关结构域(例如基于frb的开关结构域)。在一个实施方案中，该第一成员可以包含第一和第二开关结构域(例如基于fkbp的开关结构域和基于frb的开关结构域)，该第二成员可以包含第一和第二开关结构域(例如基于fkbp的开关结构域和基于frb的开关结构域)。
在一个实施方案中，该胞内信号发放成员包含一个或多个胞内信号发放结构域(例如主胞内信号发放结构域)和一个或多个共刺激信号发放结构域。
在一个实施方案中，该抗原结合成员可以包含一个或多个胞内信号发放结构域，例如一个或多个共刺激信号发放结构域。在一个实施方案中，该抗原结合成员包含例如选自41bb、cd28、cd27、icos和ox40的多个(例如2或3个)本文所述共刺激信号发放结构域，且在一些实施方案中无主胞内信号发放结构域。在一个实施方案中，该抗原结合成员从胞外至胞内方向包含以下共刺激信号发放结构域：41bb-cd27、41bb-cd27、cd27-41bb、41bb-cd28、cd28-41bb、ox40-cd28、cd28-ox40、cd28-41bb、或41bb-cd28。在这类实施方案中，该胞内结合成员包含cd3ζ结构域。在一个这种实施方案中，该rcar包含：(1)含有抗原结合结构域、跨膜结构域和两个共刺激结构域及第一开关结构域的抗原结合成员；和(2)含有跨膜结构域或膜束缚结构域和至少一个主胞内信号发放结构域及第二开关结构域的胞内信号发放结构域。
一个实施方案提供其中抗原结合成员未束缚于car细胞表面的rcar。这允许在不用编码抗原结合成员的序列转化细胞的情况下使具有胞内信号发放成员的细胞方便地与一个或多个抗原结合结构域配对。在这类实施方案中，该rcar包含：1)胞内信号发放成员，其包含第一开关结构域、跨膜结构域、胞内信号发放结构域(例如主胞内信号发放结构域)和第一开关结构域；和2)抗原结合成员，其包含抗原结合结构域和第二开关结构域，其中抗原结合成员不包含跨膜结构域或膜束缚结构域，且可选地不包含胞内信号发放结构域。在一些实施方案中，该rcar可进一步包含：3)第二抗原结合成员，其包含第二抗原结合结构域(例如结合与抗原结合结构域所结合的抗原不同的抗原的第二抗原结合结构域)和第二开关结构域。
本发明还提供其中抗原结合成员包含双特异性激活和靶向能力的rcar。在此实施方案中，该抗原结合结构域可包含多个(例如2、3、4或5个)抗原结合结构域(例如scfv)，其中每个抗原结合结构域结合靶抗原，例如不同抗原或相同抗原，例如同一抗原上的相同或不同的表位。在一个实施方案中，该多个抗原结合结构域串联，可选地在每个抗原结合结构域之间放置接头或铰链区。本文中描述了适宜的接头和铰链区。
一个实施方案提供具有允许开关增殖的构型的rcar。在此实施方案中，该rcar包含：1)胞内信号发放成员，其可选地包含跨膜结构域或膜束缚结构域，例如选自41bb、cd28、cd27、icos和ox40的一个或多个共刺激信号发放结构域，及开关结构域；和2)抗原结合成员，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和主胞内信号发放结构域(例如cd3ζ结构域)，其中抗原结合成员不包含开关结构域，或不包含与胞内信号发放成员上的开关结构域二聚化的开关结构域。在一个实施方案中，该抗原结合成员不包含共刺激信号发放结构域。在一个实施方案中，该胞内信号发放成员包含异二聚化开关的第一开关结构域，该rcar包含含有异二聚化开关的第二开关结构域的第二胞内信号发放成员。在这类实施方案中，该第二胞内信号发放成员包含与胞内信号发放成员相同的胞内信号发放结构域。在一个实施方案中，该二聚化开关是胞内的。在一个实施方案中，该二聚化开关是胞外的。
在本文所述任意rcar构型中，该第一和第二开关结构域包含本文所述基于fkbp-frb的开关。
本文还提供包含本文所述rcar的细胞。改造为表达rcar的任意细胞都可以用作rcar细胞。在一个实施方案中，该rcarx细胞是t细胞，称为rcart细胞。在一个实施方案中，该rcarx细胞是nk细胞，称为rcarn细胞。
本文还提供包含rcar编码序列的核酸和载体。可将编码rcar的多种元件的序列放置在同一核酸分子(例如同一质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体)上。在一个实施方案中，(i)编码抗原结合成员的序列和(ii)编码胞内信号发放成员的序列可以存在于同一核酸(例如载体)上。相应蛋白质的产生可例如通过使用分开的启动子、或通过使用双顺反子转录产物(其可导致通过切割单个翻译产物或通过翻译两个分开的蛋白质产物来产生两种蛋白质)来达到。在一个实施方案中，将编码可切割肽(例如p2a或f2a序列)的序列放置在(i)和(ii)之间。肽切割位点的实例包括以下，其中gsg残基是可选的：
在一个实施方案中，将编码ires(例如emcv或ev71ires)的序列放置在(i)和(ii)之前。在这些实施方案中，(i)和(ii)转录为单个rna。在一个实施方案中，第一启动子与(i)有效连接，第二启动子与(ii)有效连接，使得(i)和(ii)转录为分开的mrna。
备选地，可将编码rcar的多种元件的序列放置在不同核酸分子(例如不同质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体)上。例如，(i)编码抗原结合成员的序列可以存在于第一核酸(例如第一载体)上，(ii)编码胞内信号发放成员的序列可以存在于第二核酸(例如第二载体)上。
二聚化开关
二聚化开关可以是非共价的或共价的。在非共价二聚化开关的情况下，二聚化分子促进开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的共价相互作用。
在一个实施方案中，该rcar包含基于fkbp/frap或fkbp/frb的二聚化开关。fkbp12(fkbp或fk506结合蛋白)是高丰度胞质蛋白质，其是天然产物免疫抑制药物雷帕霉素的初始胞内靶标。雷帕霉素结合fkbp和大pi3k同源物frap(raft、mtor)。frb是frap的93个氨基酸的部分，其足以结合fkbp-雷帕霉素复合物(chen,j.,zheng,x.f.,brown,e.j.&schreiber,s.l.(1995)identificationofan11-kdafkbp12-rapamycin-bindingdomainwithinthe289-kdafkbp12-rapamycin-associatedproteinandcharacterizationofacriticalserineresidue.procnatlacadsciusa92:4947-51)。
在一些实施方案中，基于fkbp/frap(例如fkbp/frb)的开关可以使用二聚化分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
fkbp的氨基酸序列如下：
在一些实施方案中，fkbp开关结构域可以包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与frb或其片段或类似物结合的能力的fkbp片段，例如seqidno:54的下划线部分，其是：
frb的氨基酸序列如下：
本文所用的术语“基于fkbp/frap(例如fkbp/frb)的开关”指二聚化开关，其包含：第一开关结构域，其包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如rad001)存在下与frb或其片段或类似物结合的能力的fkbp片段或其类似物，且与seqidno:54或55的fkbp序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性，或因不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基而不同于seqidno:54或55的fkbp序列；及第二开关结构域，其包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与frb或其片段或类似物结合的能力的frb片段或其类似物，且与seqidno:56的frb序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性，或因不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基而不同于seqidno:56的frb序列。在一个实施方案中，本文所述rcar包含一个含有seqidno:54(或seqidno:55)中公开的氨基酸残基的开关结构域和一个含有seqidno:56中公开的氨基酸残基的开关结构域。
在一些实施方案中，fkbp/frb二聚化开关包含经修饰的frb开关结构域，其显示改变(例如增强)的基于frb的开关结构域(例如经修饰的frb开关结构域、基于fkbp的开关结构域)和二聚化分子(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如rad001)之间的复合物形成。在一个实施方案中，经修饰的frb开关结构域包含一个或多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变，其选自氨基酸位置l2031、e2032、s2035、r2036、f2039、g2040、t2098、w2101、d2102、y2105和f2108处的突变，其中将野生型氨基酸突变为任意天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，突变体frb在e2032处包含突变，其中将e2032突变为苯丙氨酸(e2032f)、甲硫氨酸(e2032m)、精氨酸(e2032r)、缬氨酸(e2032v)、酪氨酸(e2032y)、异亮氨酸(e2032i)(例如seqidno:57)或亮氨酸(e2032l)(例如seqidno:58)。在一个实施方案中，突变体frb在t2098处包含突变，其中将t2098突变为苯丙氨酸(t2098f)或亮氨酸(t2098l)(例如seqidno:59)。在一个实施方案中，突变体frb在e2032和t2098处包含突变，其中将e2032突变为任意氨基酸，其中将t2098突变为任意氨基酸(例如seqidno:60)。在一个实施方案中，突变体frb包含e2032i和t2098l突变(例如seqidno:61)。在一个实施方案中，突变体frb包含e2032l和t2098l突变(例如seqidno:62)。
表10.对二聚化分子具有提高的亲和力的示例性突变体frb
其他适宜的二聚化开关包括基于gyrb-gyrb的二聚化开关、基于赤霉素的二聚化开关、标记/结合剂二聚化开关和halo标记/snap标记二聚化开关。按照本文提供的指导，这类开关和相关二聚化分子对本领域普通技术人员而言显而易见。
二聚化分子
通过二聚化分子来促进开关结构域之间的结合。在二聚化分子存在下，开关结构域间的相互作用或结合允许与第一开关结构域结合(例如融合)的多肽和与第二开关结构域结合(例如融合)的多肽之前的信号转导。例如在本文所述系统中测量，在非限制性水平的二聚化分子存在下，信号转导提高了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。
可以用雷帕霉素和雷帕霉素类似物(有时称为雷帕霉素类似物(rapalogue))(例如rad001)作为本文所述基于fkbp/frb的二聚化开关中的二聚化分子。在一个实施方案中，该二聚化分子可以选自雷帕霉素(sirolimus)、rad001(everolimus)、zotarolimus、temsirolimus、ap-23573(ridaforolimus)、biolimus和ap21967。适合用于基于fkbp/frb的二聚化开关的其他雷帕霉素类似物进一步描述于标题为“联合治疗”的章节中，或标题为“示例性mtor抑制剂”的子章节中。
分裂car
在一些实施方案中，表达car的细胞使用分裂car。分裂car方法更详细地描述于公开wo2014/055442和wo2014/055657中。简言之，分裂car系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41bb)的第一car的细胞，且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号发放结构域(例如cd3ζ)的第二car。在细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域激活，细胞增殖。在细胞遇到第二抗原时，胞内信号发放结构域激活，细胞杀伤活性开始。因此，表达car的细胞仅在存在两种抗原时完全激活。
rna转染
本文公开用于产生体外转录的rnacar的方法。本发明还包括可直接转染入细胞的编码rna构建体的car。用于产生用于转染的mrna的方法可涉及用特别设计的引物体外转录(ivt)模板，然后添加polya(聚a)，以产生包含3’和5’非翻译序列、5’帽和/或内部核糖体进入位点(ires)、待表达的核酸和长度通常为50-200个碱基的polya尾(seqidno:32)的构建体。这样产生的rna可以有效转染不同类型的细胞。在一方面，该模板包含car的序列。
在一个实施方案中，本发明的car由信使rna(mrna)编码。在一方面，将编码本文所述car的mrna引入免疫效应细胞，例如t细胞或nk细胞，以产生表达car的细胞，例如cart细胞或carnk细胞。
在一个实施方案中，体外转录的rna可作为瞬时转染的型式引入细胞。用聚合酶链反应(pcr)产生的模板通过体外转录产生rna。来自任意来源的目的dna可通过pcr直接转化为用于用适当引物和rna聚合酶进行体外mrna合成的模板。dna的来源可以是例如基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、合成dna序列或任意其他适当来源的dna。希望得到的用于体外转录的模板是本文所述car。例如，用于rnacar的模板包含含有抗本文所述肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域的胞外区、铰链区(例如本文所述铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述跨膜结构域，如cd8a的跨膜结构域)、及含有胞内信号发放结构域(例如本文所述胞内信号发放结构域，例如包含cd3ζ的信号发放结构域和4-1bb的信号发放结构域)的胞质区。
在一个实施方案中，待用于pcr的dna包含可读框。该dna可以来自源自生物体基因组的天然存在的dna序列。在一个实施方案中，该核酸可以包含一些或全部5’和/或3’非翻译区(utr)。该核酸可以包含外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于pcr的dna是人核酸序列。在另一实施方案中，待用于pcr的dna是包含5’和3’utr的人核酸序列。该dna可以备选地是通常不在天然存在的生物中表达的人工dna序列。示例性人工dna序列是包含连接在一起形成编码融合蛋白质的可读框的基因部分的dna序列。连接在一起的dna部分可以来自单种生物或来自一种以上生物。
用pcr来产生用于体外转录用于转染的mrna的模板。用于进行pcr的方法为本领域公知。将用于pcr的引物设计为具有与待用作pcr模板的dna的区域基本互补的区域。本文所用的“基本互补”指核苷酸的序列，其中引物序列中的大多数或全部碱基互补，或一个或多个碱基不互补或错配。基本互补的序列能够在用于pcr的退火条件下与预期dna靶标退火或杂交。可将引物设计为与dna模板的任意部分基本互补。例如，可将引物设计为扩增核酸的通常在细胞中转录的部分(可读框)，包括5’和3’utr。还可将引物设计为扩增核酸的编码特定目的结构域的部分。在一个实施方案中，将引物设计为扩增人cdna的编码区，包括全部或部分5’和3’utr。用于pcr的引物可通过本领域公知的合成方法产生。“正向引物”是包含与dna模板上处于待扩增dna序列上游的核苷酸基本互补的核苷酸区域的引物。本文中用“上游”来指相对于编码链处于待扩增dna序列5’的位置。“反向引物”是包含与待扩增dna序列下游的双链dna模板基本互补的核苷酸区域的引物。本文中用“下游”来指相对于编码链处于待扩增dna序列3’的位置。
任何用于pcr的聚合酶都可以用于本文公开的方法。试剂和聚合酶可从许多来源购得。
可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。rna优选具有5’和3’utr。在一个实施方案中，5’utr长度在1至3000个核苷酸之间。可通过不同方法改变待添加至编码区的5’和3’utr的长度，包括但不限于设计退火至utr的不同区域的pcr引物。使用此方法，本领域普通技术人员可以修饰在转染所转录的rna后达到最佳翻译效率所需的5’和3’utr长度。
5’和3’utr可以是目的核酸的天然存在的内源5’和3’utr。备选地，可通过将utr序列掺入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰来添加对目的核酸而言不为内源的utr序列。对目的核酸而言不为内源的utr序列的使用可用于改变rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’utr序列中富含au的元件可降低mrna的稳定性。因此，可根据本领域公知的utr的特性，选择或设计3’utr来提高所转录的rna的稳定性。
在一个实施方案中，5’utr可以包含内源核酸的kozak序列。备选地，在通过上文所述pcr添加对目的核酸而言不为内源的5’utr时，可通过添加5’utr序列来重新设计共有kozak序列。kozak序列可以提高一些rna转录物的翻译效率，但似乎并非为所有rna能够有效翻译所需。许多mrna对kozak序列的需要为本领域已知。在其他实施方案中，5’utr可以是其rna基因组在细胞中稳定的rna病毒的5’utr。在其他实施方案中，可以在3’或5’utr中使用多种核苷酸类似物，以阻止mrna的外切核酸酶降解。
为了能够从dna模板合成rna而无需进行基因克隆，应将转录启动子附着至待转录序列上游的dna模板。在将作为rna聚合酶的启动子发挥作用的序列添加至正向引物的5’端时，rna聚合酶启动子在待转录可读框上游掺入pcr产物。在一个优选实施方案中，该启动子是本文中其他地方所述的t7聚合酶启动子。其他有用的启动子包括但不限于t3和sp6rna聚合酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列为本领域已知。
在优选实施方案中，mrna具有决定核糖体结合、翻译起始和mrna在细胞中的稳定性的5’端帽和3’poly(a)尾二者。在环状dna模板(例如质粒dna)上，rna聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长多联体产物。在3’utr端线性化的质粒dna的转录产生正常大小的mrna，即使在转录后聚腺苷酸化，该mrna在真核生物转染中也无效。
在线性dna模板上，噬菌体t7rna聚合酶可使转录物3’端延伸至模板的最后一个碱基之外(schenborn和mierendorf,nucacidsres.,13:6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003)。
将polya/t序列整合入dna模板的常规方法是分子克隆。但是，polya/t序列整合入质粒dna可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒dna模板常受缺失和其他畸变的高度污染。这使得克隆方法不仅费力和耗时，而且常不可靠。这就是为什么高度希望得到允许在不可隆的情况下构建具有polya/t3’序列的dna模板。
转录dna模板的polya/t区段可以通过使用含有polyt尾(如100t尾(seqidno:35)(大小可以是50-5000t(seqidno:36)))的反向引物在pcr期间或通过包括但不限于dna连接或体外重组的任意其他方法在pcr后产生。poly(a)尾也为rna提供稳定性，减少其降解。通常，poly(a)尾的长度与所转录的rna的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(a)尾为100至5000个腺苷之间(seqidno:37)。
rna的poly(a)尾可在体外转录后用poly(a)聚合酶(如大肠杆菌polya聚合酶(e-pap))进一步延长。在一个实施方案中，poly(a)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸(seqidno:38)导致rna的翻译效率提高约两倍。此外，将不同化学基团附着至3’端可提高mrna稳定性。这种附着可包含修饰/人工核苷酸、适体和其他化合物。例如，可用poly(a)聚合酶将atp类似物掺入poly(a)尾。atp类似物可进一步提高rna的稳定性。
5’帽也为rna分子提供稳定性。在优选实施方案中，通过本文公开的方法产生的rna包含5’帽。用本领域已知和本文中所述的技术(cougot等,trendsinbiochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski等,rna,7:1468-95(2001)；elango等,biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))提供5’帽。
通过本文公开的方法产生的rna还可以包含内部核糖体进入位点(ires)序列。ires序列可以是任意病毒序列、染色体序列或人工设计序列，其起始不依赖于帽的核糖体与mrna的结合，且便于翻译的起始。可以包括任何适合用于电穿孔的溶质，其可以包含便于细胞通透性和活率的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
rna可用许多不同方法中的任一种引入靶细胞，例如市售方法，其包括但不限于电穿孔(amaxanucleofector-ii(amaxabiosystems,cologne,德国))、(ecm830(btx)(harvardinstruments,boston,mass.)或genepulserii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,德国汉堡)、使用lipofection的阳离子脂质体介导转染、聚合物包封、肽介导转染、或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见例如nishikawa等humgenether.,12(8):861-70(2001)。
非病毒递送方法
在一些方面，可以用非病毒方法将编码本文所述car的核酸递送入细胞或组织或个体。
在一些实施方案中，该非病毒方法包括使用转座子(也称为可转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可将其自身插入在基因组中的位置的一段dna，例如能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一段dna，或可从更长的核酸中剪接出来并插入基因组中的另一位置的一段dna。例如，转座子包含由转座基因侧翼反向重复构成的dna序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括sleepingbeauty转座子系统(sbts)和piggybac(pb)转座子系统。参见例如aronovich等hum.mol.genet.20.r1(2011):r14-20；singh等cancerres.15(2008):2961-2971；huang等mol.ther.16(2008):580-589；grabundzija等mol.ther.18(2010):1200-1209；kebriaei等blood.122.21(2013):166；williams.moleculartherapy16.9(2008):1515-16；bell等nat.protoc.2.12(2007):3153-65；和ding等cell.122.3(2005):473-83，其全都在此引入作为参考。
sbts包含两个成分：1)含有转基因的转座子；和2)转座酶的来源。转座酶可以使转座子从载体质粒(或其他供体dna)转座至靶dna，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶结合载体质粒/供体dna，从质粒中切出转座子(包括转基因)，并将它插入宿主细胞的基因组。参见例如aronovich等上文。
示例性转座子包括基于pt2的转座子。参见例如grabundzija等nucleicacidsres.41.3(2013):1829-47；和singh等cancerres.68.8(2008):2961-2971，其全都在此引入作为参考。示例性转座酶包括tc1/水手(mariner)元件型转座酶，例如sb10转座酶或sb11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的高活性转座酶)。参见例如aronovich等、kebriaei等和grabundzija等，其全都在此引入作为参考。
sbts的使用允许有效整合和表达转基因，例如编码本文所述car的核酸。本文提供例如用诸如sbts的转座子系统产生稳定表达本文所述car的细胞(例如t细胞或nk细胞)的方法。
按照本文所述的方法，在一些实施方案中，将包含sbts成分的一个或多个核酸(例如质粒)地送至细胞(例如t或nk细胞)。例如，通过标准核酸(例如质粒dna)递送方法(例如本文所述方法，例如电穿孔、转染或脂质转染)递送核酸。在一些实施方案中，该核酸包含含有转基因(例如编码本文所述car的核酸)的转座子。在一些实施方案中，该核酸包含含有转基因(例如编码本文所述car的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施方案中，提供具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒包含含有转基因的转座子，第二质粒包含编码转座酶的核酸序列。例如，将该第一和第二核酸共同递送入宿主细胞。
在一些实施方案中，通过使用sbts的基因插入和使用核酸酶(例如锌指核酸酶(zfn))、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、crispr/cas系统或改造的大范围核酸酶重新改造的归巢内切核酸酶的基因编辑的组合来产生表达本文所述car的细胞(例如t或nk细胞)。
在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许重编程细胞(例如t或nk细胞)，并将该细胞直接输注入个体。非病毒载体的优势包括但不限于产生满足患者群体所需的足够量的容易性和相对低的成本、保存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
编码car的核酸构建体
本发明还提供编码本文所述一种或多种car构建体的核酸分子。在一方面，该核酸分子作为信使rna转录物提供。在一方面，该核酸分子作为dna构建体提供。
因此，在一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(car)的核酸分子，其中该car包含结合本文所述肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如本文所述跨膜结构域)及含有刺激结构域(例如共刺激信号发放结构域(例如本文所述共刺激信号发放结构域))和/或主信号发放结构域(例如本文所述主信号发放结构域，例如本文所述ζ链)的胞内信号发放结构域(例如本文所述胞内信号发放结构域)。在一个实施方案中，该跨膜结构域是选自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154的蛋白质的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包含例如以下的一个或多个跨膜区：kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp。
在一个实施方案中，该跨膜结构域包含序列seqidno:12或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，该抗原结合结构域通过铰链区(例如本文所述铰链)与该跨膜结构域连接。在一个实施方案中，该铰链区包含seqidno:4或seqidno:6或seqidno:8或seqidno:10，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，该分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，该共刺激结构域是选自以下的蛋白质的功能性信号发放结构域：ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。这类共刺激分子的其他实例包括cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76和pag/cbp。在一个实施方案中，该共刺激结构域包含序列seqidno:16或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域包含4-1bb的功能性信号发放结构域和cd3ζ的功能性信号发放结构域。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域包含序列seqidno:14或seqidno:16或与其具有95-99％同一性的序列和序列seqidno:18或seqidno:20或与其具有95-99％同一性的序列，其中包含胞内信号发放结构域的序列在同一可读框内表达，且表达为单条多肽链。
在另一方面，本发明涉及编码car构建体的分离的核酸分子，该car构建体包含seqidno:2的前导序列、本文所述scfv、seqidno:4或seqidno:6或seqidno:8或seqidno:10(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有序列seqidno:12(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有序列seqidno:14的4-1bb共刺激结构域或具有序列seqidno:16(或与其具有95-99％同一性的序列)的cd27共刺激结构域、及具有序列seqidno:18或seqidno:20(或与其具有95-99％同一性的序列)的cd3ζ刺激结构域。
在另一方面，本发明涉及编码包含抗原结合结构域、跨膜结构域和含有刺激结构域的胞内信号发放结构域的嵌合抗原受体(car)分子的核酸分子，其中该抗原结合结构域结合选自以下的肿瘤抗原：cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1(clecl1)、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tnag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-11ra、psca、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、prss21、pap、elf2m、肝配蛋白b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、岩藻糖基gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、邻-乙酰-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、tshr、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、legumain、hpve6,e7、magea1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白和端粒酶、pcta-1/半乳凝集素8、melana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5和igll1。
在一个实施方案中，所编码的car分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，该共刺激结构域是选自ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)和4-1bb(cd137)的蛋白质的功能性信号发放结构域。在一个实施方案中，该共刺激结构域包含序列seqidno:14。在一个实施方案中，该跨膜结构域是选自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，该跨膜结构域包含序列seqidno:12。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域包含4-1bb的功能性信号发放结构域和ζ的功能性信号发放结构域。在一个实施方案中，该胞内信号发放结构域包含序列seqidno:14和序列seqidno:18，其中包含胞内信号发放结构域的序列在同一可读框中表达，且表达为单条多肽链。在一个实施方案中，抗本文所述癌症相关抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，该铰链区包含seqidno:4。在一个实施方案中，该铰链区包含seqidno:6或seqidno:8或seqidno:10。
编码所希望得到的分子的核酸序列可以用本领域已知的重组方法获得，例如通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体衍生该基因，或通过用标准技术直接从包含该基因的细胞和组织分离。备选地，目的基因可以合成产生而不是克隆产生。
本发明还提供其中插入了本发明的dna的载体。源自反转录病毒(如慢病毒)的载体是达到长期基因转移的适宜工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体具有优于源自致癌反转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的附加优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优势。反转录病毒载体还可以是例如丙型反转录病毒载体。丙型反转录病毒载体可以包含例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(pbs)、一个或多个(例如两个)长末端重复(ltr)和目的转基因(例如编码car的基因)。丙型反转录病毒载体可以缺乏病毒结构基因，如gag、pol和env。示例性丙型反转录病毒载体包括鼠白血病病毒(mlv)、脾病灶形成病毒(sffv)和骨髓增生肉瘤病毒(mpsv)及从其衍生的载体。其他丙型反转录病毒载体描述于例如tobiasmaetzig等,“gammaretroviralvectors:biology,technologyandapplication”viruses.2011年6月；3(6):677-713中。
在另一实施方案中，包含编码所希望得到的本发明的car的核酸的载体是腺病毒载体(a5/35)。在另一实施方案中，可以用诸如sleepingbeauty、crisper、cas9和锌指核酸酶的转座子达到编码car的核酸的表达。参见下文june等2009naturereviewsimmunology9.10:704-716，在此引入作为参考。
简要总结，通常通过将编码car多肽或其部分的核酸与启动子有效连接并将该构建体掺入表达载体来达到编码car的天然或合成核酸的表达。该载体可适于在真核生物中复制和整合。典型克隆载体包含用于调节所希望的核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本发明的表达构建体还可以用标准基因递送流程用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法为本领域已知。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此以其整体引入作为参考。在另一实施方案中，本发明提供基因治疗载体。
核酸可以克隆入许多类型的载体。例如，核酸可以克隆入包括但不限于质粒、噬粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体。尤其感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术为本领域公知，并描述于例如sambrook等,2012,molecularcloning:alaboratorymanual,1-4卷,coldspringharborpress,ny中及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，适宜的载体包含在至少一种生物中具有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记(例如wo01/96584、wo01/29058和美国专利号6,326,193)。
已发展了许多用于将基因转移入哺乳动物细胞的基于病毒的系统。例如，反转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体并包装在反转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒，并递送至体内或离体的个体细胞。本领域已知许多反转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知许多腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
其他启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些元件定位在起始位点上游30-110bp的区域内，但已显示许多启动子也在起始位点下游包含功能性元件。启动子元件间的间隔常是柔性的，使得在元件相对于彼此翻转或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件间的间隔可以增加至相隔50bp。取决于启动子，单个元件似乎可以协同或独立发挥作用来激活转录。示例性启动子包括cmvie基因、ef-1α、泛素c或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。
能够在哺乳动物t细胞中表达car编码核酸分子的启动子的实例是ef1a启动子。天然ef1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基表达，延伸因子-1复合物负责酶促递送氨酰trna至核糖体。ef1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒，且已显示在驱动从克隆入慢病毒载体的核酸分子表达car中有效。参见例如milone等,mol.ther.17(8):1453–1464(2009)。在一方面，ef1a启动子包含seqidno:1所提供的序列。
启动子的另一实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与之有效连接的任意多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、eb病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。可考虑诱导型启动子作为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在希望得到这种表达时打开与它有效连接的多核苷酸序列的表达，在不希望得到表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
载体还可以包含例如便于分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(bgh)基因)、允许附加型复制和原核生物中的复制的元件(例如sv40起点和cole1或本领域已知的其他元件)、和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或博来霉素标记)。
为了评估car多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以包含选择标记基因或报告基因或二者，以便于从试图转染或通过病毒载体感染的细胞群体鉴定和选择表达细胞。在其他方面，该选择标记可以携带在分开的dna序列上，并用于共转染方法。选择标记和报告基因都可以有适当的调节序列位于侧翼，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能性。通常，报告基因是这样的基因，其不存在于受体生物或组织中或由受体生物或组织表达，且编码其表达表现为一些早期可检测特性(例如酶活性)的多肽。在dna已引入受体细胞之后的适宜时间测定报告基因的表达。适宜的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如ui-tei等,2000febsletters479:79-82)。适宜的表达系统为本领域公知，且可以用已知技术制备或购买获得。通常，将显示最高报告基因表达水平的具有最小5’侧翼区的构建体鉴定为启动子。这类启动子区可以与报告基因连接，并用于针对调节启动子驱动的转录的能力评价活性剂。
在细胞中引入和表达基因的方法为本领域已知。在表达载体的背景中，载体可以通过本领域的任意方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移入宿主细胞。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域公知。参见例如sambrook等,2012,molecularcloning:alaboratorymanual,1-4卷,coldspringharborpress,ny。用于将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体(尤其是反转录病毒载体)已成为最广泛使用的用于将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米囊、微球、小球，及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜泡)。可用靶向递送核酸的其他现有技术方法，如用靶向纳米颗粒或其他适宜的亚微米尺寸递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，该核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和寡核苷酸二者结合的连接分子附着于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在包含脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬液包含在脂质中、包含在微团中或与微团复合、或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可以作为微团存在于双层结构中，或具有“倒塌”结构。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于胞质中的脂肪小滴以及包含长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可获自商业来源。例如，二豆蔻酰磷脂酰胆碱(“dmpc”)可从sigma,st.louis,mo获得，磷酸二鲸腊酯(“dcp”)可从k&klaboratories(plainview,ny)获得，胆固醇(“choi”)可从calbiochem-behring获得，二豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可从avantipolarlipids,inc.(birmingham,al.)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质母液可以保存在约-20℃。用氯仿作为唯一溶剂，因为它比甲醇更易挥发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭脂双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体可表征为具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们在将磷脂悬浮在过量水溶液中时同时形成。直至成分进行自我重排，然后封闭结构，在脂双层间包埋水和所溶解的溶质(ghosh等,1991glycobiology5:505-10)。但是，也涵盖在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可呈现微团结构或仅作为脂质分子的不均一聚集体存在。还考虑脂质转染胺试剂-核酸复合物。
无论用何种方法来将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式使细胞暴露于本发明的抑制剂，为了确认宿主细胞中存在重组dna序列，可以进行多种测定。这类测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，例如通过免疫学手段(elisa和western印迹)或通过本文所述测定检测特定多肽的存在或缺乏来鉴定落在本发明的范围之内的活性剂。
本发明进一步提供包含car编码核酸分子的载体。在一方面，car载体可直接转导入细胞，例如t细胞或nk细胞。在一方面，该载体是克隆载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微染色体)、反转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一方面，该载体能够在哺乳动物效应细胞(例如t细胞、nk细胞)中表达car构建体。在一方面，该哺乳动物t细胞是人t细胞。在一方面，该哺乳动物nk细胞是人nk细胞。
细胞来源
在扩增和遗传修饰或其他修饰之前，可从个体获得细胞(例如t细胞或天然杀伤(nk)细胞)来源。术语“个体”旨在包括可在其中引出免疫反应的活体生物(例如哺乳动物)。个体的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以获自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如t细胞)可获自用技术人员已知的任意数目的技术(如ficolltm分离)从个体采集的血液单位。在一个优选实施方案中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血的细胞。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以去除血浆级分，可选地将细胞置于适当缓冲液或介质中进行后续处理步骤。在一个实施方案中，用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤细胞。在备选实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，且可以缺乏镁，或可以缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。
缺乏钙情况下的初始激活步骤可导致放大的激活。如本领域普通技术人员可容易地理解，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法达到，如通过按照厂家说明书使用半自动“无逆流”离心机(例如cobe2991细胞处理器、baxtercytomate或haemoneticscellsaver5)。洗涤后，可将细胞重悬在多种生物相容缓冲液中，例如无钙无镁pbs、plasmalytea、或其他含或不含缓冲剂的盐溶液。备选地，可以去除单采血液成分术样品的不希望得到的成分，将细胞直接重悬在培养基中。
认为本申请的方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人ab血清的培养基条件，且利用已知的培养基条件和组合物，例如smith等,“exvivoexpansionofhumantcellsforadoptiveimmunotherapyusingthenovelxeno-freectsimmunecellserumreplacement”clinical&translationalimmunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所述的那些。
在一方面，通过裂解红细胞和排除单核细胞(例如通过percolltm梯度离心或通过对流离心淘洗)来从外周血淋巴细胞分离t细胞。
本文所述方法可以包括例如使用例如本文所述负选择技术，例如选择特定亚群的免疫效应细胞，例如t细胞，其是t调节细胞排除的群体，cd25+排除的细胞。优选地，t调节排除细胞群体包含不到30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的cd25+细胞。
在一个实施方案中，用抗cd25抗体或其片段、或cd25结合配体il-2从该群体去除t调节细胞，例如cd25+细胞。在一个实施方案中，该抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体与底物(例如小球)缀合，或以其他方式包被在底物(例如小球)上。在一个实施方案中，该抗cd25抗体或其片段与本文所述底物缀合。
在一个实施方案中，用来自miltenyitm的cd25排除试剂从该群体去除t调节细胞，例如cd25+t细胞。在一个实施方案中，细胞与cd25排除试剂的比例为1e7细胞:20ul、或1e7细胞:15ul、或1e7细胞:10ul、或1e7细胞:5ul、或1e7细胞:2.5ul、或1e7细胞:1.25ul。在一个实施方案中，例如对于t调节细胞，例如cd25+排除，使用500x106细胞/ml。在另一方面，使用600、700、800或900x106细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待排除的免疫效应细胞群体包含约6x109cd25+t细胞。在其他方面，待排除的免疫效应细胞群体包含约1x109至1x1010cd25+t细胞，及其间任意整数值。在一个实施方案中，所得到的t调节排除细胞群体具有2x109t调节细胞，例如cd25+细胞，或更少(例如1x109、5x108、1x108、5x107、1x107或更少cd25+细胞)。
在一方面，用具有排除管组(例如162-01管)的clinimac系统从该群体去除t调节细胞，例如cd25+细胞。在一个实施方案中，在排除设置(例如depletion2.1)上运行clinimac系统。
不希望受限于具体理论，在单采血液成分术之前或在制备表达car的细胞产品期间降低个体中免疫细胞负调节物的水平(例如减少不想要的免疫细胞(例如treg细胞)的数目)可降低个体复发的风险。例如，排除treg细胞的方法为本领域已知。减少treg细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗gitr抗体(本文所述抗gitr抗体)、cd25排除及其组合。
在一些实施方案中，该制备方法包括在制备表达car的细胞之前减少treg细胞的数目(例如排除)。例如，制备方法包括使样品(例如单采血液成分术样品)与抗gitr抗体和/或抗cd25抗体(或其片段，或cd25结合配体)接触，例如以在制备表达car的细胞(例如t细胞、nk细胞)产品之前排除treg细胞。
在一个实施方案中，在采集用于表达car的细胞产品制备的细胞之前用一种或多种减少treg细胞的治疗预处理个体，从而降低个体在表达car的细胞治疗后复发的风险。在一个实施方案中，减少treg细胞的方法包括但不限于对个体施用环磷酰胺、抗gitr抗体、cd25排除或其组合中的一种或多种。环磷酰胺、抗gitr抗体、cd25排除或其组合中的一种或多种的施用可以发生在输注表达car的细胞产品之前、期间或之后。
在一个实施方案中，在采集用于表达car的细胞产品制备的细胞之前用环磷酰胺预处理个体，从而降低个体在表达car的细胞治疗后复发的风险。在一个实施方案中，在采集用于表达car的细胞产品制备的细胞之前用抗gitr抗体预处理个体，从而降低个体在表达car的细胞治疗后复发的风险。
在一个实施方案中，待去除的细胞群体不是调节t细胞也不是肿瘤细胞，而是以其他方式负面影响cart细胞的扩增和/或功能的细胞，例如表达cd14、cd11b、cd33、cd15或潜在免疫抑制细胞所表达的其他标志的细胞。在一个实施方案中，考虑与调节t细胞和/或肿瘤细胞同时、或在该排除之后、或以另一顺序去除这类细胞。
本文所述方法可以包括一个以上选择步骤，例如一个以上排除步骤。可以例如用抗负选择细胞的独特表面标志的抗体的组合达到通过负选择富集t细胞群体。一种方法是通过负磁免疫黏附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用抗存在于负选择细胞上的细胞表面标志的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集cd4+，单克隆抗体混合物可以包含抗cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。
本文所述方法可以进一步包括从该群体去除表达肿瘤抗原(例如不包含cd25的肿瘤抗原，例如cd19、cd30、cd38、cd123、cd20、cd14或cd11b)的细胞，从而提供适合用于表达car(例如本文所述car)的t调节排除(例如cd25+排除)和肿瘤抗原排除的细胞群体。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞与t调节(例如cd25+)细胞同时去除。例如，可以使抗cd25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段附着于同一底物，例如小球，该小球可用于去除该细胞，或者可以使抗cd25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段附着于分开的小球，该小球的混合物可用于去除该细胞。在其他实施方案中，t调节细胞(例如cd25+细胞)的去除和表达肿瘤抗原的细胞的去除顺次且可以例如按任一顺序发生。
还提供这样的方法，该方法包括从该群体去除表达检验点抑制剂(例如本文所述检验点抑制剂)的细胞，例如pd1+细胞、lag3+细胞和tim3+细胞中的一种或多种，从而提供t调节排除(例如cd25+排除)细胞和检验点抑制剂排除细胞(例如pd1+、lag3+和/或tim3+排除细胞)群体。示例性检验点抑制剂包括b7-h1、b7-1、cd160、p1h、2b4、pd1、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、tigit、ctla-4、btla和lair1。在一个实施方案中，表达检验点抑制剂的细胞与t调节(例如cd25+)细胞同时去除。例如，可以使抗cd25抗体或其片段和抗检验点抑制剂抗体或其片段附着于同一小球，该小球可用于去除该细胞，或者可以使抗cd25抗体或其片段或抗检验点抑制剂抗体或其片段附着于分开的小球，该小球的混合物可用于去除该细胞。在其他实施方案中，t调节细胞(例如cd25+细胞)的去除和表达检验点抑制剂的细胞的去除顺次且可以例如按任一顺序发生。
本文所述方法可以包括正选择步骤。例如，通过与抗cd3/抗cd28(例如3x28)缀合小球(如
在一个实施方案中，可以选择表达ifn-γ、tnfα、il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、粒酶b和穿孔素中的一种或多种或其他适当的分子(例如其他细胞因子)的t细胞群体。可以例如通过pct公开号wo2013/126712中所述的方法来确定用于针对细胞表达进行筛选的方法。
为了通过正或负选择分离希望得到的细胞群体，可以改变细胞浓度和表面(例如颗粒，如小球)。在某些方面，可希望显著减小小球和细胞混合物在一起的体积(例如提高细胞浓度)，以确保细胞和小球的最大接触。例如，在一方面，使用10x1010细胞/ml、9x1010/ml、8x1010/ml、7x1010/ml、6x1010/ml或5x1010/ml的浓度。在一方面，使用1x1010细胞/ml的浓度。还在一方面，使用75、80、85、90、95或100x106细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，使用125或150x106细胞/ml的浓度。
使用高浓度可导致提高的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可弱表达目的靶抗原(如cd28阴性t细胞)或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这类细胞群体可具有治疗价值，且可希望获得。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+t细胞。
在相关方面，可以希望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面(例如颗粒，如小球)的混合物，使颗粒和细胞间的相互作用最小化。这选择出了高量表达所希望的将要结合于颗粒的抗原的细胞。例如，cd4+t细胞表达更高水平的cd28，在稀释浓度中比cd8+t细胞更容易捕获。在一方面，所使用的细胞浓度为5x106/ml。在其他方面，所使用的浓度可以从约1x105/ml至1x106/ml，及其间的任意整数值。
在其他方面，细胞可以在2-10℃或在室温下在旋转器上按不同速度孵育不同时长。
用于刺激的t细胞还可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受限于理论，冷冻和随后的融化步骤通过去除细胞群体中的粒细胞和某种程度上去除单核细胞提供了更均一的产品。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞重悬在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数为本领域已知并将在此背景中使用，但一种方法涉及使用包含20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或包含10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso，或31.25％plasmalyte-a、31.25％葡萄糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基，或包含例如羟乙基淀粉和plasmalytea的其他适宜的细胞冷冻培养基，然后将细胞按每分钟1℃的速率冷冻至-80℃，并保存在液氮保存罐的蒸汽相中。可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或液氮中的不受控冷冻。
在某些方面，按本文所述融化和洗涤冷冻保存的细胞，使其在室温静置1小时，然后用本发明的方法活化。
本发明的背景中还考虑在可能需要本文所述扩增细胞之前的时期从个体采集血液样品或单采血液成分术产品。因此，可以在任何必要时间点采集待扩增细胞的来源，并分离和冷冻所希望得到的细胞(例如t细胞)，随后用于针对可从免疫效应细胞治疗受益的任意数目的疾病或病症(如本文所述的那些)的免疫效应细胞治疗。在一方面，从一般健康个体采集血液样品或单采血液成分。在某些方面，从处于发展疾病风险但尚未发展疾病的一般健康个体采集血液样品或单采血液成分，分离和冷冻目的细胞用于后续使用。在某些实施方案中，可在随后时间扩增、冷冻和使用t细胞。在某些实施方案中，在诊断本文所述具体疾病之后马上但在任何治疗之前从患者采集样品。在另一方面，从来自任何数目的相关治疗方式之前的个体的血液样品或单采血液成分分离细胞，该治疗方式包括但不限于用药物治疗，如natalizumab、efalizumab、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体、或其他免疫消融剂(如campath、抗cd3抗体、环磷酰胺、福达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射)。
在本发明的另一方面，在使个体保留功能性t细胞的治疗之后直接从患者获得t细胞。在这方面，已观察到，在某些癌症治疗尤其是损伤免疫系统的药物治疗之后，治疗后很短时间，在正常情况下患者将从治疗恢复的短时期内，可以针对其离体扩增的能力优化或改善所获得的t细胞的质量。同样，用本文所述方法离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的背景内考虑在此恢复期期间采集血细胞，包括t细胞、树突细胞、或造血系的其他细胞。另外，在某些方面，尤其是在治疗后确定的时间窗口期间，可以用动员(例如用gm-csf动员)和调理方案来在个体中创造有利于特定细胞类型的再繁殖、再循环、再生和/或扩增的条件。说明性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，从已接受低免疫增强剂量mtor抑制剂的个体获得表达car分子(例如本文所述car分子)的免疫效应细胞。在一个实施方案中，在足够时间或足够给药次数的低免疫增强剂量mtor抑制剂使得个体中pd1阴性免疫效应细胞(例如t细胞)水平或pd1阴性免疫效应细胞(例如t细胞)/pd1阳性免疫效应细胞(例如t细胞)比值提高之后、或从已至少瞬时提高的个体收集待改造为表达car的免疫效应细胞(例如t细胞)群体。
在其他实施方案中，可以通过与提高pd1阴性免疫效应细胞(例如t细胞)数目或提高pd1阴性免疫效应细胞(例如t细胞)/pd1阳性免疫效应细胞(例如t细胞)比值的量的mtor抑制剂接触来离体处理已或将改造为表达car的免疫效应细胞(例如t细胞)群体。
在一个实施方案中，t细胞群体为二酰基甘油激酶(dgk)缺陷。dgk缺陷细胞包括不表达dgkrna或蛋白质或dgk活性降低或抑制的细胞。dgk缺陷细胞可以通过遗传方法产生，例如施用rna干扰剂，例如sirna、shrna、mirna，以减少或阻止dgk表达。备选地，dgk缺陷细胞可以通过用本文所述dgk抑制剂处理产生。
在一个实施方案中，t细胞群体为ikaros缺陷。ikaros缺陷细胞包括不表达ikarosrna或蛋白质或ikaros活性降低或抑制的细胞。ikaros缺陷细胞可以通过遗传方法产生，例如施用rna干扰剂，例如sirna、shrna、mirna，以减少或阻止ikaros表达。备选地，ikaros缺陷细胞可以通过用ikaros抑制剂(例如来那度胺(lenalidomide))处理产生。
在一些实施方案中，t细胞群体为dgk缺陷和ikaros缺陷，例如不表达dgk和ikaros，或dgk和ikaros活性降低或抑制。这类dgk和ikaros缺陷细胞可以通过本文所述任意方法产生。
在一个实施方案中，从个体获得nk细胞。在另一实施方案中，该nk细胞是nk细胞系，例如nk-92细胞系(conkwest)。
同种异基因car
在本文所述实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异基因免疫效应细胞，例如t细胞或nk细胞。例如，该细胞可以是同种异基因t细胞，例如缺乏功能性t细胞受体(tcr)和/或人白细胞抗原(hla)(例如i类hla和/或ii类hla)表达的同种异基因t细胞。
缺乏功能性tcr的细胞可以例如改造使得它不在其表面表达任何功能性tcr、改造使得它不表达包含功能性tcr的一个或多个亚基、或改造使得它在其表面产生非常少的功能性tcr。备选地，该t细胞可以实质性受损的tcr，例如通过表达tcr的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语“实质性受损的tcr”指此tcr将不在宿主中引出不良免疫反应。
可以例如改造本文所述t细胞，使得它不在其表面表达功能性hla。例如，可以改造本文所述t细胞，使得细胞表面hla(例如i类hla和/或ii类hla)表达下调。
在一些实施方案中，该t细胞可以缺乏功能性tcr和功能性hla(例如i类hla和/或ii类hla)
经修饰的缺乏功能性tcr和/或hla表达的t细胞可以通过任意适宜的手段获得，包括敲除或敲减tcr或hla的一个或多个亚基。例如，该t细胞可以包括用shrna、规律成簇间隔短回文重复(crispr)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)或锌指核酸酶(zfn)敲减tcr和/或hla。
在一些实施方案中，该同种异基因细胞可以是例如通过本文所述任意方法使其不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可降低表达car的细胞引起免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ。抑制性分子的抑制(例如通过在dna、rna或蛋白质水平抑制)可以优化表达car的细胞的性能。在一些实施方案中，可以使用例如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如sdrna，例如sirna或shrna，规律成簇间隔短回文重复(crispr)，转录激活因子样效应核酸酶(talen)，或锌指核酸酶(zfn)。
抑制tcr或hla的sirna和shrna
在一些实施方案中，可以用靶向t细胞中编码tcr和/或hla的核酸的sirna或shrna抑制tcr表达和/或hla表达。
可以用任意常规表达系统(例如慢病毒表达系统)达到sirna和shrna在t细胞中的表达。
下调tcr成分表达的示例性shrna描述于例如美国公开号2012/0321667中。下调i类hla和/或ii类hla基因表达的示例性sirna和shrna描述于例如美国公开号us2007/0036773中。
抑制tcr或hla的crispr
本文所用的“crispr”或“针对tcr和/或hla的crispr”或“抑制tcr和/或hla的crispr”指一组规律成簇间隔短回文重复，或包含该组重复的系统。本文所用的“cas”指crispr结合蛋白质。“crispr/cas”系统指源自crispr和cas的系统，其可用于沉默或突变tcr和/或hla基因。
天然存在的crispr/cas系统见于约40％已测序的真细菌基因组和90％已测序的古细菌中。grissa等(2007)bmcbioinformatics8:172。此系统是一类原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件如质粒和噬菌体的抗性，提供一种获得性免疫形式。barrangou等(2007)science315:1709-1712；marragini等(2008)science322:1843-1845。
crispr/cas系统已修饰用于真核生物如小鼠或灵长类中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。wiedenheft等(2012)nature482:331-8。这是通过例如将包含特别设计的crispr的质粒和一种或多种适当的cas引入真核细胞来达到。
crispr序列(有时称为crispr基因座)包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的crispr中，间隔区通常包含对细菌而言为外来的序列，如质粒或噬菌体序列；在tcr和/或hlacrispr/cas系统中，间隔区源自tcr或hla基因序列。
来自crispr基因座的rna组成性表达并被cas蛋白质加工为小rna。这些小rna包含侧翼为重复序列的间隔区。rna指导其他cas蛋白质在rna或dna水平沉默外源遗传元件。horvath等(2010)science327:167-170；makarova等(2006)biologydirect1:7。间隔区因此作为rna分子的模板，类似于sirna。pennisi(2013)science341:833-836。
由于这些系统天然存在于许多不同类型的细菌中，crispr的确切排列及cas基因及其产物的结构、功能和数目在物种与物种之间稍有不同。haft等(2005)ploscomput.biol.1:e60；kunin等(2007)genomebiol.8:r61；mojica等(2005)j.mol.evol.60:174-182；bolotin等(2005)microbiol.151:2551-2561；pourcel等(2005)microbiol.151:653-663；和stern等(2010)trends.genet.28:335-340。例如，cse(cas亚型，大肠杆菌)蛋白质(例如casa)形成功能性复合物cascade，cascade将crisprrna转录物加工为cascade保留的间隔区-重复序列单位。brouns等(2008)science321:960-964。在其他原核生物中，cas6加工crispr转录物。大肠杆菌中基于crispr的噬菌体失活需要cascade和cas3，而不是cas1或cas2。嗜热火球菌和其他原核生物中的cmr(casramp模块)与识别并切割互补靶rna的小crisprrna形成功能性复合物。更简单的crispr系统依赖于cas9蛋白质，cas9蛋白质具有两个活性切割位点，一个用于双链体的各链。组合cas9和经修饰的crispr基因座rna可用于基因编辑系统。pennisi(2013)science341:833-836。
crispr/cas系统因此可用于编辑tcr和/或hla基因(添加或缺失碱基对)，或引入提前终止，从而减少tcr和/或hla的表达。crispr/cas系统还可以像rna干扰一样使用，以可逆方式关闭tcr和/或hla基因。在哺乳动物细胞中，例如，rna可以指导cas蛋白质至tcr和/或hla启动子，在空间上阻断rna聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如美国公开号20140068797和cong(2013)science339:819-823中所述的技术，产生抑制tcr和/或hla的人工crispr/cas系统。也可以产生抑制tcr和/或hla的本领域已知的其他人工crispr/cas系统，例如tsai(2014)naturebiotechnol.,32:6569-576、美国专利号8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945和8,697,359中所述的系统。
抑制tcr和/或hla的talen
“talen”或“针对hla和/或tcr的talen”或“抑制hla和/或tcr的talen”指转录激活因子样效应核酸酶，其是可用于编辑hla和/或tcr基因的人工核酸酶。
talen是通过将tal效应子dna结合结构域与dna切割结构域融合而人工产生的。转录激活因子样效应(tale)可以改造为结合所希望的任何dna序列，包括hla或tcr基因的部分。通过将tale与dna切割结构域组合，可以产生对所希望的任何dna序列(包括hla或tcr序列的部分)特异的限制酶。然后可将这些组合引入细胞，其中它们可用于基因组编辑。boch(2011)naturebiotech.29:135-6；和boch等(2009)science326:1509-12；moscou等(2009)science326:3501。
tale是由黄单胞菌属细菌分泌的蛋白质。dna结合结构域包含重复、高度保守的33-34个氨基酸的序列(第12和13个氨基酸除外)。这两个位置高度可变，显示与特异性核苷酸识别强相关。它们因此可以改造为结合所希望的dna序列。
为了产生talen，将tale蛋白质与核酸酶(n)(其是野生型或突变foki核酸内切酶)融合。针对其在talen中的用途对foki进行了几个突变；这些突变例如改善了切割特异性或活性。cermak等(2011)nucl.acidsres.39:e82；miller等(2011)naturebiotech.29:143-8；hockemeyer等(2011)naturebiotech.29:731-734；wood等(2011)science333:307；doyon等(2010)naturemethods8:74-79；szczepek等(2007)naturebiotech.25:786-793；和guo等(2010)j.mol.biol.200:96。
foki结构域作为二聚体发挥作用，需要两个正确取向和间隔开的具有靶基因组中位点的独特dna结合结构域的构建体。taledna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单talen结合位点间的碱基数对达到高水平活性似乎都是重要参数。miller等(2011)naturebiotech.29:143-8。
可在细胞内使用hla或tcrtalen来产生双链断裂(dsb)。如果修复机制通过非同源末端连接不正确地修复断裂，则可在断裂位点处引入突变。例如，不正确的修复可以引入移码突变。备选地，可将外来dna连同talen引入细胞；取决于外来dna的序列和染色体序列，这种方法可以用于校正hla或tcr基因中的缺陷，或将这种缺陷引入wthla或tcr基因，从而减少hla或tcr的表达。
可以用本领域已知的任意方法构建对hla或tcr中的序列特异的talen，包括多种使用模块成分的方案。zhang等(2011)naturebiotech.29:149-53；geibler等(2011)plosone6:e19509。
抑制hla和/或tcr的锌指核酸酶
“zfn”或“锌指核酸酶”或“针对hla和/或tcr的zfn”或“抑制hla和/或tcr的zfn”指锌指核酸酶，其是可用于编辑hla和/或tcr基因的人工核酸酶。
与talen一样，zfn包含与dna结合结构域融合的foki核酸酶结构域(或其衍生物)。在zfn的情况下，该dna结合结构域包含一个或多个锌指。carroll等(2011)geneticssocietyofamerica188:773-782；和kim等(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:1156-1160。
锌指是通过一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可以包含例如cys2his2，且可以识别约3bp的序列。可组合多种具有已知特异性的锌指来产生识别约6、9、12、15或18bp的序列的多指多肽。可用多种选择和模块组装技术来产生识别特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统、及哺乳动物细胞。
与talen一样，zfn必须二聚化来切割dna。因此，需要一对zfn来靶向非回文dna位点。两个单zfn必须结合dna的相反链，它们的核酸酶正确间隔开。bitinaite等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:10570-5。
还是与talen一样，zfn可以在dna中产生双链断裂，如果不正确地修复，则该双链断裂可产生移码突变，导致细胞中hla和/或tcr的表达和量减少。zfn也可以与同源重组一起使用来突变hla或tcr基因。
可以用本领域已知的任意方法构建对hla和/或tcr中的序列特异的zfn。参见例如provasi(2011)naturemed.18:807-815；torikai(2013)blood122:1341-1349；cathomen等(2008)mol.ther.16:1200-7；和guo等(2010)j.mol.biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。
端粒酶表达
不希望受限于任何具体理论，在一些实施方案中，由于t细胞中缩短的端粒，治疗性t细胞在患者中具有短期持续存在；因此，用端粒酶基因转染可以延长t细胞的端粒，改善t细胞在患者中的持续存在。参见carljune,“adoptivetcelltherapyforcancerintheclinic”,journalofclinicalinvestigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如t细胞)异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如tert，例如htert。在一些方面，本公开提供产生表达car的细胞的方法，其包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如tert，例如htert)的核酸接触。可以使细胞在与编码car的构建体接触之前、与之同时或之后与该核酸接触。
在一方面，本公开涉及制备免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)群体的方法。在一个实施方案中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如t细胞或nk细胞)群体，在允许car和端粒酶表达的条件下，使该免疫效应细胞群体与编码car的核酸接触，及使该免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如htert)的核酸接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是dna。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在一个实施方案中，htert具有如下genbankproteinidaac51724.1(meyerson等,“hest2,theputativehumantelomerasecatalyticsubunitgene,isup-regulatedintumorcellsandduringimmortalization”cell90卷,4期,1997年8月22日,785-795页)的氨基酸序列：
在一个实施方案中，该htert具有与序列seqidno:63至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在一个实施方案中，该htert具有序列seqidno:63。在一个实施方案中，该htert在n端、c端或两端都包含缺失(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸)。在一个实施方案中，该htert在n端、c端或两端都包含转基因氨基酸序列(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸)。
在一个实施方案中，该htert由genbank检索号af018167(meyerson等,“hest2,theputativehumantelomerasecatalyticsubunitgene,isup-regulatedintumorcellsandduringimmortalization”cell90卷,4期,1997年8月22日,785-795页)的核酸序列编码：
在一个实施方案中，该htert由具有与序列seqidno:64至少80％、85％、90％、95％、96、97％、98％或99％同一的序列的核酸编码。在一个实施方案中，该htert由seqidno:64的核酸编码。
免疫效应细胞(例如t细胞)的活化和扩增
免疫效应细胞(如t细胞)通常可用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法活化和扩增。
通常，可以通过与具有附着于其上的刺激cd3/tcr复合物相关信号的活性剂和刺激t细胞表面共刺激分子的配体的表面接触来扩增免疫效应细胞(例如t调节细胞排除的细胞)群体。具体而言，可以按本文所述刺激t细胞群体，如通过与固定在表面上的抗cd3抗体、或其抗原结合片段、或抗cd2抗体接触，或通过与与钙离子载体结合的蛋白激酶c激活物(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合该辅助分子的配体。例如，可以在适合用于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4+t细胞或cd8+t细胞增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,
在某些方面，可通过不同流程提供t细胞的主刺激信号和共刺激信号。例如，提供各信号的活性剂可以在溶液中或偶联至表面。在偶联至表面时，该活性剂可以偶联至同一表面(即“顺式”形成)或分开的表面(即“反式”形成)。备选地，可使一种活性剂偶联至表面，另一种活性剂在溶液中。在一方面，可使提供共刺激信号的活性剂结合于细胞表面，提供主激活信号的活性剂在溶液中或偶联至表面。在某些方面，两种活性剂都在溶液中。在一方面，该活性剂可以处于可溶形式，然后交联至表面，如表达fc受体的细胞或可结合该活性剂的抗体或其他结合剂。在这方面，本发明中考虑用于活化和扩增t细胞的人工抗原呈递细胞(aapc)参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810。
在一方面，将两种活性剂固定在小球上(固定在同一小球上，即“顺式”，或固定在分开的小球上，即“反式”)。作为实例，提供主活化信号的活性剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的活性剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；两种活性剂以等分子量共同固定至同一小球。在一方面，用1:1比值的各抗体结合于小球用于cd4+t细胞扩增和t细胞生长。在本发明的某些方面，这样使用结合于小球的抗cd3:cd28抗体比值，使得与用1:1比值观察到的扩增相比观察到t细胞扩增增加。在一个具体方面，与用1:1比值观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一方面，结合于小球的cd3:cd28抗体比值在100:1至1:100范围内，及其间所有整数值。在一方面，比抗cd3抗体多的抗cd28抗体结合于颗粒，即cd3:cd28的比值小于1。在某些方面，结合于小球的抗cd28抗体与抗cd3抗体的比值大于2:1。在一个具体方面，使用1:100cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。在一方面，使用1:75cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。在另一方面，使用1:50cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。在一方面，使用1:30cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。在一个优选方面，使用1:10cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。在一方面，使用1:3cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。还在一方面，使用3:1cd3:cd28比值的结合于小球的抗体。
可以用1:500至500:1及其间任意整数值的颗粒与细胞的比值来刺激t细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可容易地理解，颗粒与细胞的比值可取决于颗粒相对于靶细胞的大小。例如，小尺寸小球仅可结合很少细胞，而较大的小球可以结合许多细胞。在某些方面，细胞与颗粒的比值为1:100至100:1及其间任意整数值，在其他方面，该比值包含1:9至9:1及其间任意整数值，也可以用于刺激t细胞。如上文所指出，导致t细胞刺激的抗cd3和抗cd8偶联的颗粒与t细胞的比值可以变动，但是某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比值是每个t细胞至少一个颗粒。在一方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比值。在一个具体方面，优选的颗粒:细胞比值为1:5。在其他方面，取决于刺激的天数，颗粒与细胞的比值可以改变。例如，在一个实施方案中，在第一天，颗粒与细胞的比值为1:1至10:1，然后按1:1至1:10(根据加入当天的细胞计数)的最终比值每天或每两天向细胞中加入附加的颗粒至多10天。在一个具体方面，颗粒与细胞的比值在刺激第一天为1:1，在刺激第三和第五天调整至1:5。在一方面，以每天或每两天为基础加入颗粒至最终比值在第一天为1:1，在刺激第三和第五天为1:5。在一方面，颗粒与细胞的比值在刺激第一天为2:1，在刺激第三和第五天调整至1:10。在一方面，以每天或每两天为基础加入颗粒至最终比值在第一天为1:1，在刺激第三和第五天为1:10。本领域技术人员将理解，多种其他比值可适合用于本发明。具体而言，比值将取决于颗粒大小及细胞大小和类型而变。在一方面，所使用的最典型的比值在第一天在1:1、2:1和3:1附近。
在其他方面，将细胞(如t细胞)与活性剂包被的小球组合，随后将小球和细胞分开，然后培养细胞。在备选方面，在培养之前，不将活性剂包被的小球和细胞分开，而是一起培养。在其他方面，首先通过用力(例如磁力)来浓缩小球和细胞，导致细胞表面标志连接增加，从而诱导细胞刺激。
作为实例，可通过使附着了抗cd3和抗cd28的顺磁小球(3x28小球)与t细胞接触来连接细胞表面蛋白质。在一方面，将细胞(例如104至109t细胞)和小球(例如比值为1:1的
在一个实施方案中，例如通过本文所述方法扩增用编码car(例如本文所述car)的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，该细胞在培养物中扩增几个小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的时期。在一个实施方案中，该细胞扩增4至9天的时期。在一个实施方案中，该细胞扩增8天或更短(例如7、6或5天)的时期。在一个实施方案中，该细胞(例如本文所述cd19car细胞)在培养物中扩增5天，所得到的细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。功效可定义为例如多种t细胞功能，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移或其组合。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述cd19car细胞)在抗原刺激时显示细胞倍增提高至少一、二、三或四倍。在一个实施方案中，该细胞(例如本文所述cd19car细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得到的细胞显示更高的促炎症细胞因子产生，例如ifn-γ和/或gm-csf水平。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述cd19car细胞)显示以pg/ml计的促炎症细胞因子产生(例如ifn-γ和/或gm-csf水平)提高至少一、二、三、四、五、十倍或更多。
还可以希望进行几个循环的刺激，使得t细胞培养时间可以是60天或更长。适合用于t细胞培养的条件包括可含有增殖和活率所必需的因子的适当培养基(例如最低必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo15(lonza))，该因子包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α，或技术人员已知的任何其他用于细胞生长的添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如n-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15、x-vivo20、optimizer，其添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充了适量血清(或血浆)或确定的激素组，和/或对t细胞生长和扩增足够量的一种或多种细胞因子。仅在实验性培养物中包含抗生素(例如青霉素和链霉素)，在将输注入个体的细胞培养物中不包含。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和空气(例如空气加5％co2)。
在一个实施方案中，在包含一种或多种白介素的适当培养基(例如本文所述培养基)中扩增细胞，如例如通过本文所述方法(如流式细胞术)测量，其导致细胞在14天扩增期内增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)。在一个实施方案中，在il-15和/或il-7(例如il-15和il-7)存在下扩增细胞。
在一些实施方案中，本文所述方法(例如表达car的细胞制备方法)包括例如用抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体il-2从细胞群体去除t调节细胞，例如cd25+t细胞。本文描述了从细胞群体去除t调节细胞(例如cd25+t细胞)的方法。在一些实施方案中，该方法(例如制备方法)进一步包括使细胞群体(例如已排除其中t调节细胞(如cd25+t细胞)的细胞群体；或之前已使其与抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体接触的细胞群体与il-15和/或il-7接触。例如，在il-15和/或il-7存在下扩增细胞群体(例如之前已使其与抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体接触)。
在一些实施方案中，在例如离体制备表达car的细胞期间，使本文所述表达car的细胞与包含白介素-15(il-15)、白介素-15受体α(il-15ra)多肽或il-15多肽和il-15ra多肽(例如hetil-15)二者的组合的组合物接触。在一些实施方案中，在例如离体制备表达car的细胞期间，使本文所述表达car的细胞与包含il-15多肽的组合物接触。在一些实施方案中，在例如离体制备表达car的细胞期间，使本文所述表达car的细胞与包含il-15多肽和il-15ra多肽二者的组合的组合物接触。在一些实施方案中，在例如离体制备表达car的细胞期间，使本文所述表达car的细胞与包含hetil-15的组合物接触。
在一个实施方案中，在离体扩增期间使本文所述表达car的细胞与包含hetil-15的组合物接触。在一个实施方案中，在离体扩增期间使本文所述表达car的细胞与包含il-15多肽的组合物接触。在一个实施方案中，在离体扩增期间使本文所述表达car的细胞与包含il-15多肽和il-15ra多肽二者的组合物接触。在一个实施方案中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如cd8+t细胞)的存活和增殖。
暴露于不同刺激时间的t细胞可以显示不同特征。例如，典型血液或单采血液成分外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性或抑制t细胞群体(tc，cd8+)的辅助t细胞群体(th，cd4+)。通过刺激cd3和cd28受体离体扩增t细胞产生t细胞群体，在约8-9天之前，该t细胞群体主要由th细胞组成，而在约8-9天之后，该t细胞群体包含逐渐增大的tc细胞群体。因此，取决于处理的目的，用主要包含th细胞的t细胞群体输注个体可以是有利的。类似地，如果已分离抗原特异性tc细胞亚群，则扩增此亚群至更大程度可以是有益的。
此外，除cd4和cd8标记外，其他表型标记变化显著，但在很大程度上可在细胞扩增方法过程中重现。因此，这种重现性使得能够为具体目的量身定制活化t细胞产品。
一旦构建本文所述car，即可用多种测定来评价该分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增t细胞、在缺乏再刺激的情况下维持t细胞扩增的能力，及在适当的体外模型和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详述评价本发明的car的效应的测定。
可用原代t细胞中car表达的western印迹分析来检测单体和二聚体的存在。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。简言之，在体外扩增表达car的t细胞(cd4+和cd8+t细胞的1:1混合物)10天以上，然后进行裂解和还原条件下的sds-page。用抗tcr-ζ链的抗体通过western印迹检测包含全长tcr-ζ胞质结构域的car和内源tcr-ζ链。用同一t细胞亚群进行非还原条件下的sds-page分子，以允许评价共价二聚体形成。
抗原刺激后car+t细胞的体外扩增可通过流式细胞术测量。例如，用αcd3/αcd28aapc刺激cd4+和cd8+t细胞的混合物，然后用在待分析的启动子控制下表达gfp的慢病毒载体转导。示例性启动子包括cmvie基因、ef-1α、泛素c或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。在培养第6天通过流式细胞术评价cd4+和/或cd8+t细胞亚群中的gfp荧光。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。备选地，在0天用αcd3/αcd28包被的磁性小球刺激cd4+和cd8+t细胞的混合物，在第1天用car转导，使用用2a核糖体跳过序列表达car连同egfp的双顺反子慢病毒载体。洗涤后在抗cd3和抗cd28抗体存在下用本文所述癌症相关抗原+k562细胞(表达本文所述癌症相关抗原的k562)、野生型k562细胞(k562野生型)或表达hcd32和4-1bbl的k562细胞(k562-bbl-3/28)再刺激培养物。每两天按100iu/ml向培养物中加入外源il-2。通过使用基于小球的计数的流式细胞术计数gfp+t细胞。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量缺乏再刺激情况下的持续car+t细胞扩增。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。简言之，在第0天用αcd3/αcd28包被的磁性小球刺激并在第1天用所示car转导后，在培养第8天用coultermultisizeriii颗粒计数仪、nexcelomcellometervision或milliporescepter测量平均t细胞体积(fl)。
还可以用动物模型来测量cart活性。例如，可以使用用本文所述人癌症相关抗原特异性car+t细胞来在免疫缺陷小鼠中治疗原发性人前体b细胞性all的异种移植模型。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。简言之，建立all后，将小鼠随机化至治疗组。将不同数目的癌症相关抗原特异性car改造t细胞按1:1比值共同注射入具有b-all的nod-scid-γ-/-小鼠。在t细胞注射后多种时间点评价来自小鼠的脾dna中癌症相关抗原特异性car载体的拷贝数。按每周的间隔对动物进行白血病评估。在本文所述癌症相关抗原-ζcar+t细胞或模拟转导t细胞注射的小鼠中测量外周血本文所述癌症相关抗原+b-all母细胞计数。用对数秩检验比较组存活曲线。此外，还可以分析nod-scid-γ-/-小鼠中t细胞注射4周后的绝对外周血cd4+和cd8+t细胞计数。用白血病细胞注射小鼠，3周后用通过编码连接至egfp的car的双顺反子慢病毒载体改造为表达car的t细胞注射。通过在注射前与模拟转导细胞混合来将t细胞归一化至45-50％输入gfp+t细胞，并通过流式细胞术确认。按1周的间隔对动物进行白血病评估。用对数秩检验比较car+t细胞组存活曲线。
可以评价剂量依赖性car治疗反应。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21天注射cart细胞、等量模拟转导t细胞或不注射t细胞的小鼠中建立白血病后35-70天获得外周血。在第35和49天对来自各组的小鼠随机采血用于测定外周血本文所述癌症相关抗原+all母细胞计数，然后处死。剩余动物在第57和70天评价。
细胞增殖和细胞因子产生的评估之前已描述于例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)中。简言之，通过将经洗涤的t细胞与表达本文所述癌症相关抗原(k19)或cd32和cd137(kt32-bbl)的k562细胞按最终t细胞:k562比值为2:1混合，在微量滴定板中进行car介导的增殖的评估。k562细胞在使用前用γ射线照射。向含kt32-bbl细胞的培养物中加入抗cd3(克隆okt3)和抗cd28(克隆9.3)单克隆抗体抗体作为刺激t细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持cd8+t细胞长期离体扩增。按厂家所述用countbrighttm荧光小球(invitrogen,carlsbad,ca)和流式细胞术计数培养物中的t细胞。使用用表达egfp-2a连接的car的慢病毒载体改造的t细胞，通过gfp表达鉴定car+t细胞。对于不表达gfp的car+t细胞，用生物素化重组本文所述癌症相关抗原蛋白质和第二亲和素-pe缀合物检测car+t细胞。还同时用特异性单克隆抗体(bdbiosciences)检测t细胞上的cd4+和cd8+表达。按照厂家说明书用人th1/th2细胞因子流式细胞术小球阵列试剂盒(bdbiosciences,sandiego,ca)对再刺激后24小时收集的上清进行细胞因子测量。按照厂家说明书用facscalibur流式细胞仪评估荧光并分析数据。
可通过标准51cr释放测定评估细胞毒性。参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)。简言之，用51cr(作为nacro4,newenglandnuclear,boston,ma)在37℃频繁搅拌加载靶细胞(k562细胞系和原代前体-b-all细胞)2小时，在完全rpmi中洗涤两次，接种入微量滴定板。效应t细胞按不同的效应细胞:靶细胞(e:t)比值在完全rpmi中在孔中与靶细胞混合。还制备仅包含培养基(自发释放，sr)或1％triton-x100去垢剂溶液(总释放，tr)的附加孔。37℃孵育4小时后，收集来自每个孔的上清。然后用γ颗粒计数器(packardinstrumentco.,waltham,ma)测量所释放的51cr。每个条件按至少一式三份进行，用以下公式计算百分比裂解：％裂解＝(er-sr)/(tr–sr)，其中er代表每个实验条件的平均51cr释放。
可用成像技术来评价car在具有肿瘤的动物模型中的运输和增殖。这类测定已描述于例如barrett等,humangenetherapy22:1575-1586(2011)中。简言之，nod/scid/γc–/–(nsg)小鼠iv注射nalm-6细胞，7天后注射用car构建体电穿孔后4小时的t细胞。t细胞用慢病毒构建体稳定转染以表达萤火虫荧光素酶，对小鼠进行生物发光成像。备选地，可以按以下测量单次注射的car+t细胞在nalm-6异种移植模型中的治疗功效和特异性：用转导为稳定表达萤火虫荧光素酶的nalm-6注射nsg小鼠，7天后单次尾静脉注射用本发明的car电穿孔的t细胞。在注射后多种时间点对动物进行成像。例如，可以产生第5天(治疗前2天)和第8天(car+pbl后24小时)的代表性小鼠中萤火虫荧光素酶阳性白血病的光子密度热图。
也可以用其他测定(包括本文实施例章节中所述的那些，以及本领域已知的那些)来评价本文所述的car。
治疗应用
在一方面，本发明提供用于治疗与本文所述癌症相关抗原的表达相关的疾病的方法。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达xcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中x代表本文所述肿瘤抗原，其中癌细胞表达该x肿瘤抗原。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达本文所述xcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达x。在一个实施方案中，x在正常细胞和癌细胞上都表达，但在正常细胞上以较低水平表达。在一个实施方案中，该方法进一步包括选择car，例如通过本文所述测定测定，该car以允许xcar结合并杀死表达x的癌细胞但杀死少于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少正常细胞的亲和力结合x。例如，可以使用图13a和13b中所述的测定，或杀伤测定，如基于流式细胞术的cr51ctl。在一个实施方案中，所选择的car具有抗原结合结构域，该抗原结合结构域对靶抗原具有10-4m至10-8m、例如10-5m至10-7m、例如10-6m或10-7m的结合亲和力kd。在一个实施方案中，所选择的抗原结合结构域具有比参考抗体(例如本文所述抗体)低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、1000倍的结合亲和力。
在一个实施方案中，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd19car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是all(急性淋巴细胞白血病)、cll(慢性淋巴细胞白血病)、dlbcl(弥漫性大b细胞淋巴瘤)、mcl(套细胞淋巴瘤)或mm(多发性骨髓瘤)。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达egfrviiicar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达egfrviii。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达间皮素car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达间皮素。在一个实施方案中，待治疗的癌症是间质瘤、胰腺癌或卵巢癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd123car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd123。在一个实施方案中，待治疗的癌症是aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd22car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd22。在一个实施方案中，待治疗的癌症是b细胞恶性肿瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cs-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cs-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cll-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cll-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd33car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd33。在一个实施方案中，待治疗的癌症是aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gd2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gd2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达bcmacar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达bcma。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tncar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tn抗原。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达psmacar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达psma。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ror1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ror1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是b细胞恶性肿瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达flt3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达flt3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tag72car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tag72。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd38car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd38。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd44v6car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd44v6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是宫颈癌、aml或mm。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ceacar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cea。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌或胰腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达epcamcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达epcam。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达b7h3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达b7h3。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达kitcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达kit。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达il-13ra2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达il-13ra2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达prss21car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达prss21。在一个实施方案中，待治疗的癌症选自卵巢癌、胰腺癌、肺癌和乳腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd30car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd30。在一个实施方案中，待治疗的癌症是淋巴瘤或白血病。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gd3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gd3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd171car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd171。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或nsclc(非小细胞肺癌)。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达il-11racar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达il-11ra。在一个实施方案中，待治疗的癌症是骨肉瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达pscacar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达psca。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达vegfr2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达vegfr2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达lewisycar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达lewisy。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌或aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd24car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd24。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胰腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达pdgfr-βcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达pdgfr-β。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、前列腺癌、gist(胃肠道间质瘤)、cml、dfsp(隆突性皮肤纤维肉瘤)或胶质瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ssea-4car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ssea-4。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌或干细胞癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd20car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd20。在一个实施方案中，待治疗的癌症是b细胞恶性肿瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达叶酸受体αcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达叶酸受体α。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、nsclc、子宫内膜癌、肾癌或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达erbb2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达erbb2(her2/neu)。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达muc1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达muc1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达egfrcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达egfr。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤、sclc(小细胞肺癌)、scchn(头颈鳞状细胞癌)、nsclc或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ncamcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ncam。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达caixcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达caix。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肾癌、crc、宫颈癌或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达epha2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达epha2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是gbm。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gd3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gd3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达岩藻糖基gm1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达岩藻糖基gm1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达slecar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达sle。在一个实施方案中，待治疗的癌症是nsclc或aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gm3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gm3。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tgs5car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tgs5。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达hmwmaacar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达hmwmaa。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤、成胶质细胞瘤或乳腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达邻-乙酰-gd2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达邻-乙酰-gd2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd19car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是叶酸受体βaml、骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tem1/cd248car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tem1/cd248。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tem7rcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tem7r。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cldn6car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cldn6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、肺癌或乳腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tshrcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tshr。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌或多发性骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gprc5dcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gprc5d。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cxorf61car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cxorf61。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd97car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd97。在一个实施方案中，待治疗的癌症是b细胞恶性肿瘤、胃癌、胰腺癌、食管癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌或结直肠癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd179acar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd179a。在一个实施方案中，待治疗的癌症是b细胞恶性肿瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达alkcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达alk。在一个实施方案中，待治疗的癌症是nsclc、alcl(间变性大细胞淋巴瘤)、imt(炎性肌纤维母细胞瘤)或神经母细胞瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达多聚唾液酸car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达多聚唾液酸。在一个实施方案中，待治疗的癌症是小细胞肺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达plac1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达plac1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是hcc(肝细胞癌)。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达globohcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达globoh。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ny-br-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ny-br-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达upk2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达upk2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是膀胱癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达havcr1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达havcr1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肾癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达adrb3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达adrb3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是尤因瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达panx3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达panx3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是骨肉瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gpr20car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gpr20。在一个实施方案中，待治疗的癌症是gist。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ly6kcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ly6k。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌、卵巢癌或宫颈癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达or51e2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达or51e2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tarpcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tarp。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达wt1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达wt1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ny-eso-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ny-eso-1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达lage-1acar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达lage-1a。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达mage-a1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达mage-a1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达magea1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达magea1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达etv6-amlcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达etv6-aml。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达精子蛋白质17car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达精子蛋白质17。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、hcc或nsclc。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达xage1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达xage1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是尤因瘤或横纹肌癌症(rhabdocancer)。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达tie2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达tie2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达mad-ct-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达mad-ct-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌或黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达mad-ct-2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达mad-ct-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌或黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达fos相关抗原1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达fos相关抗原1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质瘤、鳞状细胞癌或胰腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达p53car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达p53。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达prosteincar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达prostein。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达存活蛋白和端粒酶car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达存活蛋白和端粒酶。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达pcta-1/半乳凝集素8car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达pcta-1/半乳凝集素8。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达melana/mart1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达melana/mart1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ras突变体car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ras突变体。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达p53突变体car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达p53突变体。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达htertcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达htert。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达肉瘤易位断点car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达肉瘤易位断点。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肉瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ml-iapcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ml-iap。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ergcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达erg(tmprss2ets融合基因)。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达na17car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达na17。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达pax3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达pax3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肺泡横纹肌肉瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达雄激素受体car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达雄激素受体。在一个实施方案中，待治疗的癌症是转移性前列腺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达细胞周期蛋白b1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达细胞周期蛋白b1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达mycncar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达mycn。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达rhoccar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达rhoc。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达trp-2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达trp-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cyp1b1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cyp1b1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、结肠癌、肺癌、食管癌、皮肤癌、淋巴结癌症、脑癌或睾丸癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达boriscar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达boris。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肺癌。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达sart3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达sart3。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达pax5car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达pax5。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达oy-tes1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达oy-tes1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达lckcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达lck。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达akap-4car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达akap-4。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ssx2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ssx2。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达rage-1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达rage-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是rcc(肾细胞癌)或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达人端粒酶逆转录酶car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达人端粒酶逆转录酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ru1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ru1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ru2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ru2。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达肠羧基酯酶car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达肠羧基酯酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌、rcc、crc(结直肠癌)、乳腺癌或其他实体瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达prostasecar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达prostase。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达papcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达pap。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达igf-i受体car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达igf-i受体。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gp100car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gp100。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达bcr-ablcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达bcr-abl。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达酪氨酸酶car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达酪氨酸酶。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达岩藻糖基gm1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达岩藻糖基gm1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达muthsp70-2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达muthsp70-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd79acar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd79a。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd79bcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd79b。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd72car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd72。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达lair1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达lair1。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达fcarcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达fcar。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达lilra2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达lilra2。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达cd300lfcar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达cd300lf。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达clec12acar的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达clec12a。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达bst2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达bst2。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达emr2car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达emr2。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达ly75car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ly75。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达gpc3car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达gpc3。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达fcrl5car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达fcrl5。
在一方面，本发明提供通过向有需要的个体提供改造为表达igll1car的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达igll1。
在一方面，本发明涉及用pd1car体内治疗个体，使得癌性肿瘤的生长受抑制。pd1car可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。备选地，pd1car可以与其他car、免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体结合使用。在一个实施方案中，用pd1car和本文所述xcar治疗个体。在一个实施方案中，将pd1car与另一car(例如本文所述car)和激酶抑制剂(例如本文所述激酶抑制剂)结合使用。
在另一方面，提供在个体中治疗(例如减轻或改善)过度增生性病症或障碍(例如癌症)(例如实体瘤、软组织肿瘤或转移性病灶)的方法。本文所用的术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，无论属于哪种组织病理学类型或处于哪个侵染阶段。实体瘤的实例包括多种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤、腺癌和癌)，如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠、泌尿生殖道(例如肾、泌尿道上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。在一个实施方案中，该癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。前述癌症的转移性病灶也可以用本发明的方法和组合物治疗或预防。可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发癌症(包括石棉诱发的那些)及该癌症的组合。转移性癌症(例如表达pd-l1的转移性癌症)(iwai等(2005)int.immunol.17:133-144)的治疗可以用本文所述抗体分子进行。
可抑制其生长的示例性癌症包括通常对免疫治疗有反应的癌症。进行治疗的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，可以用本文所述分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
在一方面，本发明涉及用于在哺乳动物免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)中表达的包含与启动子有效连接的car的载体。在一方面，本发明提供用于治疗表达本文所述癌症相关抗原的癌症的表达本发明的car的重组免疫效应细胞。在一方面，本发明的表达car的细胞能够以表达在其表面的至少一种癌症相关抗原结合肿瘤细胞，使得表达car的细胞靶向癌细胞并抑制癌症生长。
在一方面，本发明涉及抑制癌症生长的方法，其包括使癌症与本发明的表达car的细胞接触，使得cart响应抗原而活化，并靶向癌细胞，其中肿瘤生长被抑制。
在一方面，本发明涉及在个体中治疗癌症的方法。该方法包括对该个体施用本发明的表达car的细胞，使得在该个体中治疗癌症。在一方面，与本文所述癌症相关抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一方面，与本文所述癌症相关抗原的表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如：一种或多种急性白血病，包括但不限于例如b细胞型急性淋巴细胞白血病(“ball”)、t细胞型急性淋巴细胞白血病(“tall”)、急性淋巴细胞白血病(all)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞白血病(cml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)。与本文所述癌症相关抗原的表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡型淋巴瘤、恶性淋巴增生性病症、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、waldenstrom巨球蛋白血症或“白血病前期”(其是通过低效骨髓血细胞产生(或发育不良)联合的各种各样的血液病症)等。此外，与本文所述癌症相关抗原表达相关的疾病包括但不限于例如与本文所述癌症相关抗原的表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病症或增生性疾病。
在一些实施方案中，可以用本发明的表达car的细胞治疗的癌症是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是血液癌症，表征为浆细胞克隆在骨髓中累积。目前用于多发性骨髓瘤的治疗包括但不限于来那度胺治疗，来那度胺是沙利度胺的类似物。通常，通过流式细胞术分析认为骨髓瘤细胞为本文所述癌症相关抗原表达阴性。因此，在一些实施方案中，可以用例如本文所述cd19car来靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，本发明的car治疗可以与一种或多种附加治疗(例如来那度胺治疗)组合。
本发明包括这样一类细胞治疗，其中将免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)遗传修饰为表达嵌合抗原受体(car)，并将表达car的t细胞或nk细胞输注给有需要的受体。所输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体治疗不一样，car修饰的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)能够在体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持续存在。在多种方面，对患者施用的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)或其后代在对患者施用该t细胞或nk细胞后在患者中持续存在至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
本发明还包括一类细胞治疗，其中例如通过体外转录的rna将免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)修饰为瞬时表达嵌合抗原受体(car)，并将cart细胞或nk细胞输注给有需要的受体。所输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在多种方面，对患者施用的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)在对患者施用该t细胞或nk细胞后存在至少1个月，例如3周、2周、1周。
不希望受限于任何具体理论，car修饰的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)所引出的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应，或备选地，可以由直接对间接的免疫反应引起。在一方面，car转导的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)响应表达本文所述癌症相关抗原的人癌细胞而显示特异性促炎症细胞因子分泌和有效的溶细胞活性，抵抗可溶性本文所述癌症相关抗原抑制，介导旁观者杀伤，并介导已建立的人肿瘤的消退。例如，表达本文所述癌症相关抗原的肿瘤的异源区域内的无抗原肿瘤细胞可易于由本文所述癌症相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)间接破坏，该免疫效应细胞之前对邻近抗原阳性癌细胞反应。
在一方面，本发明的全人car修饰的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)可以是用于哺乳动物中的离体免疫和/或体内治疗的一类疫苗。在一方面，该哺乳动物是人。
对于离体免疫，在将该细胞施用入哺乳动物之前在体外发生以下中的至少一项：i)扩增该细胞；ii)将编码car的核酸引入该细胞；或iii)冷冻保存该细胞。
离体方法为本领域公知，并在下文中更充分地讨论。简言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞，并用表达本文公开的car的载体遗传修饰(即体外转导或转染)。然后可对哺乳动物受体施用car修饰的细胞来提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，car修饰的细胞对受体而言可以是自体的。备选地，细胞对受体而言可以是同种异基因的、同种同基因的或异种异基因的。
用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的方法描述于美国专利号5,199,942中，在此引入作为参考，可应用于本发明的细胞。其他适宜的方法为本领域已知，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何具体方法。简言之，免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的离体培养和扩增包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的cd34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这类细胞。除美国专利号5,199,942中所述的细胞生长因子外，可以将其他诸如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配体的因子用于细胞的培养和扩增。
就离体免疫而言，除使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供用于离体免疫来在患者中引出针对抗原的免疫反应的组合物和方法。
通常，按本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。具体而言，本发明的car修饰免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)用于治疗与本文所述癌症相关抗原的表达相关的疾病、障碍和病症。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于发展与本文所述癌症相关抗原的表达相关的疾病、障碍和病症风险的患者。因此，本发明提供用于治疗或预防与本文所述癌症相关抗原的表达相关的疾病、障碍和病症的方法，其包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的car修饰免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)。
在一方面，本发明的表达car的细胞可以用于治疗增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤，或癌前期病症，如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期。此外，与本文所述癌症相关抗原表达相关的疾病包括但不限于例如表达本文所述癌症相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病症或增生性疾病。与本文所述癌症相关抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于自身免疫病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。
本发明的car修饰免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)可以单独施用，或作为与稀释剂和/或与其他成分(如il-1或其他细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物施用。
血液癌症
血液癌症病症是一类影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症，如白血病、淋巴瘤和恶性淋巴增生性病症。
白血病可分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分类为急性髓细胞白血病(aml)和急性淋巴细胞白血病(all)。慢性白血病包括慢性髓细胞白血病(cml)和慢性淋巴细胞白血病(cll)。其他相关病症包括脊髓发育不良综合征(mds，之前称为“白血病前期”)，其是通过低效骨髓血细胞产生(或发育不良)和转化为aml的风险联合的各种各样的血液病症。
淋巴瘤是从淋巴细胞发展的一组血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
本发明提供用于治疗癌症的组合物和方法。在一方面，该癌症是包括但不限于白血病或淋巴瘤的血液癌症。在一方面，本发明的表达car的细胞可以用于治疗癌症和恶性肿瘤，如但不限于，例如，急性白血病，包括但不限于例如b细胞型急性淋巴细胞白血病(“ball”)、t细胞型急性淋巴细胞白血病(“tall”)、急性淋巴细胞白血病(all)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞白血病(cml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)；其他血液癌症或血液病症，包括但不限于例如b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡型淋巴瘤、恶性淋巴增生性病症、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、waldenstrom巨球蛋白血症或“白血病前期”(其是通过低效骨髓血细胞产生(或发育不良)联合的各种各样的血液病症)等。此外，与本文所述癌症相关抗原表达相关的疾病包括但不限于例如表达本文所述癌症相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病症或增生性疾病。
本发明还提供用于抑制表达本文所述癌症相关抗原的细胞群体增殖或减少表达本文所述癌症相关抗原的细胞群体的方法，该方法包括使包含表达本文所述癌症相关抗原的细胞的细胞群体与结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的表达car的t细胞或nk细胞接触。在具体方面，本发明提供用于抑制表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体增殖或减少表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体的方法，该方法包括使表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体与结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的表达car的t细胞或nk细胞接触。在一方面，本发明提供用于抑制表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体增殖或减少表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体的方法，该方法包括使表达本文所述癌症相关抗原的癌细胞群体与结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的表达car的t细胞或nk细胞接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的表达car的t细胞或nk细胞使患有髓细胞白血病或与表达本文所述癌症相关抗原的细胞相关的另一癌症的个体或其动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一方面，该个体是人。
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达本文所述癌症相关抗原的细胞相关的疾病(例如表达本文所述癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)的方法，该方法包括对有需要的个体施用结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的cart细胞或nk细胞。在一方面，该个体是人。与表达本文所述癌症相关抗原的细胞相关的障碍的非限制性实例包括自身免疫障碍(例如狼疮)、炎性障碍(如变态反应和哮喘)和癌症(如表达本文所述癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)。
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达本文所述癌症相关抗原的细胞相关的疾病的方法，该方法包括对有需要的个体施用结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的cart细胞或nk细胞。在一方面，该个体是人。
本发明提供用于预防与表达本文所述癌症相关抗原的细胞相关的癌症复发的方法，该方法包括对有需要的个体施用结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本发明的cart细胞或nk细胞。在一方面，该方法包括，与有效量的另一治疗组合，对有需要的个体施用有效量的结合表达本文所述癌症相关抗原的细胞的本文所述表达car的t细胞或nk细胞。
联合治疗
本文所述表达car的细胞可以与其他已知活性剂和治疗组合使用。本文所用的“组合”施用意指在个体患有障碍的过程期间将两种(或多种)不同治疗递送给该个体，例如在该个体已诊断患有该障碍之后和该障碍已治愈或消除或治疗因其他原因而终止之前递送两种或多种治疗。在一些实施方案中，在开始递送第二种治疗时，一种治疗的递送仍在发生，使得就施用而言存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“并行递送”。在任一种情况的一些实施方案中，治疗由于组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如用更少的第二治疗观察到等同效果，或者第二治疗以比在缺乏第一治疗的情况下施用第二治疗时可观察到的程度更大的程度减轻症状，或用第一治疗观察到类似情况。在一些实施方案中，递送是这样，使得与该障碍相关的症状或其他参数的减轻大于在缺乏另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减轻。两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加。递送可以是这样，使得在递送第二治疗时仍可检测到所递送的第一治疗的效果。
本文所述表达car的细胞和至少一种附加治疗剂可以同时、在相同或分开的组合物中、或顺次施用。对于顺次施用，可以首先施用本文所述表达car的细胞，然后施用附加治疗剂，或者施用顺序可以相反。
car治疗和/或其他治疗剂、方法或方式可以在活动性障碍期间或在缓解或疾病活动性降低期间施用。car治疗可以在另一治疗之前、与该治疗同时、在该治疗后或在该障碍缓解期间施用。
在组合施用时，car治疗和附加活性剂(例如第二或第三活性剂)或全部可以按比单独使用每种活性剂(例如作为单一治疗)的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施方案中，所施用的car治疗、附加活性剂(例如第二或第三活性剂)或全部的量或剂量比单独使用每种活性剂(例如作为单一治疗)的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，产生希望得到的作用(例如癌症的治疗)的car治疗、附加治疗剂(例如第二或第三活性剂)或全部的量或剂量比达到相同治疗作用所需的单独使用每种活性剂(例如作为单一治疗)的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在其他方面，本文所述表达car的细胞可以用于与手术、化疗、放疗、免疫抑制剂(环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体、或其他免疫消融剂(如campath、抗cd3抗体或其他抗体治疗)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子和辐射、肽疫苗(如izumoto等2008jneurosurg108:963-971中所述的肽疫苗)组合的治疗方案。
在一个实施方案中，本文所述表达car的细胞可以与化疗剂组合使用。示例性化疗剂包括蒽环类抗生素(例如多柔比星(doxorubicin)(例如脂质体多柔比星))、长春花生物碱(vincaalkaloid)(例如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春酰胺(vindesine)、长春烯碱(vinorelbine))、烷化剂(例如环磷酰胺、氮烯咪胺(dacarbazine)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如alemtuzamab、gemtuzumab、利妥昔单抗、ofatumumab、tositumomab、brentuximab)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mtor抑制剂、tnfr糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素a(aclacinomycina)、曲霉菌素(gliotoxin)或波替单抗(bortezomib))、免疫调节剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。
考虑用于联合治疗的一般化疗剂包括：阿那曲唑(anastrozole)
示例性烷化剂非限制性地包括氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯：尿嘧啶氮芥(aminouracil
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和/或利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗(fcr)组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有cll。例如，该个体在染色体17短臂中具有缺失(del(17p)，例如在白血病细胞中)。在其他实施方案中，该个体不具有del(17p)。在一些实施方案中，该个体包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在其他实施方案中，该个体不包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在一些实施方案中，氟达拉滨按约10-50mg/m2(例如约10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45或45-50mg/m2)的剂量例如静脉内施用。在一些实施方案中，环磷酰胺按约200-300mg/m2(例如约200-225、225-250、250-275或275-300mg/m2)的剂量例如静脉内施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按约400-600mg/m2(例如400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)的剂量例如静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与苯达莫司汀和利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有cll。例如，该个体在染色体17短臂中具有缺失(del(17p)，例如在白血病细胞中)。在其他实施方案中，该个体不具有del(17p)。在一些实施方案中，该个体包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在其他实施方案中，该个体不包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在一些实施方案中，苯达莫司汀按约70-110mg/m2(例如70-80、80-90、90-100或100-110mg/m2)的剂量例如静脉内施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按约400-600mg/m2(例如400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)的剂量例如静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和/或糖皮质激素(例如泼尼松(prednisone))组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(r-chop)组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。在一些实施方案中，该个体患有非大体积限制阶段dlbcl(例如包含大小/直径小于7cm的肿瘤)。在一些实施方案中，该个体用放疗与r-chop组合治疗。例如，该个体施用r-chop(例如1-6个循环，例如1、2、3、4、5或6个循环的r-chop)，然后放疗。在一些情况下，该个体在放疗后施用r-chop(例如1-6个循环，例如1、2、3、4、5或6个循环的r-chop)。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和利妥昔单抗(epoch-r)组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与剂量调整的epoch-r(da-epoch-r)组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有b细胞淋巴瘤，例如myc重排侵袭性b细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与利妥昔单抗和/或来那度胺组合对个体施用。来那度胺((rs)-3-(4-氨基-1-氧1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)是免疫调节剂。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与利妥昔单抗和来那度胺组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有滤泡型淋巴瘤(fl)或套细胞淋巴瘤(mcl)。在一些实施方案中，该个体患有fl，且之前未用癌症治疗治疗过。在一些实施方案中，来那度胺按约10-20mg(例如10-15或15-20mg)的剂量比如每天施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量例如静脉内施用。
示例性mtor抑制剂包括例如：temsirolimus；ridaforolimus(正式名称为deferolimus，(1r,2r,4s)-4-[(2r)-2[(1r,9s,12s,15r,16e,18r,19r,21r,23s,24e,26e,28z,30s,32s,35r)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二噁-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基亚磷酸盐，也称为ap23573和mk8669，描述于pct公开号wo03/064383中)；依维莫司(everolimus)(
示例性免疫调节剂包括例如：afutuzumab(可获自
示例性蒽环类抗生素包括例如：多柔比星(
示例性长春花生物碱包括例如酒石酸长春烯碱
示例性蛋白酶体抑制剂包括：波替单抗
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与brentuximab组合对个体施用。brentuximab是抗cd30抗体和单甲基auristatine的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，该个体患有霍奇金淋巴瘤(hl)，例如复发性或难治性hl。在一些实施方案中，该个体患有cd30+hl。在一些实施方案中，该个体经历了自体干细胞移植(asct)。在一些实施方案中，该个体未经历过asct。在一些实施方案中，brentuximab例如每3周按约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)的剂量例如静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与brentuximab和氮烯咪胺组合或与brentuximab和苯达莫司汀组合对个体施用。氮烯咪胺是化学名为5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-羧酰胺的烷化剂。苯达莫司汀是化学名为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷化剂。在一些实施方案中，该个体患有非霍奇金淋巴瘤(hl)。在一些实施方案中，该个体之前未用癌症治疗治疗过。在一些实施方案中，该个体年龄至少60岁，例如60、65、70、75、80、85岁或更老。在一些实施方案中，氮烯咪胺按约300-450mg/m2(例如约300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)的剂量例如静脉内施用。在一些实施方案中，苯达莫司汀按约75-125mg/m2(例如75-100或100-125mg/m2，例如约90mg/m2)的剂量例如静脉内施用。在一些实施方案中，brentuximab例如每3周按约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)的剂量例如静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与cd20抑制剂(例如，抗cd20抗体(例如抗cd20单特异性或双特异性抗体)或其片段)组合对个体施用。示例性抗cd20抗体包括但不限于利妥昔单抗、ofatumumab、ocrelizumab、veltuzumab、obinutuzumab、tru-015(trubionpharmaceuticals)、ocaratuzumab和pro131921(genentech)。参见例如lim等haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，该抗cd20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是结合cd20并导致表达cd20的细胞裂解的嵌合小鼠/人单克隆抗体igg1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有cll或sll。
在一些实施方案中，利妥昔单抗静脉内(例如静脉内输注)施用。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如约500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施方案中，利妥昔单抗按150mg/m2至750mg/m2，例如约150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2的剂量施用，其中m2表示个体的体表面积。在一些实施方案中，利妥昔单抗按至少4天(例如4、7、14、21、28、35天或更长)的给要间隔施用。例如，利妥昔单抗按至少0.5周(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周或更长)的间隔施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按本文所述剂量和给药间隔施用例如至少2周(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长)的时期。例如，利妥昔单抗按本文所述剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至少4个剂量(例如每个治疗周期至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个剂量)。
在一些实施方案中，抗cd20抗体包含ofatumumab。ofatumumab是分子量约为149kda的抗cd20igg1κ人单克隆抗体。例如，用转基因小鼠和杂交瘤技术产生ofatumumab，并从重组鼠细胞系(ns0)表达和纯化。参见例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；及临床试验识别号nct01363128、nct01515176,nct01626352和nct01397591。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与ofatumumab组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有cll或sll。
在一些实施方案中，ofatumumab作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)ofatumumab。在一些实施方案中，ofatumumab按约300mg的起始剂量、然后按2000mg的剂量(例如约11个剂量)施用例如24周。在一些实施方案中，ofatumumab按至少约4天(例如4、7、14、21、28、35天或更长)的给要间隔施用。例如，ofatumumab按至少1周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长)的给要间隔施用。在一些实施方案中，ofatumumab按本文所述剂量和给要间隔施用例如至少1周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更长，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长，或1、2、3、4、5年或更长)的时期。例如，ofatumumab按本文所述剂量和给要间隔施用每个治疗周期总计至少2个剂量(例如每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20或更多个剂量)。
在一些情况下，抗cd20抗体包含ocrelizumab。ocrelizumab是例如临床试验识别号nct00077870、nct01412333、nct00779220、nct00673920、nct01194570及kappos等lancet.19.378(2011):1779-87中所述的人源化抗cd20单克隆抗体。
在一些情况下，抗cd20抗体包含veltuzumab。veltuzumab是人源化抗cd20单克隆抗体。参见例如临床试验识别号nct00547066、nct00546793、nct01101581及goldenberg等leuklymphoma.51(5)(2010):747-55。
在一些情况下，抗cd20抗体包含ga101。ga101(也称为obinutuzumab或ro5072759)是人源化和糖改造的抗cd20单克隆抗体。参见例如robak.curr.opin.investig.drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号nct01995669、nct01889797、nct02229422和nct01414205；及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况下，抗cd20抗体包含ame-133v。ame-133v(也称为ly2469298或ocaratuzumab)是抗cd20人源化igg1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，对fcγriiia受体的亲和力提高，依赖抗体的细胞毒性(adcc)活性增强。参见例如robak等biodrugs25.1(2011):13-25；和forero-torres等clincancerres.18.5(2012):1395-403。
在一些情况下，抗cd20抗体包含pro131921。pro131921是改造为与利妥昔单抗相比具有更好的与fcγriiia的结合和增强的adcc的人源化抗cd20单克隆抗体。参见例如robak等biodrugs25.1(2011):13-25；和casulo等clinimmunol.154.1(2014):37-46；及临床试验识别号nct00452127。
在一些情况下，抗cd20抗体包含tru-015。tru-015是衍生自抗cd20抗体结构域的抗cd20融合蛋白质。tru-015比单克隆抗体小，但保留fc介导的效应子功能。参见例如robak等biodrugs25.1(2011):13-25。tru-015包含与人igg1铰链、ch2和ch3结构域连接的抗cd20单链可变片段(scfv)，但缺乏ch1和cl结构域。
在一些实施方案中，本文所述抗cd20抗体缀合或以其他方式结合至治疗剂，例如化疗剂(例如环磷酰胺、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、疼痛缓解剂或本文所述冷冻保护剂。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与b细胞淋巴瘤2(bcl-2)抑制剂(例如venetoclax，也称为abt-199或gdc-0199)和/或利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与venetoclax和利妥昔单抗组合对个体施用。venetoclax是抑制抗凋亡蛋白bcl-2的小分子。下文显示venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-n-({3-硝基-4-[(四氢-2h-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧)苯甲酰胺)的结构。
在一些实施方案中，该个体患有cll。在一些实施方案中，该个体含有复发性cll，例如该个体之前施用过癌症治疗。在一些实施方案中，venetoclax按约15-600mg(例如15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-600mg)的剂量例如每天施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗例如每月按约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量例如静脉内施用。
在一个实施方案中，本文所述表达car的细胞与减少treg细胞群体的分子组合对个体施用。减少treg细胞数目(例如排除)的方法文本领域已知，且包括例如cd25排除、环磷酰胺施用、调节gitr功能。不希望受限于理论，认为在单采血液成分术之前或在施用本文所述表达car的细胞之前降低个体中treg细胞数目可减少肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如treg)的数目)，并可降低个体复发的风险。在一个实施方案中，本文所述表达car的细胞与靶向gitr和/或调节gitr功能的分子(如gitr激动剂和/或排除调节t细胞(treg)的gitr抗体)组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与环磷酰胺组合对个体施用。在一个实施方案中，在施用表达car的细胞之前施用gitr结合分子和/或调节gitr功能的分子(例如gitr激动剂和/或排除treg的gitr抗体)。例如，在一个实施方案中，可以在单采血液细胞之前施用gitr激动剂。在一些实施方案中，在施用(例如输注或再输注)表达car的细胞之前或在单采血液细胞之前对个体施用环磷酰胺。在一些实施方案中，在施用(例如输注或再输注)表达car的细胞之前或在单采血液细胞之前对个体施用环磷酰胺和抗gitr抗体。在一个实施方案中，该个体患有癌症(例如实体癌症或血液癌症，如all或cll)。在一个实施方案中，该个体患有cll。在一些实施方案中，该个体患有all。在一些实施方案中，该个体患有实体癌症，例如本文所述实体癌症。示例性gitr激动剂包括例如gitr融合蛋白质和抗gitr抗体(例如二价抗gitr抗体)，如例如美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505b1、美国专利号8,586,023、pct公开号wo2010/003118和2011/090754中所述的gitr融合蛋白质，或例如美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183b1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号ep1866339、pct公开号wo2011/028683、pct公开号wo2013/039954、pct公开号wo2005/007190、pct公开号wo2007/133822、pct公开号wo2005/055808、pct公开号wo99/40196、pct公开号wo2001/03720、pct公开号wo99/20758、pct公开号wo2006/083289、pct公开号wo2005/115451、美国专利号7,618,632和pct公开号wo2011/051726中所述的抗gitr抗体。
在一个实施方案中，本文所述表达car的细胞与mtor抑制剂(例如本文所述mtor抑制剂，例如雷帕霉素类似物，如依维莫司)组合对个体施用。在一个实施方案中，该mtor抑制剂在表达car的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，该mtor抑制剂可以在单采血液细胞之前施用。在一个实施方案中，该个体患有cll。
在一个实施方案中，本文所述表达car的细胞与gitr激动剂(例如本文所述gitr激动剂)组合对个体施用。在一个实施方案中，该gitr激动剂在表达car的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，该gitr激动剂可以在单采血液细胞之前施用。在一个实施方案中，该个体患有cll。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是cdk4抑制剂，例如本文所述cdk4抑制剂，例如cd4/6抑制剂，例如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8h-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮,盐酸(也称为palbociclib或pd0332991)。在一个实施方案中，该激酶抑制剂是btk抑制剂，例如本文所述btk抑制剂，例如ibrutinib。在一个实施方案中，该激酶抑制剂是mtor抑制剂，例如本文所述mtor抑制剂，如雷帕霉素、雷帕霉素类似物、osi-027。该mtor抑制剂可以是例如mtorc1抑制剂和/或mtorc2抑制剂，例如本文所述mtorc1抑制剂和/或mtorc2抑制剂。在一个实施方案中，该激酶抑制剂是mnk抑制剂，例如本文所述mnk抑制剂，如4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。该mnk抑制剂可以是例如mnk1a、mnk1b、mnk2a和/或mnk2b抑制剂。在一个实施方案中，该激酶抑制剂是本文所述双重pi3k/mtor抑制剂，例如pf-04695102。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是选自以下的cdk4抑制剂：aloisinea；flavopiridol或hmr-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3s,4r)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-chromenone；crizotinib(pf-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2r,3s)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4h-1-苯并吡喃-4-酮,盐酸(p276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1h-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-n-[4-(三氟甲基)苯基]-1h-苯并咪唑-2-胺(raf265)；indisulam(e7070)；roscovitine(cyc202)；palbociclib(pd0332991)；dinaciclib(sch727965)；n-[5-[[(5-叔-丁基噁唑-2-基)甲基]硫]噻唑-2-基]哌啶-4-羧酰胺(bms387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(mln8054)；5-[3-(4,6-二氟-1h-苯并咪唑-2-基)-1h-吲哚-5-基]-n-乙基-4-甲基-3-吡啶甲烷胺(ag-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰胺基)-1h-吡唑-3-羧酸n-(哌啶-4-基)酰胺(at7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1h-咪唑-5-基]-n-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(azd5438)；和xl281(bms908662)。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是cdk4抑制剂，例如palbociclib(pd0332991)，palbociclib按约每天50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量施用一定时期，例如，28天周期中的14-21天每天施用，或21天周期中的7-12天每天施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的palbociclib。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)4或6抑制剂(例如本文所述cdk4抑制剂或cdk6抑制剂)组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与cdk4/6抑制剂(例如靶向cdk4和cdk6二者的抑制剂)(例如本文所述cdk4/6抑制剂)组合对个体施用。在一个实施方案中，该个体患有mcl。mcl是对目前可用的治疗反应性弱(即基本不可治愈)的侵袭性癌症。在许多mlc病例中，细胞周期蛋白d1(cdk4/6的调节物)在mcl细胞中表达(例如，由于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白d1基因的染色体易位)。因此，不受限于理论，认为mcl细胞对具有高特异性(即对正常免疫细胞的影响最小)的cdk4/6抑制高度敏感。cdk4/6抑制剂单独在治疗mcl中有一些功效，但仅达到部分缓解，复发率高。示例性cdk4/6抑制剂是lee011(也称为ribociclib)，下文显示其结构。
不受限于理论，例如与cdk4/6抑制剂单独相比，认为随cdk4/6抑制剂(例如本文所述lee011或其他cdk4/6抑制剂)施用本文所述表达car的细胞可达到更高反应性，例如更高缓解率和/或更低复发率。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是选自ibrutinib(pci-32765)、gdc-0834、rn-486、cgi-560、cgi-1764、hm-71224、cc-292、ono-4059、cnx-774和lfm-a13的btk抑制剂。在优选实施方案中，该btk抑制剂不降低或抑制白介素-2诱导性激酶(itk)的激酶活性，且选自gdc-0834、rn-486、cgi-560、cgi-1764、hm-71224、cc-292、ono-4059、cnx-774和lfm-a13。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是btk抑制剂，例如ibrutinib(pci-32765)。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与btk抑制剂(例如ibrutinib)组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与ibrutinib(也称为pci-32765)组合对个体施用。下文显示ibrutinib(1-[(3r)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构。
在一些实施方案中，该个体患有cll、套细胞淋巴瘤(mcl)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)。例如，该个体在染色体17短臂中具有缺失(del(17p)，例如在白血病细胞中)。在其他实例中，该个体不具有del(17p)。在一些实施方案中，该个体患有复发性cll或sll，例如该个体之前施用过癌症治疗(例如之前施用过一种、两种、三种或四种先前的癌症治疗)。在一些实施方案中，该个体患有难治性cll或sll。在其他实施方案中，该个体患有滤泡型淋巴瘤，例如复发性或难治性滤泡型淋巴瘤。在一些实施方案中，ibrutinib按约300-600mg/天(例如约300-350、350-400、400-450、450-500、500-550或550-600mg/天，例如约420mg/天或约560mg/天)的剂量例如口服施用。在一些实施方案中，ibrutinib按约每天250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如250mg、420mg或560mg)的剂量施用一定时期，例如，21天周期每天施用，或28天周期每天施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的ibrutinib。不受限于理论，认为ibrutinib的加入增强了t细胞增殖反应，且可使t细胞从t辅助2(th2)转换为t辅助1(th1)表型。th1和th2是辅助t细胞的表型，th1对th2指导不同免疫反应途径。th1表型与促炎症反应相关，例如用于杀伤细胞，如胞内病原体/病毒或癌细胞，或保持自身免疫反应。th2表型与嗜酸性粒细胞累积和抗炎症反应相关。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是选自以下的mtor抑制剂：temsirolimus；ridaforolimus(1r,2r,4s)-4-[(2r)-2[(1r,9s,12s,15r,16e,18r,19r,21r,23s,24e,26e,28z,30s,32s,35r)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二噁-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基亚磷酸盐，也称为ap23573和mk8669；依维莫司(rad001)；雷帕霉素(ay22989)；simapimod；(5-{2,4-双[(3s)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(azd8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(pf04691502)；及n2-[1,4-二氧-4-[[4-(4-氧-8-苯基-4h-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-l-精氨酰甘氨酰-l-α-天冬氨酰l-丝氨酸-,内盐(sf1126)(seqidno:1262)和xl765。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是mtor抑制剂，例如雷帕霉素，且雷帕霉素按约每天3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量施用一定时期，例如21天周期每天施用，或28天周期每天施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，该激酶抑制剂是mtor抑制剂，例如依维莫司，且依维莫司按约每天2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量施用一定时期，例如28天周期每天施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是选自cgp052088、4-氨基-3-(p-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(cgp57380)、cercosporamide、etc-1780445-2和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶的mnk抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)抑制剂(例如本文所述pi3k抑制剂，例如idelalisib或duvelisib)和/或利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与idelalisib和利妥昔单抗组合对个体施用。在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合对个体施用。idelalisib(也称为gs-1101或cal-101；gilead)是阻断pi3k的δ同种型的小分子。下文显示idelalisib(5-氟-3-苯基-2-[(1s)-1-(7h-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3h)-喹唑啉酮)的结构。
duvelisib(也称为ipi-145；infinitypharmaceuticalsandabbvie)是阻断pi3k-δ、γ的小分子。下文显示duvelisib(8-氯-2-苯基-3-[(1s)-1-(9h-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2h)-异喹啉铜)的结构。
在一些实施方案中，该个体患有cll。在一些实施方案中，该个体患有复发性cll，例如该个体之前施用过癌症治疗(例如之前施用过抗cd20抗体或之前施用过ibrutinib)。例如，该个体在染色体17短臂中具有缺失(del(17p)，例如在白血病细胞中)。在其他实例中，该个体不具有del(17p)。在一个实施方案中，该个体包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在其他实施方案中，该个体不包含在免疫球蛋白重链可变区(igvh)基因中含有突变的白血病细胞。在一些实施方案中，该个体在染色体11长臂中具有缺失(del(11q))。在其他实施方案中，该个体不具有del(11q)。在一些实施方案中，idelalisib按约100-400mg(例如100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375或375-400mg)的剂量例如bid施用。在一些实施方案中，duvelisib按约15-100mg(例如约15-25、25-50、50-75、or75-100mg)的剂量例如每天两次施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量例如静脉内施用。
在一个实施方案中，该激酶抑制剂是选自以下的双重磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)和mtor抑制剂：2-氨基-8-[反式-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(pf-04691502)；n-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-n'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(pf-05212384,pki-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(bez-235)；apitolisib(gdc-0980,rg7422)；2,4-二氟-n-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(gsk2126458)；8-(6-甲氧吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3h)-酮马来酸(nvp-bgt226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]氟[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(pi-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9h-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(vs-5584,sb2343)；和n-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹噁啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(xl765)。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂组合对个体施用。示例性alk激酶包括但不限于crizotinib(pfizer)、ceritinib(novartis)、alectinib(chugai)、brigatinib(也称为ap26113；ariad)、entrectinib(ignyta)、pf-06463922(pfizer)、tsr-011(tesaro)(参见例如临床试验识别号nct02048488)、cep-37440(teva)和x-396(xcovery)。在一些实施方案中，该个体患有实体癌症，例如本文所述实体癌症，例如肺癌。
crizotinib的化学名称是3-[(1r)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。ceritinib的化学名称是5-氯-n2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-n4-[2-(异丙磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶胺。alectinib的化学名称是9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧-6,11-二氢-5h-苯并[b]咔唑-3-腈。brigatinib的化学名称是5-氯-n2-{4-[4-(二甲氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧苯基}-n4-[2-(二甲磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶胺。entrectinib的化学名称是n-(5-(3,5-二氟苄基)-1h-吲哚-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2h-吡喃-4-基)氨基)苯甲酰胺。pf-06463922的化学名称是(10r)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(metheno)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并噁二氮杂环十四胺-3-腈。cep-37440的化学名称是(s)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-n-甲基苯甲酰胺。x-396的化学名称是(r)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-n-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-羧酰胺。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号发放重要的p70s6激酶(雷帕霉素)的药物(liu等,cell66:807-815,1991；henderson等,immun.73:316-321,1991；bierer等,curr.opin.immun.5:763-773,1993)。在另一方面，本发明的细胞组合物可以与骨髓移植、t细胞消融治疗(使用化疗剂(如氟达拉滨)、外部光束放疗(xrt)、环磷酰胺和/或抗体(如okt3或campath))结合(例如之前、同时或之后)对患者施用。在一方面，本发明的细胞组合物在b细胞消融治疗(如与cd20反应的活性剂，例如rituxan)后施用。例如，在一个实施方案中，个体可以进行高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，移植后，个体接受本发明的扩增的免疫细胞输注。在另一实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)抑制剂组合对个体施用。ido是催化氨基酸l-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过量表达ido，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。pdc、巨噬细胞和树突细胞(dc)可以表达ido。不受限于理论，认为l-色氨酸的减少(例如由ido催化)通过诱导t细胞无反应性和凋亡导致免疫抑制环境。因此，不受限于理论，认为ido抑制剂可以例如通过减少表达car的免疫细胞的抑制或死亡来增强本文所述表达car的细胞的功效。在一些实施方案中，该个体患有实体瘤，例如本文所述实体瘤，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。示例性ido抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、indoximod(newlinkgenetics)(参见例如临床试验识别号nct01191216、nct01792050)和incb024360(incytecorp.)(参见例如临床试验识别号nct01604889、nct01685255)。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与骨髓来源抑制细胞(mdsc)的调节物组合对个体施用。mdsc累积在许多实体瘤的外周和肿瘤部位。这些细胞抑制t细胞反应，从而妨碍表达car的细胞治疗的功效。不受限于理论，认为mdsc调节物的施用增强本文所述表达car的细胞的功效。在一个实施方案中，该个体患有实体瘤，例如本文所述实体瘤，例如成胶质细胞瘤。示例性mdsc调节物包括但不限于mcs110和blz945。mcs110是抗巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的单克隆抗体(mab)。参见例如临床试验识别号nct00757757。blz945是集落刺激因子1受体(csf1r)的小分子抑制剂。参见例如pyonteck等nat.med.19(2013):1264-72。下文显示blz945的结构。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与cd19cart细胞(例如ctl019，例如，如wo2012/079000中所述，在此引入作为参考)组合对个体施用。在一些实施方案中，该个体患有cd19+淋巴瘤，例如cd19+非霍奇金淋巴瘤(nhl)、cd19+fl或cd19+dlbcl。在一些实施方案中，该个体患有复发性或难治性cd19+淋巴瘤。在一些实施方案中，在施用(例如输注)cd19cart细胞之前、与之同时、或之后对个体施用淋巴细胞排除化疗。在一个实例中，在施用cd19cart细胞之前对个体施用淋巴细胞排除化疗。例如，淋巴细胞排除化疗在cd19cart细胞输注之前1-4天(例如1、2、3或4天)结束。在一些实施方案中，例如按本所述施用多个剂量的cd19cart细胞。例如，单个剂量包含约5x108cd19cart细胞。在一些实施方案中，在施用(例如输注)本文所述表达car的细胞(例如表达非cd19car的细胞)之前、与之同时、或之后对个体施用淋巴细胞排除化疗。在一些实施方案中，在一些实施方案中，在施用(例如输注)表达非cd19car的细胞(例如本文所述表达非cd19car的细胞)之前、与之同时、或之后对个体施用cd19cart。
在一些实施方案中，本文所述表达car的细胞与白介素-15(il-15)多肽、白介素-15受体α(il-15ra)多肽或il-15多肽和il-15ra多肽二者的组合(例如hetil-15(admunetherapeutics,llc))组合对个体施用。hetil-15是il-15和il-15ra的异二聚体非共价复合物。hetil-15描述于例如u.s.8,124,084、u.s.2012/0177598、u.s.2009/0082299、u.s.2012/0141413和u.s.2011/0081311中，在此引入作为参考。在一些实施方案中，hetil-15皮下施用。在一些实施方案中，该个体患有癌症，例如实体癌症，例如黑素瘤或结肠癌。在一些实施方案中，该个体患有转移性癌症。
在一个实施方案中，该个体可以施用减少或改善与施用表达car的细胞相关的副作用的活性剂。与施用表达car的细胞相关的副作用包括但不限于crs和噬红细胞淋巴组织细胞增生症(hlh)，也称为巨噬细胞活化综合征(mas)。crs的症状包括高烧、恶心、瞬时低血压、缺氧等。crs可包括临床全身性病征和症状，如发烧、疲劳、食欲缺乏、肌肉疼痛、关节痛、恶心、呕吐和头痛。crs可包括临床皮肤病征和症状，如皮疹。crs可包括临床胃肠病征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。crs可包括临床呼吸病征和症状，如呼吸急促和血氧过少。crs可包括临床心血管病征和症状，如心动过速、脉压宽、低血压、心输出量增加(早期)和心输出量潜在减少(晚期)。crs可包括临床血凝病征和症状，如d-二聚体升高、血纤维蛋白原过少伴随或不伴随出血。crs可包括临床肾病征和症状，如氮质血症。crs可包括临床肝病征和症状，如转氨酶升高和高胆红素血症。crs可包括临床神经病征和症状，如头痛、精神状态变化、意识错乱、谵妄、唤词困难或frank失语、幻觉、震颤、辨距障碍、步态改变和癫痫发作。
因此，本文所述方法可包括对个体施用本文所述表达car的细胞和进一步施用一种或多种活性剂，以管理用表达car的细胞治疗引起的可溶性因子水平提高。在一个实施方案中，个体中提高的可溶性因子是ifn-γ、tnfα、il-2和il-6中的一种或多种。在一个实施方案中，个体中提高的可溶性因子是il-1、gm-csf、il-10、il-8、il-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，施用来治疗此副作用的活性剂可以是中和一种或多种这些可溶性因子的活性剂。在一个实施方案中，中和一种或多种这些可溶性形式的活性剂是抗体或其抗原结合片段。这类活性剂的实例包括但不限于类固醇(例如糖皮质激素)、tnfα抑制剂和il-6抑制剂。tnfα抑制剂的实例是抗tnfα抗体分子，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab)。tnfα抑制剂的另一实例是融合蛋白质，如依那西普(entanercept)。tnfα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可豆碱)和安非他酮(bupropion)。il-6抑制剂的实例是抗il-6抗体分子或抗il-6受体抗体分子，如托珠单抗(tocilizumab)(toc)、sarilumab、elsilimomab、cnto328、ald518/bms-945429、cnto136、cpsi-2364、cdp6038、vx30、argx-109、fe301和fm101。在一个实施方案中，该抗il-6受体抗体分子是托珠单抗。基于il-1r的抑制剂的实例是阿那白滞素(anakinra)。
在一个实施方案中，该个体可以施用增强表达car的细胞的活性的活性剂。例如，在一个实施方案中，该活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如程序性死亡1(pd-1))可降低表达car的细胞引起免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfβ。抑制性分子的抑制(例如通过在dna、rna或蛋白质水平抑制)可以优化表达car的细胞的性能。在一些实施方案中，可以使用例如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna，规律成簇间隔短回文重复(crispr)，转录激活因子样效应核酸酶(talen)，或锌指核酸酶(zfn)，来抑制表达car的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，该抑制剂是shrna。在一个实施方案中，该抑制性分子在表达car的细胞内受抑制。在这些实施方案中，将抑制抑制性分子表达的dsrna连接至编码car的成分(例如所有成分)的核酸。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，该活性剂可以是结合pd-1、pd-l1、pd-l2或ctla4的抗体或抗体片段(例如伊匹单抗(ipilimumab)(也称为mdx-010和mdx-101，作为
pd1是还包括cd28、ctla-4、icos和btla的cd28家族受体的抑制性成员。pd1表达在活化的b细胞、t细胞和骨髓细胞上(agata等1996int.immunol8:765-75)。已显示pd1的两个配体pd-l1和pd-l2在结合pd1时下调t细胞活化(freeman等2000jexpmed192:1027-34；latchman等2001natimmunol2:261-8；carter等2002eurjimmunol32:634-43)。pd-l1在人癌症中丰度高(dong等2003jmolmed81:281-7；blank等2005cancerimmunol.immunother54:307-314；konishi等2004clincancerres10:5094)。可通过抑制pd1与pd-l1的局部相互作用来逆转免疫抑制。pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体、抗体片段和其他抑制剂在本领域中可得，且可以与本文所述本发明的car组合使用。例如，nivolumab也称为bms-936558或mdx1106；bristol-myerssquibb)是特异性阻断pd-1的全人igg4单克隆抗体。nivolumab(克隆5c4)和其他特异性结合pd-1的人单克隆抗体公开于us8,008,449和wo2006/121168中。pidilizumab(ct-011；curetech)是结合pd-1的人源化igg1k单克隆抗体。pidilizumab和其他人源化抗pd-1单克隆抗体公开于wo2009/101611中。pembrolizumab(之前称为lambrolizumab，也称为mk03475；merck)是结合pd-1的人源化igg4单克隆抗体。pembrolizumab和其他人源化抗pd-1抗体公开于us8,354,509和wo2009/114335中。medi4736(medimmune)是结合pd-1并抑制配体与pd-1相互作用的人单克隆抗体。mdpl3280a(genentech/roche)是结合pd-l1的人fc优化igg1单克隆抗体。mdpl3280a和其他抗pd-l1人单克隆抗体公开于美国专利号7,943,743美国公开号20120039906中。其他抗pd-l1结合剂包括yw243.55.s70(重链和轻链可变区显示在wo2010/077634中的seqidno20和21中)和mdx-1105(也称为bms-936559，例如wo2007/005874中公开的的抗pd-l1结合剂)。amp-224(b7-dcig；amplimmune；例如公开于wo2010/027827和wo2011/066342中)是阻断pd-1和b7-h1间相互作用的pd-l2fc融合可溶性受体。其他抗pd-1抗体包括amp514(amplimmune)等，例如us8,609,089、us2010028330和/或us20120114649中公开的抗pd-1抗体。
tim-3(t细胞免疫球蛋白-3)也负调t细胞功能，尤其是在分泌ifn-g的cd4+t辅助1和cd8+t细胞毒性1细胞中，在t细胞耗竭中发挥重要作用。抑制tim3和其配体(例如半乳凝集素-9(gal9)、磷酯酰丝氨酸(ps)和hmgb1)间的相互作用可提高免疫反应。tim3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂在本领域中可得，且可与本文所述cd19car组合使用。例如，靶向tim3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂结合tim3的igv结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制tim3的抗体和肽公开于wo2013/006490和us20100247521中。其他抗tim3抗体包括rmt3-23的人源化形式(公开于ngiow等,2011,cancerres,71:3540-3551中)和克隆8b.2c12(公开于monney等,2002,nature,415:536-541中)。抑制tim3和pd-1的双特异性抗体公开于us20130156774中。
在其他实施方案中，增强表达car的细胞的活性的活性剂是ceacam抑制剂(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5抑制剂)。在一个实施方案中，ceacam抑制剂是抗ceacam抗体分子。示例性抗ceacam-1抗体公开于wo2010/125571、wo2013/082366、wo2014/059251和wo2014/022332中，例如公开于例如us2004/0047858、us7,132,255和wo99/052552中的单克隆抗体34b1、26h7和5f4或其重组形式。在其他实施方案中，抗ceacam抗体结合例如zheng等plosone.2010sep2；5(9).pii:e12529(doi:10:1371/journal.pone.0021146)中所述的ceacam-5，或与例如wo2013/054331和us2014/0271618中所述ceacam-1和ceacam-5交叉反应。
不希望受限于理论，认为癌胚抗原细胞黏附分子(ceacam)(如ceacam-1和ceacam-5)至少部分介导抗肿瘤免疫反应的抑制(参见例如markel等jimmunol.2002年3月15日；168(6):2803-10；markel等jimmunol.2006年11月1日；177(9):6062-71；markel等immunology.2009年2月；126(2):186-200；markel等cancerimmunolimmunother.2010年2月；59(2):215-30；ortenberg等molcancerther.2012年6月；11(6):1300-10；stern等jimmunol.2005年6月1日；174(11):6692-701；zheng等plosone.2010年9月2日；5(9).pii:e12529)。例如，已将ceacam-1描述为tim3的异嗜性配体，在tim-3介导的t细胞耐受和耗竭中发挥作用(参见例如wo2014/022332；huang等(2014)naturedoi:10.1038/nature13848)。在一些实施方案中，已在异种移植结直肠癌模型中显示共阻断ceacam-1和tim-3增强抗肿瘤免疫反应(参见例如wo2014/022332；huang等(2014),上文)。在其他实施方案中，如例如wo2014/059251中所述，共阻断ceacam-1和pd-1降低t细胞耐受。因此，ceacam抑制剂可与本文所述其他免疫调节剂(例如抗pd-1和/或抗tim-3抑制剂)一起使用以增强针对癌症(例如黑素瘤、肺癌(例如nsclc)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌和本文所述其他癌症)的免疫反应。
lag-3(淋巴细胞活化基因-3或cd223)是已显示在cd8+t细胞耗竭中发挥作用的表达在活化t细胞和b细胞上的细胞表面分子。lag-3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂在本领域可得，且可与本文所述cd19car组合使用。例如，bms-986016(bristol-myerssquib)是靶向lag3的单克隆抗体。imp701(immutep)是拮抗性lag-3抗体，imp731(immutep和glaxosmithkline)是排除性lag-3抗体。其他lag-3抑制剂包括imp321(immutep)，其是lag3的可溶性部分与结合ii类mhc分子并活化抗原呈递细胞(apc)的ig的重组融合蛋白。其他抗体公开于例如wo2010/019570中。
在一些实施方案中，增强表达car的细胞的活性的活性剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白质，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如含有本文所述胞内信号发放结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可以包括cd28、cd27、icos的共刺激结构域，例如cd28、cd27和/或icos的胞内信号发放结构域，和/或例如cd3ζ的主信号发放结构域(例如本文所述)。在一个实施方案中，该融合蛋白质由表达car的同一细胞表达。在另一实施方案中，该融合蛋白质由不表达本发明的car的细胞(例如t细胞)表达。
在一个实施方案中，增强本文所述表达car的细胞的活性的活性剂是mir-17-92。
在一个实施方案中，增强本文所述car的活性的活性剂是细胞因子。细胞因子具有与t细胞扩增、分化、存活和稳态相关的重要功能。可以对接受本文所述表达car的细胞的个体施用的细胞因子包括：il-2、il-4、il-7、il-9、il-15、il-18和il-21，或其组合。在优选实施方案中，所施用的细胞因子是il-7、il-15或il-21，或其组合。细胞因子可以每天一次或每天一次以上(例如每天两次、每天三次或每天四次)施用。细胞因子可以施用一天以上，例如施用细胞因子2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，细胞因子每天一次施用，施用7天。
在一些实施方案中，细胞因子与表达car的t细胞组合施用。细胞因子可以与表达car的t细胞同时或并行施用，例如在同一天施用。细胞因此可以配制在与表达car的t细胞相同的药物组合物中，或者可以配制在分开的药物组合物中。备选地，细胞因子可以在施用表达car的t细胞后马上施用，例如在施用表达car的细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用。在发生在超过一天内的给药方案中施用细胞因子的实施方案中，细胞因子给药方案的第一天可以与施用表达car的t细胞在同一天，或者细胞因子给药方案的第一天可以是施用表达car的t细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方案中，在第一天，对个体施用表达car的t细胞，在第二天，在随后7天每天一次施用细胞因子。在优选实施方案中，待与表达car的t细胞组合施用的细胞因子是il-7、il-15或il-21。
在其他实施方案中，在施用表达car的细胞后一定时期施用细胞因子，例如施用表达car的细胞后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年或更长。在一个实施方案中，在评估个体对表达car的细胞的反应后施用细胞因子。例如，个体按照本文所述剂量和方案施用表达car的细胞。在施用表达car的细胞后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年或更长时间用本文所述任意方法评估个体对表达car的细胞治疗的反应，该方法包括肿瘤生长抑制、循环肿瘤细胞减少或肿瘤消退。未对表达car的细胞治疗显示足够反应的个体可以施用细胞因子。对对表达car的细胞治疗具有次优反应的个体施用细胞因子改善表达car的细胞功效或抗癌活性。在优选实施方案中，在施用表达car的细胞后施用的细胞因子是il-7。
与低剂量mtor抑制剂组合
在一个实施方案中，表达car分子(例如本文所述car分子)的细胞与低免疫增强剂量的mtor抑制剂组合施用。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过90％、至少10％但不超过90％、至少15％但不超过90％、至少20％但不超过90％、至少30％但不超过90％、至少40％但不超过90％、至少50％但不超过90％、至少60％但不超过90％或至少70％但不超过90％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过80％、至少10％但不超过80％、至少15％但不超过80％、至少20％但不超过80％、至少30％但不超过80％、至少40％但不超过80％、至少50％但不超过80％或至少60％但不超过80％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过70％、至少10％但不超过70％、至少15％但不超过70％、至少20％但不超过70％、至少30％但不超过70％、至少40％但不超过70％、或至少50％但不超过70％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过60％、至少10％但不超过60％、至少15％但不超过60％、至少20％但不超过60％、至少30％但不超过60％或至少40％但不超过60％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过50％、至少10％但不超过50％、至少15％但不超过50％、至少20％但不超过50％、至少30％但不超过50％或至少40％但不超过50％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过40％、至少10％但不超过40％、至少15％但不超过40％、至少20％但不超过40％、至少30％但不超过40％或至少35％但不超过40％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少5％但不超过30％、至少10％但不超过30％、至少15％但不超过30％、至少20％但不超过30％或至少25％但不超过30％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过20％，至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过30％，至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过35％，至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过40％，或至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过45％的mtor抑制或与之相关。
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量提供至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过90％的mtor抑制或与之相关。
如本文所讨论，mtor抑制程度可以表示为p70s6激酶抑制程度，例如mtor抑制程度可以通过p70s6激酶活性水平的降低(例如通过p70s6激酶底物磷酸化的降低)来测定。mtor抑制水平可以通过本文所述方法(例如通过boulay测定，或通过western印迹测量磷酸化s6水平)来评价。
示例性mtor抑制剂
本文所用的术语“mtor抑制剂”指抑制细胞中mtor激酶的化合物或配体，或其可药用盐。在一个实施方案中，mtor抑制剂是别构抑制剂。在一个实例中，mtor抑制剂是催化抑制剂。
别构mtor抑制剂包括中性三环化合物雷帕霉素(sirolimus)、雷帕霉素相关化合物，其是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，例如雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称为雷帕霉素类似物(rapalog))和其他抑制mtor活性的大环内酯类化合物。
雷帕霉素是由吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)产生的具有式a中所示结构的已知大环内酯类抗生素。
参见mcalpine,j.b.等,j.antibiotics(1991)44:688；schreiber,s.l.等,j.am.chem.soc.(1991)113:7433；美国专利号3,929,992。存在提出用于雷帕霉素的多种编号方案。为避免混淆，在本文中命名具体的雷帕霉素类似物时，参考使用式a的编号方案的雷帕霉素命名。
用于本发明的雷帕霉素类似物是例如o取代的类似物，其中用or1替换雷帕霉素环己基环上的羟基，其中r1是羟基烷基、羟基烷氧基烷基、酰基氨基烷基或氨基烷基；例如rad001，也称为依维莫司，如us5,665,772和wo94/09010(其内容在此引入作为参考)中所述。其他适宜的雷帕霉素类似物包括在26或28位取代的那些。雷帕霉素类似物可以是上文提到的类似物的差向异构体，尤其是在40、28或26位取代且可以可选地进一步氢化的类似物的差向异构体，例如，如us6,015,815、wo95/14023和wo99/15530(其内容在此引入作为参考)中所述，例如us7,091,213、wo98/02441和wo01/14387(其内容在此引入作为参考)中所述也称为zotarolimus或雷帕霉素类似物的abt578，例如也称为ridaforolimus的ap23573。
适合用于本发明的来自us5,665,772的雷帕霉素类似物的实例包括但不限于40-o-苄基-雷帕霉素、40-o-(4’-羟甲基)苄基-雷帕霉素、40-o-[4’-(1,2-二羟乙基)]苄基-雷帕霉素、40-o-烯丙基-雷帕霉素、40-o-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4(s)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕霉素、(2’e,4’s)-40-o-(4’,5’-二羟戊-2’-烯-1’-基)-雷帕霉素、40-o-(2-羟基)乙氧基羰基甲基-雷帕霉素、40-o-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、40-o-(3-羟基)丙基-雷帕霉素、40-o-(6-羟基)己基-雷帕霉素、40-o-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素、40-o-[(3s)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素、40-o-[(2s)-2,3-二羟丙-1-基]-雷帕霉素、40-o-(2-乙酰氧基)乙基-雷帕霉素、40-o-(2-烟酰氧基)乙基-雷帕霉素、40-o-[2-(n-吗啉代)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素、40-o-(2-n-咪唑基乙酰氧基)乙基-雷帕霉素、40-o-[2-(n-甲基-n’-哌嗪基)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素、39-o-去甲基-39,40-o,o-乙烯-雷帕霉素、(26r)-26-二氢-40-o-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、40-o-(2-氨基乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-乙酰氨基乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-烟酰胺基乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-(n-甲基-咪唑-2’-基羰基乙氧基酰胺)乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-乙氧基羰基氨基乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-甲苯磺酰胺基乙基)-雷帕霉素和40-o-[2-(4’,5’-二羰基乙氧基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕霉素。
用于本发明的其他雷帕霉素类似物是这样的类似物，其中用羟基酯基团替换雷帕霉素环己基环上的羟基和/或28位羟基是已知的，例如见于usre44,768中的雷帕霉素类似物，例如temsirolimus。
用于本发明的的其他雷帕霉素类似物包括其中用另一取代基(优选(可选地羟基取代的)炔氧基、苄基、正甲氧基苄基或氯代苄基)替换16位甲氧基和/或其中39位甲氧基与39位碳一起缺失使得雷帕霉素的环己基环成为缺乏39位甲氧基的环戊基环的那些；例如，如wo95/16691和wo96/41807中所述，其内容在此引入作为参考。该类似物可进一步修饰，使得雷帕霉素的40位羟基烷化和/或32羰基还原。
来自wo95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于16-脱甲氧-16-(戊-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-(丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-(炔丙基)氧-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-(4-羟基-丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-苄氧基-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-苄氧基-雷帕霉素、16-脱甲氧-16-正-甲氧苄基-雷帕霉素、16-脱甲氧-40-o-(2-甲氧乙基)-16-戊-2-炔基)氧-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-甲酰-42-正-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-羟甲基-42-正-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-羧基-42-正-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-正-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-正-雷帕霉素、39-脱甲氧-40-脱氧-39-[n-甲基,n-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨基甲酰基-42-正-雷帕霉素和39-脱甲氧-40-脱氧-39-(对-甲苯磺酰基亚肼基甲基)-42-正-雷帕霉素。
来自wo96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于32-脱氧-雷帕霉素、16-o-戊-2-炔基-32-脱氧-雷帕霉素、16-o-戊-2-炔基-32-脱氧-40-o-(2-羟基-乙基)-雷帕霉素、16-o-戊-2-炔基-32-(s)-二氢-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素、32(s)-二氢-40-o-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(s)-二氢-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素。
另一适宜的雷帕霉素类似物是us2005/0101624中所述的umirolimus，其内容在此引入作为参考。
rad001(也称为依维莫司
别构mtor抑制剂的其他实例包括sirolimus(雷帕霉素、ay-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸]-雷帕霉素(也称为temsirolimus或cci-779)和ridaforolimus(ap-23573/mk-8669)。别构mtor抑制剂的其他实例包括zotarolimus(abt578)和umirolimus。
备选地或此外，已发现催化性atp竞争性mtor抑制剂直接靶向mtor激酶结构域，且靶向mtorc1和mtorc2二者。这些还是比诸如雷帕霉素的别构mtor抑制剂更有效的mtorc1抑制剂，因为它们调节雷帕霉素抗性mtorc1输出，如4ebp1-t37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
催化性抑制剂包括：bez235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈，或其单甲苯磺酸盐形式，bez235的合成描述于wo2006/122806中；ccg168(另称为azd-8055，chresta,c.m.等,cancerres,2010,70(1),288-298)，其具有化学名称{5-[2,4-双-((s)-3-甲基-吗啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3s)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-n-甲基苯甲酰胺(wo09104019)；3-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-1-异丙基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(wo10051043和wo2013023184)；an-(3-(n-(3-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)喹噁啉-2-基)氨磺酰)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲酰胺(wo07044729和wo12006552；pki-587(venkatesan,a.m.,j.med.chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化学名称1-[4-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；gsk-2126458(acsmed.chem.lett.,2010,1,39-43)，其具有化学名称2,4-二氟-n-{2-甲氧基-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9h-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(wo10114484)；(e)-n-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙烷-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]quinolin-2(3h)-ylidene)氨腈(wo12007926)。
催化性mtor抑制剂的其他实例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(wo2006/122806)和ku-0063794(garcia-martinezjm等,biochemj.,2009,421(1),29-42.。ku-0063794是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mtor)的特异性抑制剂。wye-354是催化性mtor抑制剂的另一实例(yuk等(2009).biochemical,cellular,andinvivoactivityofnovelatp-competitiveandselectiveinhibitorsofthemammaliantargetofrapamycin.cancerres.69(15):6232-6240)。
用于本发明的mtor抑制剂还包括前述任一种的前体药物、衍生物、可药用盐、或其类似物。
可根据本文所述具体剂量，根据本领域完善的方法，配制mtor抑制剂(如rad001)用于递送。具体而言，美国专利6,004,973(在此引入作为参考)提供了可用于本文所述mtor抑制剂的制剂的实例。
mtor抑制的评价
mtor磷酸化激酶p70s6，从而激活p70s6激酶，使它磷酸化其底物。mtor抑制的程度可表示为p70s6激酶抑制的程度，例如mtor抑制程度可通过p70s6激酶活性降低的水平(例如通过p70s6激酶底物磷酸化的减少)来测定。可通过在缺乏抑制剂的情况下(例如在施用抑制剂之前)和在存在抑制剂的情况下或施用抑制剂后测量p70s6激酶活性(p70s6激酶磷酸化底物的能力)来测定mtor抑制水平。p70s6激酶的抑制水平给出mtor抑制的水平。因此，如果p70s6激酶抑制40％，则通过p70s6激酶活性测量的mtor活性抑制40％。抑制的程度或水平在本文中指剂量间隔内的平均抑制水平。作为实例，如果每周一次提供抑制剂，则抑制水平通过该间隔(即一周)内的平均抑制水平给出。
boulay等,cancerres,2004,64:252-61(在此引入作为参考)教导了可用于评估mtor抑制水平的测定(本文中称为boulay测定)。在一个实施方案中，该测定依赖于测量来自施用mtor抑制剂(例如rad001)之前和之后的生物样品的p70s6激酶活性。样品可在用mtor抑制剂治疗后预先选择的时间(例如治疗后24、48和72小时)采集。可以使用例如来自皮肤或外周血单核细胞(pbmc)的生物样品。从样品制备总蛋白质提取物。用特异性识别p70s6激酶的抗体通过免疫沉淀从该蛋白质提取物分离p70s6激酶。所分离的p70s6激酶的活性可以在体外激酶测定中测量。可在允许磷酸化底物的条件下使分离的激酶与40s核糖体亚基底物(其是p70s6激酶的内源底物)和γ-32p孵育。然后在sds-page凝胶上分离反应混合物，并用phosphorimager分析32p信号。对应于40s核糖体亚基大小的32p信号指示磷酸化底物和p70s6激酶活性。可通过定量磷酸化底物的32p信号的面积和强度(使用imagequant,moleculardynamics)，为所定量的信号指定随意单位值，并将来自施用后的值与来自施用前的值或与参考值相比较，来计算激酶活性的提高和降低。例如，可以用以下公式计算激酶活性的百分比抑制：1-(施用后获得的值/施用前获得的值)x100。如上文所述，抑制的程度或水平在本文中指剂量间隔内的平均抑制水平。
us7,727,950中也提供了用于评价激酶活性(例如p70s6激酶活性)的方法，在此引入作为参考。
还可以通过pd1阴性与pd1阳性t细胞比值的变化来评价mtor抑制水平。可通过本领域已知的方法将来自外周血的t细胞鉴定为pd1阴性或阳性。
低剂量mtor抑制剂
本文所述方法使用低免疫增强剂量mtor抑制剂，mtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，包括雷帕霉素类似物如rad001)的剂量。相反，完全或几乎完全抑制mtor途径的抑制剂水平是免疫抑制的，用于例如防止器官移植排斥。此外，完全抑制mtor的高剂量雷帕霉素类似物也抑制肿瘤细胞生长，用于治疗多种癌症(参见例如antineoplasticeffectsofmammaliantargetofrapamycineinhibitors.salvadorim.worldjtransplant.2012年10月24日；2(5):74-83；currentandfuturetreatmentstrategiesforpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:roleofmtorinhibition.finnrs.livercancer.2012年11月；1(3-4):247-256；emergingsignalingpathwaysinhepatocellularcarcinoma.moeinia,cornellàh,villanuevaa.livercancer.2012sep；1(2):83-93；targetedcancertherapy-arethedaysofsystemicchemotherapynumbered？joowd,visintini,morg.maturitas.2013年9月20日.；roleofnaturalandadaptiveimmunityinrenalcellcarcinomaresponsetovegfr-tkisandmtorinhibitor.santonim,berardir,amantinic,burattinil,santinid,santonig,cascinus.intjcancer.2013年10月2日)。
本发明至少部分基于低于目前临床背景中所用剂量的mtor抑制剂剂量在提高个体中的免疫反应和提高pd-1阴性t细胞/pd-1阳性t细胞比值中具有更优的作用的惊人发现。令人惊奇地，仅导致mtor活性的部分抑制的低剂量mtor抑制剂能够有效改善人个体中的免疫反应和提高pd-1阴性t细胞/pd-1阳性t细胞比值。
备选地或此外，不希望受限于任何理论，认为例如与未治疗个体相比，低免疫增强剂量的mtor抑制剂可以例如至少瞬时增加幼稚t细胞数目。备选地或此外，同样不希望受限于理论，认为足量时间或足够给药次数后，mtor抑制剂治疗导致以下一项或多项：
例如记忆t细胞(例如记忆t细胞前体)上一个或多个以下标志的表达增加：cd62l高、cd127高、cd27+和bcl2；
例如记忆t细胞(例如记忆t细胞前体)上klrg1的表达减少；和
记忆t细胞前体例如具有以下特征中任一种或任意组合的细胞的数目增加：提高的cd62l高、提高的cd127高、提高的cd27+、降低的klrg1和提高的bcl2；
其中例如与未治疗个体相比，上述改变中的任一种例如至少瞬时发生(araki,k等(2009)nature460:108-112)。记忆t细胞前体是处于分化程序早期的记忆t细胞。例如，记忆t细胞具有一种或多种以下特征：提高的cd62l高、提高的cd127高、提高的cd27+、降低的klrg1和/或提高的bcl2。
在一个实施方案中，本发明涉及mtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素类似物、雷帕霉素或rad001，或催化性mtor抑制剂)的组合物或剂量形式，在按选定给药方案(例如每天一次或每周一次)施用时，其与以下相关：与完全或显著免疫抑制不相关但与免疫反应的增强相关的mtor抑制水平。
mtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素类似物、雷帕霉素或rad001，或催化性mtor抑制剂)可以缓释制剂提供。本文所述任意组合物或单位剂量形式可以缓释制剂提供。在一些实施方案中，缓释制剂将具有比立即释放制剂低的生物利用率。例如，在一些实施方案中，为了获得与立即释放制剂相似的治疗效果，缓释制剂将具有约2至约5、约2.5至约3.5、或约3倍于立即释放制剂中所提供的抑制剂的量。
在一个实施方案中，提供每个单位剂量形式具有0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6、或约5mg的通常用于每周一次施用的例如rad001的立即释放形式。对于每周一次施用，这些立即释放制剂对应于分别具有0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18、或约15mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。在一些实施方案中，两种形式都按每周一次施用。
在一个实施方案中，提供每个单位剂量形式具有0.005至1.5、0.01至1.5、0.1至1.5、0.2至1.5、0.3至1.5、0.4至1.5、0.5至1.5、0.6至1.5、0.7至1.5、0.8至1.5、1.0至1.5、0.3至0.6、或约0.5mg的通常用于每天一次施用的例如rad001的立即释放形式。对于每天一次施用，这些立即释放形式对应于分别具有0.015至4.5、0.03至4.5、0.3至4.5、0.6至4.5、0.9至4.5、1.2至4.5、1.5至4.5、1.8至4.5、2.1至4.5、2.4至4.5、3.0至4.5、0.9至1.8、或约1.5mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。对于每周一次施用，这些立即释放形式对应于分别具有0.1至30、0.2至30、2至30、4至30、6至30、8至30、10至30、1.2至30、14至30、16至30、20至30、6至12、或约10mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。
在一个实施方案中，提供每个单位剂量形式具有0.01至1.0mg的通常用于每天一次施用的例如rad001的立即释放形式。对于每天一次施用，这些立即释放形式对应于分别具有0.03至3mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。对于每周一次施用，这些立即释放形式对应于分别具有0.2至20mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。
在一个实施方案中，提供每个单位剂量形式具有0.5至5.0mg的通常用于每周一次施用的例如rad001的立即释放形式。对于每周一次施用，这些立即释放形式对应于分别具有1.5至15mgmtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂，例如雷帕霉素或rad001)的缓释形式。
如上文所述，mtor途径的一个靶标是p70s6激酶。因此，用于本文所述方法和组合物的mtor抑制剂的剂量是这样的剂量，例如通过本文所述测定(例如boulay测定)测量，其足以相对于缺乏mtor抑制剂情况下的p70s6激酶活性达到不超过80％的p70s6激酶活性抑制。在另一方面，本发明提供足以相对于缺乏mtor抑制剂情况下的p70s6激酶活性达到不超过38％的p70s6激酶活性抑制的mtor抑制剂的量。
在一方面，例如在对人个体施用时，例如通过本文所述测定(例如boulay测定)测量，用于本发明的方法和组合物的mtor抑制剂的剂量足以达到90+/-5％(即85-95％)、89+/-5％、88+/-5％、87+/-5％、86+/-5％、85+/-5％、84+/-5％、83+/-5％、82+/-5％、81+/-5％、80+/-5％、79+/-5％、78+/-5％、77+/-5％、76+/-5％、75+/-5％、74+/-5％、73+/-5％、72+/-5％、71+/-5％、70+/-5％、69+/-5％、68+/-5％、67+/-5％、66+/-5％、65+/-5％、64+/-5％、63+/-5％、62+/-5％、61+/-5％、60+/-5％、59+/-5％、58+/-5％、57+/-5％、56+/-5％、55+/-5％、54+/-5％、54+/-5％、53+/-5％、52+/-5％、51+/-5％、50+/-5％、49+/-5％、48+/-5％、47+/-5％、46+/-5％、45+/-5％、44+/-5％、43+/-5％、42+/-5％、41+/-5％、40+/-5％、39+/-5％、38+/-5％、37+/-5％、36+/-5％、35+/-5％、34+/-5％、33+/-5％、32+/-5％、31+/-5％、30+/-5％、29+/-5％、28+/-5％、27+/-5％、26+/-5％、25+/-5％、24+/-5％、23+/-5％、22+/-5％、21+/-5％、20+/-5％、19+/-5％、18+/-5％、17+/-5％、16+/-5％、15+/-5％、14+/-5％、13+/-5％、12+/-5％、11+/-5％或10+/-5％的p70s6激酶活性抑制。
个体中的p70s6激酶活性可以用本领域已知的方法测量，例如按照美国专利7,727,950中所述的方法，通过磷酸p70s6k水平和/或磷酸p70s6水平的免疫印迹分析，或通过体外激酶活性测定。
本文在提到mtor抑制剂的剂量时所用的术语“约”指mtor抑制剂的量的至多+/-10％变异，但可以包括无变异的约所陈述的剂量。
在一些实施方案中，本发明提供包括按目标低谷水平内的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)的方法。在一些实施方案中，该低谷水平显著低于与用于器官移植和癌症患者的给药方法相关的低谷水平。在一个实施方案中，施用mtor抑制剂(例如rad001或雷帕霉素)以产生小于产生免疫抑制或抗癌作用的低谷水平的1/2、1/4、1/10或1/20的低谷水平。在一个实施方案中，施用mtor抑制剂(例如rad001或雷帕霉素)以产生小于fda批准的用于免疫抑制或抗癌适应症的包装说明书上提供的低谷水平的1/2、1/4、1/10或1/20的低谷水平。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供0.1至10ng/ml、0.1至5ng/ml、0.1至3ng/ml、0.1至2ng/ml或0.1至1ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供0.2至10ng/ml、0.2至5ng/ml、0.2至3ng/ml、0.2至2ng/ml或0.2至1ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供0.3至10ng/ml、0.3至5ng/ml、0.3至3ng/ml、0.3至2ng/ml或0.3至1ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供0.4至10ng/ml、0.4至5ng/ml、0.4至3ng/ml、0.4至2ng/ml或0.4至1ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供0.5至10ng/ml、0.5至5ng/ml、0.5至3ng/ml、0.5至2ng/ml或0.5至1ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括按提供1至10ng/ml、1至5ng/ml、1至3ng/ml或1至2ng/ml的目标低谷水平的剂量对个体施用mtor抑制剂(例如别构抑制剂，例如rad001)。
本文所用的术语“低谷水平”指下一个剂量之前即刻的血浆药物浓度，或两个剂量间的最小药物浓度。
在一些实施方案中，rad001的目标低谷水平在约0.1和4.9ng/ml之间的范围内。在一个实施方案中，该目标低谷水平低于3ng/ml，例如在0.3或更少和3ng/ml之间。在一个实施方案中，该目标低谷水平低于3ng/ml，例如在0.3或更少和1ng/ml之间。
在另一方面，本发明可以按与所指定的rad001目标低谷水平生物等效的目标低谷水平相关的量利用rad001之外的mtor抑制剂。在一个实施方案中，rad001之外的mtor抑制剂的目标低谷水平是产生与本文所述rad001低谷水平所产生的mtor抑制水平相同的mtor抑制水平(例如通过本文所述方法(例如p70s6抑制)测量)的水平。
药物组合物：mtor抑制剂
在一方面，本发明涉及配制用于与本文所述cdr细胞组合的包含mtor抑制剂(例如本文所述mtor抑制剂)的药物组合物。
在一些实施方案中，该mtor抑制剂配制用于与例如本文所述附加活性剂组合施用。
通常，本发明的化合物将单独或与一种或多种治疗剂组合，通过任意本领域已知的常见和可接受的方式，按上文所述治疗有效量施用。
药物制剂可用常规溶解和混合方法配制。例如，在本文所述一种或多种赋形剂存在下将原料药(例如mtor抑制剂或该化合物的稳定化形式(例如与环糊精衍生物或其他已知络合剂的络合物))溶解在适宜溶剂中。通常将mtor抑制剂配制为药物剂量形式，以提供可容易控制的药物剂量，及为患者提供可简便和容易地处理的产品。
本文明的化合物可作为药物组合物通过任意常规途径施用，尤其是肠，例如口服，例如以片剂或胶囊的形式，或胃肠外，例如以注射液或悬液的形式，局部，例如以洗剂、凝胶、软膏剂或霜剂的形式，或以鼻剂或栓剂形式。在mtor抑制剂与本文所述另一活性剂组合施用(同时或分开)时，在一方面，两种成分可以通过相同途径(例如胃肠外)施用。备选地，另一获活性剂可以通过相对于mtor抑制剂不同的途径施用。例如，mtor抑制剂可以口服施用，另一活性剂可以胃肠外施用。
缓释
本文公开的mtor抑制剂(例如别构mtor抑制剂或催化性mtor抑制剂)可以作为包含本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的口服固体剂量形式的药物制剂提供，其满足产品稳定性要求和/或具有优于立即释放(ir)片剂的药代动力学特性，如平均血浆峰浓度降低，药物吸收程度和血浆峰浓度的患者间和患者内变异性降低，cmax/cmin比值降低，和/或食物影响降低。所提供的药物制剂可允许更精确的剂量调整和/或降低不良事件频率，从而为患者提供本文所公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的更安全的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的稳定的延长释放制剂，其是多颗粒系统，且可以具有功能性薄层和包衣。
本文所用的术语“延长释放的多颗粒制剂”指使得能够在延长的时期内(例如在至少1、2、3、4、5或6小时内)释放本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的制剂。延长释放制剂可以包含由例如本文所述特殊赋形剂制成的基质和包衣，其以使得活性成分在摄入后延长的时期内可获得的方式配制。
术语“延长释放”可与术语“缓释”(sr)或“持久释放”互换使用。按照欧洲药典(第7版)片剂和胶囊专论及usp一般章节<1151>药物剂量形式中的定义，术语“延长释放”指口服给药后并非立即而是在延长的时期内释放活性药物物质的药物制剂。按照“guidanceforindustry:“dissolutiontestingofimmediatereleasesolidoraldosageforms”(fdacder,1997)的定义，本文所用的术语“立即释放”(ir)指在不到60分钟内释放85％活性药物物质的药物制剂。在一些实施方案中，术语“中间释放”是指，例如在本文所述溶解测定中测量，在30分钟时间内从片剂释放依维莫司。
本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的稳定的延长释放制剂可以用本领域已知的测定通过体外释放特征来表征，如本文所述溶解测定：溶解容器在37℃装有含十二烷基硫酸钠0.2％的900ml磷酸盐缓冲液ph6.8，通过分别按照usp测试专论711和欧洲药典测试专论2.9.3，按照usp以75转/分钟用搅拌桨法进行溶解。
在一些实施方案中，本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的稳定的延长释放制剂按照以下释放规格在体外释放测定中释放mtor抑制剂：
0.5小时：<45％或<40，例如<30％
1小时：20-80％，例如30-60％
2小时：>50％或>70％，例如>75％
3小时：>60％或>65％，例如>85％，例如>90％.
在一些实施方案中，本文公开的mtor抑制剂(例如雷帕霉素或rad001)的稳定的延长释放制剂在体外溶解测定中不早于45、60、75、90、105分钟或120分钟释放50％的mtor抑制剂。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，可通过生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)对个体施用或递送本文公开的一种或多种表达car的细胞。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述表达的car的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含生物相容(例如不实质性诱导炎症或免疫反应)和/或可生物降解的聚合物，该聚合物可以是天然存在的或合成的。
适宜的生物聚合物的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙水泥(cpc)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、(1,2,3,4,6-五乙酰a-d-半乳糖)、纤维素、几丁质、壳多糖、胶原、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟基磷灰石、聚(3-羟基丁酸-共-3-羟基-己酸)(phbhhx)、聚(交酯)、聚(己内酯)(pcl)、聚(交酯-共-乙交酯)(plg)、聚氧乙烯(peo)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚环氧丙烷(ppo)、聚乙烯醇(pva)、丝、大豆蛋白质和大豆蛋白质分离物，单独或以任意浓度和以任意比例与任意其他聚合物组合物组合。该生物聚合物可以用促进黏附或迁移的分子(例如结合淋巴细胞的胶原受体的胶原模拟肽)和/或增强待递送的细胞的递送、扩增或功能(例如抗癌活性)的刺激分子加强或修饰。该生物聚合物支架可以是可注射的，例如凝胶或半固体，或固体组合物。
在一些实施方案中，在递送至个体之前将本文所述表达car的细胞接种在生物聚合物支架上。在一些实施方案中，该生物聚合物支架进一步包含例如掺入或缀合至支架的生物聚合物的本文所述的一种或多种附加治疗剂(例如另一表达car的细胞、抗体或小分子)或增强表达car的细胞的活性的活性剂。在一些实施方案中，在肿瘤处或足以介导抗肿瘤作用的肿瘤周围内例如肿瘤内注射或手术植入该生物聚合物支架。生物聚合物组合物和用于其递送的方法的其他实例描述于stephan等,naturebiotechnology,2015,33:97-101和wo2014/110591中。
药物组合物和治疗
本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本文所述表达car的细胞，例如多个表达car的细胞。这类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液等；糖类，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；及防腐剂。在一方面，本发明的组合物配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将取决于诸如患者的病症、患者疾病的类型和严重度的因素，但适当的剂量可通过临床试验确定。
在一个实施方案中，该药物组合物基本不含(例如无可检测水平的)例如选自以下的污染物：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(rcl)、p24、vsv-g核酸、hivgag、残留抗cd3/抗cd28包被小球、小鼠抗体、合并人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基成分、载体包装细胞或质粒成分、细菌和和真菌。在一个实施方案中，该细菌是选自以下的至少一种：粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)和酿脓链球菌a组(streptococcuspyogenesgroupa)。
在指出“治疗有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明的组合物的精确量可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(个体)病症的个体差异来确定。一般可以说，包含本文所述免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的药物组合物可以按104至109细胞/kg体重(在一些情况下为105至106细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。t细胞组合物还可以按这些剂量施用多次。该细胞可以通过使用免疫治疗中公知的输注技术来施用(参见例如rosenberg等,neweng.j.ofmed.319:1676,1988)。
在某些方面，可以希望对个体施用活化免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，然后再次抽血(或进行单采血液成分术)，按照本发明活化从其获得的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，用这些活化和扩增免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)再次输注患者。此过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的抽血活化免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血活化免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)。
对个体施用组合物可以以任意方便的方式进行，例如通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。本文所述组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉(i.v.)注射、或腹腔内对患者施用。在一方面，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射对患者施用。在一方面，本发明的t细胞组合物通过静脉注射施用。免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的组合物可以直接注射入肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一个具体的实例性方面，患者可以进行白细胞去除，其中离体收集、富集或排除白细胞，已选择和/或分离目的细胞，例如t细胞。这些t细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增，并这样处理，使得可以引入本发明的一个或多个car构建体，从而产生本发明的cart细胞。有需要的个体随后可以进行高剂量化疗的标准治疗，然后移植外周血干细胞。在某些方面，移植后或与移植同时，个体接受本发明的扩增的cart细胞输注。在另一方面，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
待对患者施用的以上治疗的剂量将随所治疗的病症的治疗的受体的确切性质而变。可以按照本领域接受的实践进行用于人施用的剂量的缩放。对于成分患者，campath的剂量例如通常将在1至约100mg的范围内，通常在1至30天的时期内每天施用。优选的日剂量为每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天至多40mg的更大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)
在一个实施方案中，例如用体外转录将car引入免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，个体(例如人)接受本发明的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的初次施用，及本发明的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的一次或多次后续施用，其中该一次或多次后续施用在前一次施用后不到15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用。在一个实施方案中，每周对个体(例如人)施用一次以上本发明的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的施用，例如每周施用2、3或4次本发明的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)的施用。在一个实施方案中，个体(例如人个体)每周接受一次以上car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)施用(例如每周2、3或4次施用)(本文中也称为周期)，然后一周无car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)施用，然后对个体施用一次或多次附加的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)施用(例如每周一次以上car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)施用)。在另一实施方案中，个体(例如人个体)接受一个以上周期的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)，每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)每两天施用，每周3次施用。在一个实施方案中，本发明的car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)施用至少2、3、4、5、6、7、8或更多周。
在一方面，本发明的表达car的细胞用慢病毒载体(如慢病毒)产生。这样产生的细胞(例如cart)将具有稳定的car表达。
在一方面，表达car的细胞(例如cart)用病毒载体(如γ反转录病毒载体，例如本文所述γ反转录病毒载体)产生。用这些载体产生的cart可具有稳定的car表达。
在一方面，cart在转导后瞬时表达car载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。car的瞬时表达可通过rnacar载体递送来达到。在一方面，该carrna通过电穿孔转导入t细胞。
使用瞬时表达car免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)(尤其是对于具有鼠scfv的cart)可在所治疗的患者中产生的潜在问题是多次施用后的过敏反应。
不受限于此理论，认为这种过敏反应可由患者发展体液抗car反应(即具有抗ige同种型的抗car抗体)引起。认为在暴露于抗原间断10至14天时，患者的产抗体细胞经历了从igg同种型(不引起过敏反应)至ige同种型的种类转换。
如果患者在瞬时car治疗(如通过rna转导产生的那些)过程期间处于产生抗car抗体反应的高风险，则cart输注间断不应持续超过10至14天。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，提供这些实施例仅是为了说明的目的，并非旨在限制。因此，本发明绝不应解释为限于以下实施例，而应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变通形式。
用cart19治疗cll患者
用自体cart19t细胞治疗针对cll治疗患者upcc04409-10。治疗导致cll完全缓解(completeremission)。
cart细胞群体分析
如图1中所示，通过采集血液随时间推移监测患者upcc04409-10中的cart细胞。测定细胞中bbz表达量(红色)。测定来自vbeta5.1tcr家族的序列的拷贝数(蓝色)。两个测量都从在第二次输注cart细胞后的所示天数采集的样品进行。如图2中所示，从cart输注后第28天(图2a)或第51天(图2b)采集的样品测定了来自患者upcc04409-10的t细胞受体库。这证明tcrbv05-01家族t细胞受体第51天的丰度表明随时间推移发生克隆扩增。如图3中所示，随时间推移(第50天和第51天)针对car19和2个不同tcr家族基因的同时表达分析了从患者upcc04409-10分离的t细胞，并与输入施用物质(产品)相比较：上图为tcr家族vb13.1；下图显示tcr家族vb5.1。数据证明，car19阳性细胞包含在第50和51天之间快速富集的单个tcr家族基因(vb5.1)。如图4中所示，从cart输注后第51天收集的样品测定了来自患者upcc04409-10的cd8阳性细胞的t细胞受体库。这证明tcrbv05-01家族t细胞受体第51天的丰度表明cd8阳性细胞随时间推移发生克隆扩增。
持续存在的cart克隆分析
如图6中所示，从来自患者#的t细胞产生了超声片段化dna。用此材料来扩增邻近car19插入的基因组序列。将所示基因鉴定为相对于所输注的产品(d0)在基因组中邻近car19处富集。在所示cart输注后不同时间点(d＝天；m＝月)，观察到了邻近基因的不同相对丰度，tet2丰度在外周血(pbmc)和car+cd8+t细胞样品中都在第51天达到峰值。
如图7中所示，将car19基因插入位点定位至tet2基因。更具体而言，插入发生在tet2基因的外显子9和10之间。tet2的催化结构域位于外显子11中。此位置处的插入可导致异常mrna转录物的表达或减少功能性(野生型)tet2的表达。
如图8中所示，使用图右侧所示的跨越tet2或car19或二者的所示区域的引物，通过rtpcr评价了来自从患者upcc04409-10分离的mrna的ter基因转录物。rxn3包含设计用于扩增跨域外显子9和10的tet2转录物区域的引物。rxn6、7、8、9和10是设计用于扩增car19慢病毒的所示区域的引物。rxn12-16是包含tet2转录物的外显子9序列以及来自car19慢病毒构建体的序列的引物对。这些数据显示转录物是从包含tet2序列以及car19序列二者的tet2基因座产生。
tet2功能分析
如图10中所示，示意tet2催化活性(图10a)。tet家族蛋白质将5-甲基胞嘧啶(5-mc)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)，然后转化为5-甲酰基胞嘧啶(5-fmc)，产生脱甲基胞嘧啶。甲基化dna是已知影响转录谱的表观遗传学状态。评价了来自患者upcc04409-10的t细胞的甲基化状态(图10b)。针对tcrvb5.1(其在tet2处包含car19插入)染色患者的t细胞，通过流式细胞术在tcrvb5.1阳性(红色)和tcrvb5.1阴性(蓝色)群体中评价5-hmc和5-fmc。此数据显示在tet2基因中包含car19插入的细胞缺乏脱甲基化。
用shrnatet2抑制剂处理t细胞
材料和方法
慢病毒制备和感染jurkat细胞
从15cm293t细胞制备慢病毒。简言之，在第-1天将10x106个293t细胞接种至胶原包被的15cm平皿上。在第0天，用lipofectamin2000(invitrogen)转染15ugshrna载体(即包含编码tet2靶向shrna或对照shrna的序列的载体)、15uggag/pol载体和5ugvsv-g载体。24小时后(第1天)，更换培养基。更换培养基后，在第2天和第3天收集病毒上清。用lenti-x浓缩器(3:1体积比,clonetech,目录号:631231)浓缩病毒。在6ug/ml聚凝胺(polybrene)存在下将100ul病毒加入0.5x106个jurkat细胞。32℃、2000转/分钟旋转感染细胞90分钟。37℃温箱孵育1小时后，加入新鲜rpmi1640培养基，转入24孔板。在第6天，在终浓度2ug/ml嘌呤霉素存在下将细胞转入6孔板6天。
抗体
用于western印迹的抗体如下：β-肌动蛋白(clone#:8h10d10,cellsignaling)；tet2(clone#:ht2h21f11,millipore)；小鼠igg(h+l)(hrp缀合,目录号:115-035-166,jacksonimmunoresearch)；兔igg(h+l)(hrp缀合,目录号:111-035-114,jacksonimmunoresearch)。
western印迹
为了在蛋白质水平检查jurkat细胞中的tet2shrna敲减效率，在含蛋白酶抑制剂混合物(sigma)的ripa缓冲液中制备细胞裂解物。通过bca蛋白质测定试剂盒(pierce,item#:3603904)测量蛋白质浓度。对20ug蛋白质进行sds-page，然后用ibot转移系统(invitrogen,20v,11分30秒)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。在含5％bsa的tbst中室温封闭膜30分钟。用1:1000稀释的抗体4℃过夜孵育膜。用hrp缀合的二抗孵育后，用化学发光检测机(chemidoc；bio-rad)检测信号。
定量rt-pcr
为了在dna水平检查jurkat细胞中的tet2shrna敲减效率，进行了定量反转录聚合酶链反应(qrt-pcr)。用rneasymicrokit(qiagen)来提取rna。用superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr(invitrogen)将mrna反转录为单链互补dna(cdna)。用c1000touchthermalcycler(biorad)进行实时pcr。用基于sybr的流程来检测基因表达(ssoadvanceduniversalsybrgreensupermix,biorad)。pcr反应在96孔板中进行，并用厂家推荐的循环参数一式三份运行(95℃3分钟，然后是95℃15秒和60℃30秒的40个循环)。将目的基因循环阈(ct)值对β-肌动蛋白的ct归一化。用于qrt-pcr的引物如下：β-肌动蛋白#1(正向引物：catgtacgttgctatccaggc(seqidno:1263)；反向引物：ctccttaatgtcacgcacgat(seqidno:1264)；产物大小250bp)；β-肌动蛋白#2(正向引物：ctcaccatggatgatgatatcgc(seqidno:1265)；反向引物：ccacataggaatccttctgaccc(seqidno:1266)；产物大小169bp)；tet1(正向引物：cagaacctaaaccacccgtg(seqidno:1267)；反向引物：tgcttcgtagcgccattgtaa(seqidno:1268)；产物大小141bp)；tet2(正向引物：ataccctgtatgaagggaagcc(seqidno:1269)；反向引物：cttaccccgaagttacgtctttc(seqidno:1270)；产物大小197bp)；tet3(正向引物：cacccggctctatgaaacctt(seqidno:1271)；反向引物：ccagccactcgaggtagtca(seqidno:1272)；产物大小209bp)；rplp1(目录号:pph17813g-200,qiagen).
流式细胞术
在facsfortessa(bd)上获取细胞。用flowjo(treestarinc.)程序进行数据处理用于呈现。
结果
tet2shrna敲减效率验证
如图27中所示，示意tet2shrna敲减效率的验证。将表达红色荧光蛋白(rpf)和嘌呤霉素抗性基因的tet2和错乱对照shrna构建体引入jurkat细胞，以通过qrt-pcr和western印迹实验验证tet2shrna的敲减效率。
如图28中所示，shrna感染的jurkat细胞表达rfp。在嘌呤霉素处理后第6天通过facs测定rfp表达。基于rfp表达，通过嘌呤霉素处理选择了超过99％引入shrna的jurkat细胞。应指出，tet2shrna#3和#4感染的jurkat细胞在嘌呤霉素存在下未生长。因此，tet2shrna#3和#4感染的jurkat细胞未进一步处理。此数据表明嘌呤霉素有效选择shrna感染的jurkat细胞。
如图29中所示，tet2敲减效率取决于shrna。为了测定tet2shrna感染的jurkat细胞中tet1和tet2和tet3的mrna表达水平，进行了qrt-pcr实验。与错乱shrna相比，tet2shrna#1、#2、#8和#9分别按35.6％、22.7％、21.6％和76.7％敲减tet2基因。令人惊奇地，tet2shrna#9有效敲减tet2，同时还使tet1和tet3表达分别下调43.4％和67.3％。β-肌动蛋白作为内部对照来定量所测试样品间的相对基因表达。为了提高qrt-pcr可靠性，在此实验中使用了两个β-肌动蛋白引物和一个rplp1引物。此数据表明几个tet2靶向shrna能够降低tet2的mrna水平，shrna#9显示最强健的tet2敲减效果，同时还影响tet1和tet2的水平。
如图30中所示，响应shrna的tet2蛋白质敲减与tet2mrna敲减相关。为了测定tet2shrna感染的jurkat细胞中的tet2蛋白质水平，进行了western印迹实验。与图29中所示的qrt-pcr数据类似，与错乱shrna相比，tet2shrna#1、#2、#8和#9降低tet2蛋白质水平，而β-肌动蛋白在测试的所有样品中组成性表达。此数据表明几种tet2靶向shrna能够降低jurkat细胞中的tet2蛋白质水平，shrna#9显示最强健的tet2敲减作用。
用shrnatet2抑制剂处理原代t细胞
如图11中所示，tet2shrna降低正常人t细胞中的5-hmc水平。将tet2和表达mcherry的错乱对照shrna构建体引入正常人t细胞。在用抗cd3/cd28小球扩增后第6天通过facs通过胞内染色测定5-hmc水平。tet2的敲减降低了总体5-hmc水平。
如图12中所示，tet2shrna扩增tscmt细胞。将tet2和表达mcherry的错乱对照shrna构建体引入正常人t细胞。在用抗cd3/cd28小球扩增后第11天通过facs染色测定cd45ra+cd62l+ccr7+cd27+cd95+tscmt细胞。tet2的敲减促进了具有tscm表型的t细胞的扩增。
用crispr/cas基因编辑系统抑制cart细胞中的tet2
在此实施例中，在表达嵌合抗原受体(car)的t细胞中探究了tet2抑制。
方法
向导rna分子
用表5中所列的包含靶向序列的grna分子进行此子实施例中所述的实验。除非另有说明，所有grna分子作为包含此子实施例中所述的tracr和crrna序列的双grna分子使用。
表5
crisprcart细胞的产生
在第0天融化并用cd3/cd28小球(cd3/cd28cts
下一代测序(ngs)样品产生
融化冷冻的经过编辑的细胞沉淀(上文所述)，并用dneasyblood&tissuekit(qiagen,69506)处理来分离基因组dna。洗脱的dna用于用titaniumtaqpcrkit(clontechlaboratories,639211)和tet2引物(设计在grna的预期靶位点侧翼的引物)进行pcr。用qiaquickpcrpurificationkit(qiagen,28104)纯化pcr产物。然后用纯化的pcr产物进行t7e1测定，以检测碱基对错配和确认基因编辑。对pcr扩增子进行标准nexterangs文库制备(illumina)，并在illuminamiseq测序仪上用配对末端读出测序。将测序读出与参考基因组比对，并发现变体。
细胞因子产生测定
测定当天融化效应细胞(cart细胞)，在cellometer(nexelcom)上计数。然后按2:1的效应细胞:靶细胞比值将这些细胞与不同靶细胞共培养。20小时后收集100ul共培养上清。然后将这些上清用于按厂家流程用mesoscalediscovery、proinflammatorypanel1目录#n05049a-1测量所释放的细胞因子il-2和ifn-g。
t细胞增殖测定
评价了响应表达bcma或cd19的靶细胞的cart细胞增殖。靶细胞系是：bcma阳性多发性骨髓瘤细胞系nci-h929-luc、kms-11-luc和bcma阴性nalm6luc(cd19阳性细胞系)。融化cart细胞，在t细胞培养基中孵育2小时以恢复。在cellometer上计数细胞，靶细胞按10,000拉德照射。照射后，在完全t细胞培养基中洗涤靶细胞两次并计数。然后按1:1比值将30,000个经照射的靶细胞与cart细胞共培养。作为阴性对照，向cart细胞单独加入培养基。
37℃孵育共培养物4天。在第4天，用cd3-percpcy5.5(ebioscience:45-0037)、cd4-eflor450(ebioscience:48-0047)和cd8-apc(ebioscience17-0087)冰上染色共培养细胞20分钟，相对于countbrightabsolutecountingbeads(lifetechnologies)通过流式细胞术测量来测定相对细胞计数。通过每步冰上20分钟的两步孵育测量car表达：生物素化蛋白l+链霉抗生物素蛋白-pe(jacksonimmunoresearch)。用bd5激光fortessa获取流式细胞术数据，并通过flowjo软件分析。
结果
图13a和13b显示用和未用tet2crispr电穿孔的细胞中的car表达。图13a显示用于测定car+t细胞的门控策略。用前向散射(fsc-a)和侧向散射(ssc-a)选择淋巴细胞如圆圈内所示。然后选择表达cd3的细胞(中图)。然后通过相对于阴性对照峰的门控测定条所示的car阳性(通过生物素化蛋白质和链霉抗生物素蛋白-pe进行的car检测pe阳性细胞)细胞。图13b显示car阳性细胞百分比的定量。细胞按所示用bcma-10car或cd19car转导。细胞用包含cas9蛋白质、示踪rna和所示靶向tet2的向导rna(靶向外显子3的ex3-3或靶向外显子9的ex9-6)的rnp电穿孔或不进行电穿孔。用小球活化细胞后10天测定car表达。这些数据表明tet2的编辑不影响t细胞中的car表达。
图14显示car转导和tet2编辑后cd4和cd8阳性细胞的定量。在10天小球扩增结束时针对cd3、cd4、cd8和car表达染色细胞。左图显示总cd3+细胞群体中cd4和cd8阳性细胞的百分比。右图显示同时为car+的cd3+细胞群体中cd4和cd8阳性细胞的百分比。细胞按所示用bcma-10car或cd19car转导或保持不转导(utd)。细胞用包含cas9蛋白质、示踪rna和所示靶向tet2的向导rna(靶向外显子3的ex3-3和靶向外显子9的ex9-6)的rnp电穿孔或不进行电穿孔。这些数据表明，tet2的编辑在基于小球的扩增过程时窗内导致cd8细胞百分比的小但一致的降低和cd4百分比的提高。
图15显示小球扩增10天后的细胞产率和活率。10天小球扩增过程之后通过cellometer测量每毫升的细胞数(左图)和细胞活率(右图)。细胞按所示用bcma-10car或cd19car转导或保持不转导(utd)。细胞用包含cas9蛋白质、示踪rna和所示靶向tet2的向导rna(靶向外显子3的ex3-3和靶向外显子9的ex9-6)的rnp电穿孔或不进行电穿孔。这些数据表明，tet2编辑导致细胞数目和活率和活率相对于无crispr/cas9的细胞提高，外显子9靶向向导(ex9-6)在未转导细胞以及car转导细胞中显示最大影响。
图16显示响应car所识别的抗原阳性或阴性细胞的il-2产生。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养，并测量分泌入培养基中的细胞因子。显示il-2(pg/ml)水平。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致t细胞的il-2产生响应抗原而增加，外显子9靶向向导(ex9-6)显示最大效应。
图17显示干扰素γ产生。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养，并测量分泌入培养基中的细胞因子。显示干扰素γ(ifn-g)(pg/ml)水平。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致t细胞的干扰素γ产生响应抗原而增加，外显子9靶向向导(ex9-6)显示最大效应。
图18显示抗原驱动的car-t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量car阳性t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致car+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图19显示抗原驱动的总t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量所有cd3+t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致cd3+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图20显示抗原驱动的car+t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量所有cd4+cd3+t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致cd4+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图21显示抗原驱动的car+cd4+t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量所有car+cd4+cd3+t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致car+cd4+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图22显示抗原驱动的cd8+t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量所有cd8+cd3+t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致cd8+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图23显示抗原驱动的car+cd8+t细胞增殖。将cart细胞或未转导的细胞(utd)与bcma阳性/cd19阴性细胞(kms11和ncih929)或bcma阴性/cd19阳性细胞(nalm6)共培养或无靶细胞(培养基)，并测量所有car+cd8+cd3+t细胞的增殖。按上文所述制备细胞。这些数据表明，tet2编辑导致car+cd8+t细胞增殖响应抗原而增加，外显子9靶向向导(crex9-6)显示最大效应。
图24显示通过引入靶向tet2的crispr/cas系统产生的％编辑和％移码编辑。显示电穿孔包含cas9蛋白质、示踪rna和所示靶向tet2外显子3或外显子9的向导rna的rnp后原代t细胞中的编辑水平。所观察到的相对于参考基因组的核苷酸插入或缺失百分比显示在中间栏中(平均％插入/缺失)。导致可读框中移码的编辑显示在最右侧栏中(平均％移码)。这些数据是三次重复的平均值。这些数据表明这些向导rna序列在原代t细胞中的高效基因组编辑。
通过下一代测序评估了存在于各grna靶位点处或附近的插入和缺失模式。简言之，用包含所示向导rna的rnp电穿孔t细胞。48小时后，分离dna并处理用于测序。图25显示针对靶向tet2外显子3的向导rna在原代t细胞中观察到的5种最常见插入缺失(插入和/或缺失)。图26显示针对靶向tet2外显子9的向导rna在原代t细胞中观察到的5种最常见插入缺失(插入和/或缺失)。百分比表示观察到给定编辑模式的频率。插入以小写核苷酸字母(“a”、“g”、“c”或“t”)表示，而缺失以破折号(“-”)显示。
atac-seq实验
从患者的输注后样品扩增含和不含tet2插入的cd8+t细胞。用高通量测序转座酶可接近染色质测定(atac-seq)评估了染色质可接近性。这本质上是进行基于“条码”dna片段转座的全染色质作图的技术。这些dna片段整合入开放染色质的区域，这允许测定哪些染色质区域是开放的而不是封闭的。根据开放或封闭区域的位置，可在“开放”等同于“表达”和“封闭”等同于“抑制”的假设下进行途经分析。图30a显示来自患者的具有tet2破坏的car+cd8+t细胞中的atac峰的venn图，与在匹配时间点来自同一患者的不含tet2破坏的car-cd8+t细胞相比较。图28b显示，与其对应物相比，atac峰相关的go项在具有tet2破坏的细胞群体中更封闭。图30b的意义至少部分是，具有tet2破坏的cd8+t细胞的染色质全貌可能符合更像“早期记忆细胞”而不太像“效应细胞”的低分化细胞。这些细胞是认为持续存在以提供强健和长期的抗肿瘤活性的那种细胞。
shrna研究
通过cd3/cd28包被的小球活化来自健康供体的t细胞24小时，然后进行非靶向(对照)shrna或tet2shrna的慢病毒转导。如图32中所示，通过qpcr评估敲减效率，并显示其为50％(可反映其中通过慢病毒整合破坏tet2的患者中所发生的情况)。在第14天通过检查ccr7、cd45ro检查了分化表型。中央记忆细胞定义为ccr7+cd45ro+，而效应细胞为ccr7-cd45ro-。为了尤其是在具有50％tet2敲减的细胞中检查分化表型，将gfp指示物用于shrna构建体中。结果显示在图32b和32c中。
在无进一步描述的情况下，认为本领域普通技术人员可以用前述描述和以下示例性实施例制备和利用本发明的化合物及实施所要求的方法。以下工作实施例尤其指出了本发明的多种方面，不解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
等同物
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以其整体引入作为参考。虽然参考具体方面公开了本发明，但显而易见的是，本领域其他技术人员可以想到本发明的其他方面和变通形式而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书旨在解释为包括所有这类方面和等同变通形式。