本申请要求于2016年9月29日提交的第62/234,299号美国临时专利申请的权益。上述专利申请通过引用整体并入本文以提供本发明的连续性。
本主题涉及由血浆的组分iii制备的静脉注射免疫球蛋白(ivig)及其应用，特别是用于治疗和预防丙型肝炎病毒。具体而言，本主题与从组分iii制备液体和冻干形式的ivig的过程有关，所述组分iii包含14种新发现的蛋白质，即kh26、kh27、kh28、kh29、kh30、kh31、kh32、kh33、kh39、kh40、kh41、kh42、kh43和kh44。
背景技术：
免疫球蛋白g(igg)是一种抗体并且是由四条肽链组成的蛋白质复合物-以抗体单体典型的y形排列的两条相同的重链和两条相同的轻链。每个igg有两个抗原结合位点。代表人类约75％的血清抗体，igg是循环系统中最常见的抗体类型。igg分子通常由血浆b细胞产生和释放。抗体是体液免疫的主要组成部分。igg是血液和细胞外液中发现的主要抗体类型，可以控制身体组织的感染。igg通过与多种病原体如病毒、细菌和真菌结合来控制身体组织的感染。在血浆衍生的工业中，igg通常从组分ii的人血浆中纯化。然而，可以从组分iii糊状物中沉淀出一定百分比的igg，其包括34种现有和新发现的蛋白质。
技术实现要素：
在本主题的一个实施方案中，发现34种现有的和新发现的蛋白质存在于从血浆提取的组分iii中。可以加工和纯化14种新发现的蛋白质和20种现有的蛋白质以制备免疫球蛋白(ivig)的静脉注射溶液。在一个实施方案中，高达20％用于人的ivig可以是从组分iii纯化的。在一个实施方案中，通过添加新发现的蛋白质，免疫球蛋白的静脉注射溶液不仅停止丙型肝炎病毒的复制，而且还防止丙型肝炎病毒的感染。
在34种蛋白质中，14种是根据本主题新发现的蛋白质。根据本主题，可以从组分iii糊状物中回收igg，其包括这14种新发现的用于针对丙型肝炎病毒静脉注射的蛋白质。该回收的产品不仅停止丙型肝炎病毒的复制，而且杀死丙型肝炎病毒。因此，可以预防丙型肝炎病毒的感染并最终从世界消灭。该回收的产品也可用于停止复制并防止其他病毒感染，即，禽流感。
在一个实施方案中，本主题涉及由血浆组分iii制备纯化的ivig的方法，包括以下步骤：
a)在氯化钠柠檬酸钠缓冲液中复原组分iii糊状物以获得复原的组分iii；
b)调节复原的组分iii的ph至3～8，温度为-5℃～30℃以获得调整后的组分iii；
c)将乙醇加入到调整后的组分iii中，最高达10～40％，然后逐渐降低温度至-10℃～20℃；
d)离心收集上清液；
e)用10cp+90sp过滤器过滤上清液以获得所得的溶液；
f)将所得溶液超滤去除醇；
g)进行弱阴离子交换色谱以收集流通溶液；
h)对流通溶液进行超滤以达到所期望的蛋白质浓度；
i)无菌过滤流通溶液；
j)用20nm过滤器纳米过滤流通溶液以去除病毒；以及
k)在低ph下温育流通溶液进行病毒灭活以获得包含纯化的ivig的所得组分iii的悬浮液。
附图说明
图1显示了从组分iii处理ivig的方法的流程图。
图2a～图2c显示了通过2d电泳分析的常规比较gammaraas(图2a)，组分iiiivig第一批(图2b)和组分iiiivig第二批(图2c)。在gammaraas中，发现了来自组分ii糊状物的公知的蛋白质，但是在来自组分iii的ivig中没有包含14个新发现的蛋白质。
图3显示了根据本主题的一个实施方案的ivig的血浆组分iii的sds-page。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与目前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在提供数值范围(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，在所述范围的上限和下限之间的以下限单位的十分之一为基准的每个中间值，以及在所述范围内的任何其他已说明的值或中间值均被涵盖在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这样的实施方案也涵盖在所述主题内，受到所述范围中的任何明确排除的端值的限制。在所述范围包括一个或两个端值的情况下，排除了所包括端值中任一者或两者的范围也包括在所述主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用措辞“包含”；然而，本领域技术人员将会理解，在某些特定情况下，可以替代地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。
为了更好地理解本教导且绝不限制本教导的范围，除非另有说明，表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其他数值应被理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。因此，除非有相反指示，在下面的说明书和所附权利要求书中提出的数字参数都是近似值，其可以根据所希望获得的性质而变化。最低限度，每个数字参数至少应该根据所报告的有效数字的数目并通过使用普通的四舍五入技术来解释。
本主题的一个实施方案涉及由血浆的组分iii制备纯化的ivig的方法，包括以下步骤：
a)在氯化钠柠檬酸钠缓冲液中复原组分iii糊状物以获得复原的组分iii；
b)调节复原组分iii的ph至3～8，并且温度为-5℃～30℃，以获得调整后的组分iii；
c)将乙醇加入调整后的组分iii中，最高达10～40％，然后逐渐降低温度至-10℃～20℃；
d)离心收集上清液；
e)用10cp+90sp过滤器过滤上清液以获得所得的溶液；
f)将所得溶液超滤以去除醇；
g)进行弱阴离子交换色谱以收集流通溶液；
h)对流通溶液进行超滤以达到所期望的蛋白质浓度；
i)无菌过滤流通溶液；
j)用20nm过滤器纳米过滤流通溶液以去除病毒；以及
k)在低ph下温育流通溶液进行病毒灭活以获得包含纯化的ivig的所得组分iii的悬浮液。
在一个实施方案中，组分iii糊状物可以通过科恩乙醇分离方法获得。在一个实施方案中，所得的组分iii悬浮液还包含一种或多种任意组合的蛋白质kh26、kh27、kh28、kh29、kh30、kh31、kh32、kh33、kh39、kh40、kh41、kh42、kh43和kh44。在一个实施方案中，将调整后的组分iii与冷醇轻轻混合以达到10～40％的最终浓度和-10℃～20℃的温度。可以将乙醇加入调整后的组分iii至18～20％，并且温度可以逐渐降低至-7℃～-5℃。
在本主题的一个实施方案中，流通溶液用10k截止膜超滤。从组分iii制备纯化的ivig的方法可以进一步包括调节流通溶液的蛋白质浓度和ph。在一个实施方案中，使用二乙氨基乙醇(deae)琼脂糖快速流动(ff)作为色谱介质进行弱阴离子交换色谱。在一个实施方案中，无菌过滤为0.22μm无菌过滤。
本主题的一个实施方案涉及从血浆组分iii制备纯化的ivig的方法，其中所得的组分iii悬浮液通过填装并在25℃下、ph为4的进行低ph温育21天获得病毒灭活。
此外，本主题的一个实施方案涉及停止在患者中复制丙型肝炎病毒的方法，所述方法包括用从由血浆组分iii制备纯化的ivig的方法获得的纯化的ivig对有此需要的患者进行给药。本主题的一个实施方案涉及杀死患者的丙型肝炎病毒的方法，包括用从由血浆组分iii制备纯化的ivig的方法获得的纯化ivig对有此需要的患者进行给药。本主题的一个实施方案涉及一种预防患者体内丙型肝炎病毒感染的方法，其包括用由制备来自血浆组分iii的纯化ivig的方法获得的纯化ivig对有此需要的患者进行给药。
此外，本主题的一个实施方案涉及治疗有需要的患者的方法，所述方法包括用由制备来自血浆组分iii的纯化的ivig的方法获得的纯化的ivig对患者进行给药，其中纯化的ivig转化或修复受损和有病的细胞以变成健康的细胞，其中纯化的ivig保护细胞改变，并且其中纯化的ivig向身体发送信号以产生健康的新细胞，从而防止新细胞受到细胞内和细胞外损伤信号的影响。
此外，本主题的一个实施方案涉及根据由血浆的组分iii制备纯化的ivig的方法制备纯化的ivig。纯化的ivig可进一步包含一种或多种任何组合的蛋白质kh26、kh27、kh28、kh29、kh30、kh31、kh32、kh33、kh39、kh40、kh41、kh42、kh43和kh44。纯化的ivig可以是液体形式或冻干形式。
本主题的一个实施方案涉及一种ivig，其包含根据由血浆的组分iii制造纯化的ivig的方法制备的至多20％的纯化的ivig。
体外测试
来自中国的一个顶级临床研究组织测试了从组分iii中纯化的ivig，具有14种新发现的蛋白质，其结论是组分iiiivig，代码名称afccraas6具有停止复制和杀死丙型肝炎病毒的能力。表1和表2显示了定量测试结果。
表1:乙型肝炎病毒(hbv)定量测试结果
表2：来自组分iii的ivig的丙型肝炎病毒(hcv)的定量测试结果
如图3所示，由血浆组分iii制备纯化的ivig的方法改善了血浆分离过程中蛋白质分离的有效性。在这方面，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)以使用laemmli法基于其分子量分离血浆组分iii的蛋白质。
利用本文所包含的信息，在不脱离所附权利要求的主旨和范围的情况下，对本主题所属领域的技术人员而言，对本主题精确描述的各种偏离将是显而易见的。由于优选实施方案和其他描述仅旨在说明当前提供的主题的特定方面，因此本主题不被认为在范围上局限于所定义的过程、特性或成分。实际上，对于化学、生物化学或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本主题的所描述模式的各种修改均旨在落入随附权利要求的范围内。