本发明涉及纤维化的诊断和治疗。
背景技术：
纤维化是一个重要的过程，是伤口愈合的关键部分。过度纤维化在许多罕见和常见疾病中很常见，并且在疾病发病机制中很重要。以过度纤维化为特征的疾病包括但不限于：系统性硬化症、硬皮病、肥厚性心肌病、扩张型心肌病(dcm)、心房纤维性颤动、心室纤维性颤动、心肌炎、肝硬化、肾脏疾病、眼部疾病、哮喘、囊性纤维化、关节炎和特发性肺纤维化。尽管对人类健康影响很大，但对纤维化的治疗和诊断方法的医疗需求仍然未得到满足。
白细胞介素11(il-11)的真正生理作用尚不清楚。il-11与造血细胞活化和血小板生成的关系最为密切，但也被发现具有促炎和抗炎、促血管生成的作用，并对瘤形成很重要。已知tgfβ1或组织损伤可诱导il-11的表达(zhu,m.etal.il-11attenuatesliverischemia/reperfusioninjury(iri)throughstat3signalingpathwayinmice.plosone10,(2015)；yashiro,r.etal.transforminggrowthfactor-betastimulatesinterleukin-11productionbyhumanperiodontalligamentandgingivalfibroblasts.j.clin.periodontol.33,165–71(2006)；obana,m.etal.therapeuticactivationofsignaltransducerandactivatoroftranscription3byinterleukin-11amelioratescardiacfibrosisaftermyocardialinfarction.circulation121,684-91(2010)；tang,w.,yang,l.,yang,y.c.,leng,s.x.&elias,j.a.transforminggrowthfactor-betastimulatesinterleukin-11transcriptionviacomplexactivatingprotein-1-dependentpathways.j.biol.chem.273,5506–13(1998))。
从已发表的文献来看，il-11在纤维化中的作用尚不清楚。il-11被认为对肺纤维化和炎症很重要(tang,w.etal.targetedexpressionofil-11inthemurineairwaycauseslymphocyticinflammation,bronchialremodeling,andairwaysobstruction.j.clin.invest.98,2845–53(1996))，其表达水平与皮肤(toda,m.etal.polarizedinvivoexpressionofil-11andil-17betweenacuteandchronicskinlesions.journalofallergyandclinicalimmunology111,875–881(2003))和呼吸系统(molet,s.,hamid,q.&hamilos,d.il‐11andil‐17expressioninnasalpolyps:relationshiptocollagendepositionandsuppressionbyintranasalfluticasonepropionate.thelaryngoscope113,(2003)；minshalletal.il-11expressionisincreasedinsevereasthma:associationwithepithelialcellsandeosinophils.thejournalofallergyandclinicalimmunology105,(2000))中的胶原水平相关。
然而，大多数研究表明il-11在心脏(obana,m.etal.therapeuticactivationofsignaltransducerandactivatoroftranscription3byinterleukin-11amelioratescardiacfibrosisaftermyocardialinfarction.circulation121,684–91(2010)；obana,m.etal.therapeuticadministrationofil-11exhibitsthepostconditioningeffectsagainstischemia-reperfusioninjuryviastat3intheheart.americanjournalofphysiology.heartandcirculatoryphysiology303,h569–77(2012))和肾脏(stangou,m.etal.effectofil-11onglomerularexpressionoftgf-betaandextracellularmatrixinnephrotoxicnephritisinwistarkyotorats.journalofnephrology24,106–11(2011)；ham,a.etal.criticalroleofinterleukin-11inisoflurane-mediatedprotectionagainstischemicacutekidneyinjuryinmice.anesthesiology119,1389–401(2013))中是抗纤维化的，在几种组织和慢性炎症疾病中的是抗炎的(trepicchio&dorner.thetherapeuticutilityofinterleukin-11inthetreatmentofinflammatorydisease.(1998).doi:10.1517/13543784.7.9.1501)。一般来说，il-11的分子作用模式被认为是通过stat3介导的转录调节rna表达的mrna水平(zhu,m.etal.il-11attenuatesliverischemia/reperfusioninjury(iri)throughstat3signalingpathwayinmice.plosone10,(2015))。
技术实现要素：
本发明的一个方面涉及通过施用能够抑制白细胞介素11(il-11)作用的试剂来治疗、预防或缓解需要治疗的受试者中的纤维化。本发明人鉴定了il-11具有促纤维化作用。本发明特别涉及抑制il-11的促纤维化作用。本发明的实施方案涉及il-11介导的(例如，由il-11与il-11受体结合介导的)促纤维化信号的抑制或预防。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂可以阻止或减少il-11与il-11受体的结合。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂可以结合il-11以形成包含试剂和il-11的复合物。所述复合物可以是非共价或共价复合物。在一些实施方案中，所述试剂il-11复合物的形成可以阻止或减少il-11结合il-11受体的能力。在一些实施方案中，这种阻止或减少可能是il-11与il-11受体的生产性结合减少，即il-11启动il-11受体介导的信号传导的能力减少的结果。在一些实施方案中，试剂il-11复合物的形成可使il-11与il-11受体隔离，由此阻止或减少il-11与il-11受体的接触和/或阻止或减少可用于结合il-11受体的il-11的数量。在一些实施方案中，所述试剂可以是诱饵受体。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂可以结合il-11受体。结合il-11受体的试剂可以阻止或减少il-11结合il-11受体(il-11r)的能力。
本发明的另一方面涉及通过施用能够阻止或减少il-11或il-11受体(il-11r)表达的试剂来治疗、预防或缓解需要治疗的受试者中的纤维化。
在本发明的一个方面中，提供了能够抑制白细胞介素11(il-11)作用的试剂，用于治疗或预防纤维化的方法中。
在本发明的另一方面，提供了能够抑制il-11作用的试剂在制备用于治疗或预防纤维化的方法中的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够抑制il-11作用的试剂。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂是能够阻止或减少il-11与il-11受体结合的试剂。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂是il-11结合剂。所述il-11结合剂可以选自抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体和小分子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述il-11结合剂是抗体。在一些实施方案中，所述il-11结合剂是诱饵受体。
在一些实施方案中，能够抑制il-11作用的试剂是il-11受体(il-11r)结合剂。所述il-11r结合剂可以选自抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体和小分子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述il-11r结合剂是抗体。
在本发明的另一方面，提供了能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂，用于治疗或预防纤维化的方法中。
在本发明的另一方面，提供了能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂在制备用于治疗或预防纤维化的方法中的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂。
在一些实施方案中，能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂是小分子或寡核苷酸。
在一些实施方案中，待治疗或预防的纤维化是心脏、肝脏或肾脏的纤维化。在一些实施方案中，待治疗或预防的纤维化是眼睛的纤维化。在一些实施方案中，纤维化存在于心脏中并且与肌肉组织的功能障碍或心脏的电特性或心脏壁或瓣膜的增厚有关。在一些实施方案中，纤维化存在于肝脏中并且与慢性肝病或肝硬化有关。在一些实施方案中，纤维化存在于肾脏中并且与慢性肾病有关。
在一些实施方案中，所述治疗或预防的方法包括向其中il-11或il-11r表达上调的受试者施用所述试剂。在一些实施方案中，所述治疗或预防方法包括向其中已被测定为il-11或il-11r表达上调的受试者施用所述试剂。在一些实施方案中，所述治疗或预防的方法包括测定受试者中il-11或il-11r表达是否上调并向其中il-11或il-11r表达上调的受试者施用所述试剂。
在本发明的另一方面中，提供了测定受试者对用能够抑制il-11的作用的试剂治疗或预防纤维化的适用性的方法，所述方法包括任选地在体外测定受试者中il-11或il-11r表达是否上调。
在本发明的另一个方面中，提供了筛选用能够抑制il-11作用的试剂治疗或预防纤维化的受试者的方法，所述方法包括任选地在体外测定受试者中il-11或il-11r表达是否上调。
在本发明的另一方面，提供了诊断受试者中的纤维化或发生纤维化的风险的方法，所述方法包括任选地在体外测定从受试者获得的样本中il-11或il-11r的上调。
在一些实施方案中，所述方法是确认疑似患有纤维化的受试者中纤维化的诊断的方法。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括筛选用能够抑制il-11作用的试剂或用能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂进行治疗的受试者。
在本发明的另一方面，提供了为患有或疑似患有纤维化的受试者提供预后的方法，所述方法包括任选地体外测定从受试者获得的样本中il-11或il-11r是否上调，并且基于所述测定，为用能够抑制il-11的作用的试剂或用能够阻止或减少il-11或il-11r的表达的试剂对受试者进行的治疗提供预后。
所述方法可以进一步包括筛选用能够抑制il-11作用的试剂或用能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂进行治疗的被测定为il-11或il-11r上调的受试者。
在本发明的另一方面，提供了诊断受试者中的纤维化或发生纤维化的风险的方法，所述方法包括任选地体外测定预测为其中il-11或il-11r表达上调或il-11或il-11r活性上调的受试者中的一种或多种遗传因子。
在一些实施方案中，所述方法是确认疑似患有纤维化的受试者中纤维化的诊断的方法。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括筛选用能够抑制il-11作用的试剂或用能够阻止或减少il-11或il-11r表达的试剂进行治疗的受试者。
在本发明的另一个方面中，提供了为患有或疑似患有纤维化的受试者提供预后的方法，所述方法包括任选地在体外测定预测为其中il-11或il-11r表达上调或il-11或il-11r活性上调的受试者中的一种或多种遗传因子。
在本发明的另一方面，提供了治疗人受试者纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的人受试者施用治疗有效量的抗白细胞介素11(il-11)抗体，其中抗il-11抗体结合il-11并抑制il-11介导的信号传导
在本发明的另一方面，提供了治疗受试者纤维化的方法，所述方法包括：
(i)任选地在体外测定受试者中il-11或白细胞介素11受体(il-11r)表达是否上调；和
(ii)向其中il-11或il-11r表达上调的受试者施用治疗有效量的抗il-11抗体，其中所述抗il-11抗体与il-11结合并抑制il-11介导的信号。
在本发明的另一方面，提供了治疗受试者纤维化的方法，所述方法包括：
(i)任选地在体外测定预测为其中白细胞介素11(il-11)或白细胞介素11受体(il-11r)表达或活性上调的受试者中一种或多种遗传因子；
(ii)基于(i)中的测定筛选待治疗的受试者；和
(ii)向所选受试者施用治疗有效量的抗il-11抗体，其中所述抗il-11抗体与il-11结合并抑制il-11介导的信号传导。
说明
il-11和il-11受体
白介素11(il-11)也称为脂肪生成抑制因子，是一种多效性细胞因子，是il-6细胞因子家族的一员，包括il-6、il-11、il-27、il-31、制瘤素、白血病抑制因子(lif)、心肌营养素-1(ct-1)、心肌营养素样细胞因子(clc)、睫状神经营养因子(cntf)和神经促生长因子(np-1)。
il-11用规范信号肽转录，确保从细胞有效分泌。未成熟形式的人il-11是199个氨基酸的多肽，而il-11的成熟形式编码178个氨基酸残基的蛋白质(garbersandscheller.,biol.chem.2013；394(9):1145-1161)。人il-11氨基酸序列可由uniprot登录号p20809(p20809.1gi：124294)获得。重组人il-11(奥普瑞白介素)也是市售的。来自其他物种的il-11也被克隆和测序，包括小鼠、大鼠、猪、牛、几种硬骨鱼和灵长类动物。
在本说明书中，il-11是指来自任何物种的il-11，并包括来自任何物种的il-11的同种型、片段、变体或同源物。在优选的实施方案中，所述物种是人类(智人(homosapiens))。il-11的同种型、片段、变体或同源物的特征任选地在于与来自给定物种(如人类)的未成熟或成熟il-11的氨基酸序列具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％的氨基酸序列同一性。il-11的同种型、片段、变体或同源物的特征任选地在于结合il-11rα(优选来自相同物种)并刺激表达il-11rα和gp130的细胞中的信号转导的能力(例如，curtisetal.blood,1997,90(11)；或karpovichetal.mol.hum.reprod.20039(2):75-80。il-11的片段可以具有任何长度(按氨基酸的数量)，尽管可以任选地为成熟il-11长度的至少25％，并且最大长度可以为成熟il-11长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。il-11的片段的最小长度可以为10个氨基酸，并且最大长度为15、20、25、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或195个氨基酸。
il-11通过无处不在表达的β-受体糖蛋白130(gp130；也称为糖蛋白130，il6st，il6-β或cd130)的同源二聚体发出信号。gp130是跨膜蛋白，与il-6受体家族形成i型细胞因子受体的一个亚基。尽管与α受体的最初细胞因子结合事件导致与β受体的最终复合物形成，但通过单独的不直接参与信号转导的il-11α-受体(il-11rα)获得特异性。il-11激活下游信号传导途径，其主要是丝裂原活化蛋白激酶(mapk)-级联和janus激酶/信号转导因子和转录激活因子(jak/stat)途径(garbers和scheller，同上)。
人gp130(包括含22个氨基酸的信号肽)是一个包含918个氨基酸的蛋白质，成熟形式为866个氨基酸，包含597个氨基酸的胞外结构域、22个氨基酸的跨膜结构域和277个氨基酸的胞内结构域。蛋白质的胞外结构域包含gp130的细胞因子结合模块(cbm)。gp130的cbm包含lg样结构域d1和gp130的纤连蛋白iii型结构域d2和d3。人gp130的氨基酸序列可从genbank登录号np_002175.2获得。
人il-11rα是含422个氨基酸的多肽(genbank登录号np_001136256.1gi：218505839)并且与鼠il-11rα具有～85％的核苷酸和氨基酸序列同一性(duandwilliams.,bloodvol,89,no,11,june1,1997)。已经报道了il-11rα的两种同种型，其区别在于胞质结构域(du和williams，同上)。il-11受体α链(il-11rα)与il-6受体α链(il-6rα)具有许多结构和功能上的相似性。细胞外结构域显示24％的氨基酸同一性，包括特征性的保守性trp-ser-x-trp-ser(wsxws)基序。短细胞质结构域(34个氨基酸)缺少激活jak/stat信号传导途径所需的box1和2区域。
il-11rα以低亲和力(kd～10nmol/l)结合其配体并且单独不足以转导生物学信号。产生能够进行信号转导的高亲和力受体(kd～400至800pmol/l)需要il-11rα和gp130的共表达(curtisetal(blood1997dec1；90(11):4403-12；hiltonetal.,emboj13:4765,1994；nandurkaretal.,oncogene12:585,1996)。il-11与细胞表面il-11rα的结合可诱导如上所述的异二聚化、酪氨酸磷酸化、激活gp130和mapk和/或jak/stat信号传导。
已经绘制了鼠il-11上的受体结合位点并鉴定了三个位点，即位点i、ii和iii。通过位点ii区域的替换和位点iii区域的替换，减少与gp130的结合。位点iii突变体显示无可检测的激动剂活性并具有il-11rα拮抗剂活性(cytokineinhibitorschapter8；editedbygennarocilibertoandroccosavino,marceldekker,inc.2001)。
原则上，可溶性il-11rα也可以与il-11形成生物活性可溶性复合物(pflanz等，1999febslett，450,117-122)，这提高了il-11可能在一些情况下在结合细胞表面gp130之前结合可溶性il-11rα的可能性，这一点与il-6类似(garbers和scheller，同上)。curtisetal(blood1997dec1；90(11):4403-12)描述了可溶性鼠il-11受体α链(sil-11r)的表达并检测了表达gp130的细胞中的信号传导。在存在gp130而非跨膜il-11r的情况下，sil-11r介导m1白血病细胞的il-11依赖性分化和ba/f3细胞中的增殖以及早期细胞内事件，包括gp130、stat3和shp2的磷酸化，类似于通过跨膜il-11r的信号传导。
在本说明书中，il-11受体(il-11r)是指能够结合il-11并在表达gp130的细胞中诱导信号转导的多肽。il-11受体可以来自任何物种，包括来自任何物种的il-11受体的同种型、片段、变体或同源物。在优选的实施方案中，物种是人类(智人(homosapiens))。在一些实施方案中，il-11受体可以是il-11rα。il-11rα的同种型、片段、变体或同源物的特征可任选地在于与给定物种(例如人类)的il-11rα的氨基酸序列具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。il-11rα的同种型、片段、变体或同源物的特征可任选地在于结合il-11(优选来自相同物种)并且刺激表达il-11rα和gp130的细胞中的信号转导的能力(例如如curtisetal.blood,1997,90(11)或karpovichetal.mol.hum.reprod.20039(2):75-80))。il-11受体的片段可以具有任何长度(按氨基酸的数量)，尽管可以任选地为成熟il-11rα长度的至少25％并且最大长度为成熟il-11rα的长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。il-11受体片段的片段可以具有10个氨基酸的最小长度，并且最大长度为15、20、25、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或415个氨基酸。
能够抑制il-11的作用的试剂
il-11信号传导途径为抑制il-11信号传导提供了多种途径。例如，可以通过阻止或减少il-11与il-11受体的结合来实现抑制。因此，合适的试剂可以靶向il-11或其受体。
在一些实施方案中，能够抑制il-11的作用的试剂可以与il-11结合并阻止或减少il-11介导的信号传导，例如，通过il-11受体。在一些实施方案中，能够抑制il-11的作用的试剂可以与il-11受体结合并阻止或减少il-11刺激的信号传导。
结合il-11的试剂可以通过阻断il-11与il-11受体的结合和/或通过减少可用于结合其受体的il-11的数量，来抑制il-11介导的信号传导。合适的il-11结合剂可以是il-11抑制剂或il-11拮抗剂。
根据本发明，il-11结合剂(例如抗il-11抗体)可表现出至少一种以下性质：
a)以1μm或更低，优选≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤100pm的kd结合人il-11；
b)通过il-11rα受体抑制il-11介导的信号传导，例如，在基于细胞的试验中，其中细胞共表达il-11rα和gp130。合适的基于细胞的试验是3h-胸苷掺入法和ba/f3细胞增殖试验，参见curtisetal.blood,1997,90(11)andkarpovichetal.mol.hum.reprod.20039(2):75-80。例如，il-11结合剂的ic50可以通过在人il-11和il-11结合剂存在下培养表达il-11rα和gp130的ba/f3细胞并测定掺入dna中的3h-胸苷来确定。在此类试验中，合适的il-11结合剂表现出的ic50可为10μg/ml或更少，优选≤5μg/ml、≤4μg/ml、≤3.5μg/ml、≤3μg/ml、≤2μg/m、≤1μg/ml、≤0.9μg/ml、≤0.8μg/ml、≤0.7μg/ml、≤0.6μg/ml或≤0.5μg/ml中的一种。
c)抑制成纤维细胞增殖，例如心脏/心房成纤维细胞的增殖。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且如本文所述监测细胞增殖的试验中评估。
d)抑制肌成纤维细胞产生，例如来自心脏/心房成纤维细胞。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且通过如测量αsma水平等监测肌成纤维细胞产生的试验中评估。
e)抑制成纤维细胞的细胞外基质产生，例如，心脏/心房成纤维细胞。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且测量细胞外基质成分的产生的试验中评估。
f)抑制成纤维细胞中的胶原蛋白和/或骨膜蛋白基因或蛋白质表达，例如心脏/心房成纤维细胞。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且测量胶原蛋白和/或骨膜蛋白基因或蛋白质表达的试验中评估。
il-11结合剂可以是任何种类的，但在一些实施方案中，il-11结合剂可以是抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体或小分子。
合适的抗il-11抗体将优选结合il-11(抗原)，优选人il-11，并且可以具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤100pm的解离常数(kd)。通常以其解离常数(kd)来描述抗体对其靶标的结合亲和力。结合亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过表面等离子体共振(spr)或通过用fab形式的抗体和抗原分子进行的放射性标记的抗原结合测定(ria)来测量。
抗il-11抗体可以是抑制或减少il-11的生物学活性的拮抗剂抗体。
抗il-11抗体可以是中和il-11的生物效应的中和抗体，例如，它通过il-11受体刺激生产性信号传导的能力。
中和活性可以通过中和t11小鼠浆细胞瘤细胞系中il-11诱导的增殖的能力来测量(nordan,r.p.etal.(1987)j.immunol.139:813)。
已知的抗il-11抗体的实例包括单克隆抗体克隆6d9a、克隆kt8(abbiotec)、克隆m3103f11(biolegend)、克隆1f1、克隆3c6(abnovacorporation)、克隆gf1(lifespanbiosciences)、克隆13455(sourcebioscience)和克隆22626(r&dsystems，用于nat.commun.(2013)4(0):1393单克隆小鼠lgg2a；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)。
可任选地选择抗体以表现出与一种或多种人(例如重组人)il-6、cntf、lif、osm、clc或ct-1基本上无交叉反应性。
基于肽或多肽的il-11结合剂可以基于il-11受体，例如，il-11受体的il-11结合片段。在一个实施方案中，合适的il-11结合剂可以包含il-11rα链的il-11结合片段，并且可以优选可溶和/或排除一个或多个或全部跨膜结构域。这样的分子可以被描述为诱饵受体。
curtisetal(blood1997dec1；90(11):4403-12)报道当在表达跨膜il-11r和gp130的细胞上测试时可溶性鼠il-11受体α链(sil-11r)能够拮抗il-11的活性。他们提出，观察到的sil-11r的il-11拮抗作用取决于已经表达跨膜il-11r的细胞上gp130分子数量的限制。
可溶性诱饵受体作为抑制信号转导和治疗干预的基础的用途也已有报道用于其他信号传导分子：受体对，例如，vegf和vegf受体(de-chaoyuetal.,moleculartherapy(2012)；205,938-947；konneranddupontclincolorectalcancer2004oct；4suppl2:s81-5)。
如此，在一些实施方案中，可以以诱饵受体的形式提供il-11结合剂，例如，一种可溶性il-11受体。已经报道由诱饵受体提供的il-11竞争导致il-11拮抗剂作用(curtis等，同上)。
诱饵il-11受体优选结合il-11和/或含有il-11的复合物，从而使这些物质不能与gp130、il-11rα和/或gp130：il-11rα受体结合。因此，它们充当il-11和含有il-11的复合物的“诱饵”受体，这与依那西普充当tnfα的诱饵受体的方式非常相似。与不存在诱饵受体时的信号传导水平相比，il-11介导的信号传导减少。
诱饵il-11受体优选通过一种或多种细胞因子结合模块(cbm)与il-11结合。cbm是或来源于或同源于il-11的天然存在的受体分子的cbm。例如，诱饵il-11受体可以包含一种或多种来自或来源于或同源于gp130和/或il-11rα的cbm的cbm，或由其组成。
在一些实施方案中，诱饵il-11受体可以包含对应于gp130的细胞因子结合模块的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，诱饵il-11受体可以包含对应于il-11rα的细胞因子结合模块的氨基酸序列。本文中，与给定肽/多肽的参照区域或序列“对应”的氨基酸序列与参考区域/序列的氨基酸序列具有至少60％，如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。gp130、il-11rα和il-11可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体或同源物。
在一些实施方案中，诱饵受体可能能够结合il-11，例如，具有至少100μm或更低的结合亲和力，任选10μm或更低、1μm或更低、100nm或更低、或约1至100nm中的一种。在一些实施方案中，诱饵受体可以包含全部或部分il-11结合结构域，并且可以任选缺乏全部或部分跨膜结构域。诱饵受体可以任选地与免疫球蛋白恒定区(例如，lggfc区)融合。
在一些实施方案中，il-11结合剂可以以il-11的小分子抑制剂的形式提供，例如，layetal.,int.j.oncol.(2012)；41(2):759-764中描述的il-11抑制剂。
结合il-11受体(il-11r)的试剂可以通过阻断il-11与il-11r的结合或通过阻止经由gp130共受体的信号转导来抑制il-11介导的信号传导。合适的il-11r结合剂可以是il-11r抑制剂或il-11r拮抗剂。在优选的实施方案中，il-11r是il-11rα，并且合适的结合剂可以结合il-11rα多肽并且可以是il-11rα的抑制剂或拮抗剂。
根据本发明，il-11r结合剂(例如抗il-11r抗体)可表现出至少一种以下性质：
(a)以1μm或更低，优选≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤100pm的kd结合人il-11r；
(b)抑制il-11r信号传导，例如在基于细胞的试验中，其中细胞共表达il-11rα和gp130。合适的基于细胞的试验是例如3h-胸苷掺入法和ba/f3细胞增殖试验，参见curtisetal.blood,1997,90(11)和karpovichetal.mol.hum.reprod.20039(2):75-80。例如，il-11r结合剂的ic50可以通过在人il-11和il-11r结合剂存在下培养表达il-11rα和gp130的ba/f3细胞并测定掺入dna中的3h-胸苷来确定。在此类试验中，合适的il-11r结合剂可表现出的ic50可为10μg/ml或更少，优选≤5μg/ml、≤4μg/ml、≤3.5μg/ml、≤3μg/ml、≤2μg/m、≤1μg/ml、≤0.9μg/ml、≤0.8μg/ml、≤0.7μg/ml、≤0.6μg/ml或≤0.5μg/ml中的一种。
(c)抑制成纤维细胞增殖，例如心脏/心房成纤维细胞的增殖。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且如本文所述监测细胞增殖的试验中评估。
(d)抑制肌成纤维细胞的产生，例如来自心脏/心房成纤维细胞。例如，这可以在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且通过如测量αsma水平等监测肌成纤维细胞产生的试验中评估。
(e)抑制成纤维细胞产生的细胞外基质，例如心脏/心房成纤维细胞。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且测量细胞外基质成分的产生的试验中评估。
(f)抑制成纤维细胞中的胶原蛋白和/或骨膜蛋白基因或蛋白质表达，例如心脏/心房成纤维细胞。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞并且测量胶原蛋白和/或骨膜蛋白基因或蛋白质表达的试验中评估。
il-11r结合剂可以是任何种类的，但在一些实施方案中，il-11r结合剂可以是抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体或小分子。
合适的抗il-11r抗体将优选结合il-11r(抗原)，优选人il-11r，并且可以具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤100pm的解离常数(kd)。通常以其解离常数(kd)来描述抗体对其靶标的结合亲和力。结合亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过表面等离子体共振(spr)或通过用fab形式的抗体和抗原分子进行的放射性标记的抗原结合测定(ria)来测量。
抗il-11r抗体可以是抑制或减少il-11r生物活性的拮抗性抗体。抗il-11r抗体可以是抑制或减少il-11r的任何功能的拮抗剂抗体，特别是信号传导。例如，拮抗剂il-11r抗体可以抑制或阻止il-11与il-11r的结合，或者可以抑制或阻止il-11rα与gp130缔合以形成能够产生信号传导的功能性受体复合物，例如响应于il-11的结合。
抗il-11r抗体可以是中和il-11r的生物效应的中和抗体，例如，其启动由il-11结合介导的生产性信号传导的能力。
中和活性可以通过中和t11小鼠浆细胞瘤细胞系中il-11诱导的增殖的能力来测量(nordan,r.p.etal.(1987)j.immunol.139:813)。
已知的抗il-11r抗体的例子包括us2014/0219919a1中描述的单克隆抗体克隆025(sinobiological)、克隆epr5446(abcam)、克隆473143(r&dsystems)、克隆8e2和8e4，以及blanc等人(j.immunolmethods.2000jul31；241(1-2)；43-59)所述的单克隆抗体。
基于肽或多肽的il-11r结合剂可以基于il-11，例如，il-11的突变体、变体或结合片段。合适的基于肽或多肽的试剂可以以不导致信号转导启动或产生次优信号传导的方式与il-11r结合。这种il-11突变体可以作为内源性il-11的竞争性抑制剂。
例如，w147a是il-11拮抗剂，其中氨基酸147从色氨酸突变为丙氨酸，其破坏il-11的所谓“位点iii”。该突变体可与il-11r结合，但gp130同源二聚体的接合失败，导致有效阻断il-11信号传导(underhill-dayetal.,2003；endocrinology2003aug；144(8):3406-14)。lee等(amjrespirecellmolbiol.2008dec；39(6):739-746)也报道了能够特异性抑制il-11结合到il-11rα的il-11拮抗剂突变体(“突变蛋白”)的产生。
menkhorst等(biologyofreproductionmay1,2009vol.80no.5920-927)描述了peg化il-11拮抗剂pegil11a(csllimited，parkvill，victoria，australia)，可有效抑制雌性小鼠中il-11在il-11中的作用。
pasqualini等cancer(2015)121(14)：2411-2421描述了能够结合il-11rα的配体导向的拟肽药物，骨转移靶向肽模拟物-11(bmtp-11)。
在一些实施方案中，il-11r结合剂可以以il-11r的小分子抑制剂的形式提供。
本发明人已经鉴定出il-11表达的上调与纤维化的分子机制一致，并且抑制il-11活性导致纤维化的分子基础的减少。因此，在本发明的一些方面，可以通过施用能够阻止或减少受试者细胞(例如，成纤维细胞或肌成纤维细胞)表达il-11的试剂来提供纤维化的治疗、预防或缓解。
合适的试剂可以是任何种类的，但是在一些实施方案中，能够阻止或减少il-11表达的试剂可以是小分子或寡核苷酸。
taki等人(clinexpimmunol.1998apr；112(1):133-138)报道了在用吲哚美辛、地塞米松或干扰素-γ(ifnγ)治疗后，类风湿滑膜细胞中il-11表达的减少。
在一些实施方案中，能够阻止或减少il-11表达的试剂可以是能够抑制或沉默il-11表达的寡核苷酸。
因此，本发明还包括本领域已知的用于治疗性下调il-11表达的技术的应用。这些包括使用反义寡核苷酸和rna干扰(rnai)。如同在本发明的其他方面一样，这些技术可用于纤维化的治疗。
因此，在本发明的一个方面中，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够阻止或减少il-11表达的试剂，其中所述试剂包含载体，该载体包含能够抑制或沉默il-11表达的治疗性寡核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够阻止或减少il-11表达的试剂，其中所述试剂包含寡核苷酸载体，任选为病毒载体，编码能够在受试者的细胞中表达的治疗性寡核苷酸，所表达的治疗性寡核苷酸能够抑制或沉默il-11的表达。
试剂阻止或减少il-11表达的能力可以通过测定试剂抑制成纤维细胞或肌成纤维细胞(如心脏/心房成纤维细胞或肌成纤维细胞)的il-11基因或蛋白质表达的能力来测定。这可以例如在其中用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞或肌成纤维细胞并且测量il-11基因或蛋白质表达的试验中评估。
可用于结合il-11和启动生产性信号传导的il-11r的量的减少提供了减少il-11刺激的信号传导水平的替代手段。因此，在本发明的相关方面，可以通过施用能够阻止或减少受试者细胞(例如，成纤维细胞或肌成纤维细胞)表达il-11r的试剂来提供纤维化的治疗、预防或缓解。
在一些实施方案中，能够阻止或减少il-11r表达的试剂可以是能够抑制或沉默il-11r表达的寡核苷酸。
因此，本发明还包括本领域已知的用于治疗性下调il-11r表达的技术的应用。这些包括使用反义寡核苷酸和rna干扰(rnai)。如同在本发明的其他方面一样，这些技术可用于纤维化的治疗。
因此，在本发明的一个方面中，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够阻止或减少il-11r表达的试剂，其中该试剂包含含有能够抑制或沉默il-11r表达的治疗性寡核苷酸的载体。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防纤维化的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的能够阻止或减少il-11r表达的试剂，其中所述试剂包含寡核苷酸载体，任选为病毒载体，编码能够在受试者的细胞中表达的治疗性寡核苷酸，所表达的治疗性寡核苷酸能够抑制或沉默il-11r的表达。
试剂阻止或减少il-11r表达的能力可以通过测定试剂抑制成纤维细胞或肌成纤维细胞(如心脏/心房成纤维细胞或肌成纤维细胞)的il-11r基因或蛋白质表达的能力来测定。这可以例如在用il-11或tgfβ1刺激成纤维细胞或肌成纤维细胞并且测量il-11r基因或蛋白质表达的试验中评估。
在优选的实施方案中，il-11r可以是il-11rα。
抗体
在本说明书中，“抗体”包括抗体的片段或衍生物，或合成抗体或合成抗体片段。
抗体可以以分离或纯化的形式提供。抗体可以配制成药物组合物或药物。
鉴于当今与单克隆抗体技术有关的技术，抗体可以制备成大多数抗原。抗原结合部分可以是抗体的一部分(例如fab片段)或合成抗体片段(例如单链fv片段[scfv])。针对所选抗原的合适单克隆抗体可通过已知技术制备，例如在“monoclonalantibodies:amanualoftechniques”，hzola(crcpress，1988)和“monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplications”，jgrhurrell(crcpress，1982)所公开的技术。neuberger等(1988，第8届国际生物技术研讨会第2部分，792-799)讨论了嵌合抗体。
单克隆抗体(mab)可用于本发明的方法中，并且是特异性靶向抗原上的单个表位的抗体的同源群体。
多克隆抗体可用于本发明的方法中。优选单特异性多克隆抗体。合适的多克隆抗体可以使用本领域公知的方法制备。
也可以使用/提供抗体的抗原结合片段，如fab和fab2片段，作为可以遗传工程改造的抗体和抗体片段。抗体的可变重链(vh)和可变轻链(vl)结构域参与抗原识别，这一事实首先被早期蛋白酶消化实验所识别。通过啮齿动物抗体的“人源化”发现了进一步的确认。啮齿动物起源的可变结构域可以与人起源的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿类亲合抗体的抗原特异性(morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa81,6851-6855)。
该抗原特异性由可变结构域赋予，并且独立于恒定结构域，这是从涉及含有一个或多个可变结构域的抗体片段的细菌表达的实验中得知。这些分子包括fab样分子(better等(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等(1988)science240,1038)；单链fv(scfv)分子，其中vh和vl互作伙伴结构域通过柔性寡肽连接(bird等(1988)science242,423；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)，和包含分离的v结构域的单结构域抗体(dabs)(ward等(1989)nature341,544)。winter&milstein(1991)nature349,293-299综述了合成保留其特异性结合位点的抗体片段所涉及的技术。
“scfv分子”是指其中vh和vl互作伙伴结构域共价连接(例如通过柔性寡肽)的分子。
fab、fv、scfv和dab抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，从而可以容易地产生大量的所述片段。
完整抗体和f(ab')2片段是“二价”的。所谓“二价”是指所述抗体和f(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相反，fab、fv、scfv和dab片段是单价的，则仅具有一个抗原结合位点。结合il-11或il-11r的合成抗体也可以使用本领域公知的噬菌体展示技术来制备。
抗体可通过亲和力成熟过程产生，其中产生修饰的抗体，其与未修饰的亲本抗体相比，改善了抗原亲和力。亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法产生，例如marks等，rio/technology10：779-783(1992)；barbas等procnat.acd.sci.usa91：3809-3813(1994)；schier等，gene169：147-155(1995)；yelton等，j.immunol.155：1994-2004(1995)；jackson等，j.immunol.154(7)：3310-159(1995)；和hawkins等，j.mol.biol.226：889-896(1992)。
根据本发明的抗体较佳地表现出对il-11或il-11r的特异性结合。特异性结合靶分子的抗体较佳地以比结合其它靶标更大的亲和力和/或更长的持续时间结合该靶标。在一个实施方案中，抗体与无关靶标的结合程度比抗体与靶标结合程度小约10％，例如通过elisa或放射免疫测定法(ria)测量。或者，结合特异性可以以抗体与il-11或il-11r结合的结合亲和力来反映，其中kd为至少0.1个数量级(即0.1×10n，其中n是代表顺序的整数)，大于抗体对另一种靶分子的kd，例如il-11家族的另一个成员，如il-6或il-6受体。这可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中的一个。
抗体可以被可检测地标记，或者至少能够被检测到。此类抗体可用于体内(例如成像方法)和体外(例如测定方法)应用。例如，抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或易于检测的分子标记以任何其他方式。合适的可检测分子包括荧光蛋白、萤光素酶、酶底物和放射性标记。结合部分可以用可检测标记直接标记，或者可以间接标记。例如，结合部分可以是未标记的抗体，其可以被本身标记的另一种抗体检测到。或者，第二抗体可能与生物素结合，标记的抗生蛋白链菌素与生物素的结合用于间接标记第一抗体。
本发明的各方面包括双特异性抗体，如由两种不同抗体的两种不同片段组成，使得双特异性抗体结合两种类型的抗原。其中一种抗原是il-11或il-11r，双特异性抗体包含本文所述的与il-11或il-11r结合的片段。抗体可以含有对第二抗原具有亲和力的不同片段，其可以是任何期望的抗原。用于制备双特异性抗体的技术在本领域是公知的，例如，参见mueller，d等(2010biodrugs24(2)：89-98)，wozniak-knoppg等，(2010proteinengdes23(4)：289-297，baeuerle，pa等，(2009cancerres69(12)：4941-4944)。
在一些实施方案中，双特异性抗体作为两种单链可变片段(scfv)形式的融合蛋白提供，其包含il-11或il-11r结合抗体或抗体片段的vh和vl以及另一种抗体或抗体片段的vh和vl。
双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以任何合适的形式提供，例如kontermannmabs2012,4(2)：182-197中描述的那些形式，其全文通过引用并入本文。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体缀合物(例如lgg2，f(ab')2或covx-body)、双特异性lgg或lgg样分子(例如igg、scfv4-lg、lgg-scfv、scfv-lgg、dvd-lg、lgg-svd、svd-lgg、2合1lgg、mab2或tandemab常见lc)、不对称双特异性lgg或lgg样分子(例如kihlgg、kihlgg常见lc、crossmab、kihlgg-scfab、mab-fv、电荷对或seed-body)、小双特异性抗体分子(例如双抗体(db)、dsdb、dart、scdb、tandabs、串联scfv(tafv)、串联dab/vhh、三体、三头、fab-scfv或f(ab’)2-scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如tafv-fc、二-双抗体、scdb-ch3、scfv-fc-scfv、hcab-vhh、scfv-kih-fc或scfv-kih-ch3)或双特异性融合蛋白(例如scfv2-白蛋白、scdb-白蛋白、tafv-毒素、dnl-fab3、dnl-fab4-igg、dnl-fab4-igg-细胞因子2)。具体参见kontermannmabs2012,4(2)：182-19的图2。
生产双特异性抗体的方法包括化学交联抗体或抗体片段，例如通过可还原的二硫键或不可还原的硫醚键，参见segal和bast，2001，双特异性抗体的生产，currentprotocolsinimmunology.14:iv:2.13:2.13.1–2.13.16，其全文通过引用并入本文。例如，可以使用n-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(spdp)进行化学交联，例如fab片段经由铰链区sh-基团以产生二硫键连接的双特异性f(ab)2异二聚体。
生产双特异性抗体的其他方法包括融合产生抗体的杂交瘤例如与聚乙二醇反应以产生能够分泌双特异性抗体的四联体细胞，参见segal和bastb.j.，2001，双特异性抗体的生产，currentprotocolsinimmunology.14:iv:2.13:2.13.1–2.13.16。
双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以重组产生，例如，通过从编码用于抗原结合分子的多肽的核酸构建体表达，参见《抗体工程：方法与方案》，第二版(humanapress，2012)，第40章：双特异性抗体的生产：双抗体和串联scfv(hornig和
例如，可以通过分子克隆技术来制备编码用于两个抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域(即，用于能够结合il-11或il-11r的抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域以及用于能够结合另一靶蛋白的抗原结合结构域的轻链和重链的可变链结构域)并且包括编码抗原结合结构域之间的合适接头或二聚化结构域的序列的dna构建体。随后可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如在体外)构建体产生重组双特异性抗体，然后任选纯化表达的重组双特异性抗体。
适体
适体，也称为核酸配体，是以通过高特异性和高亲和力结合靶分子的能力为特征的核酸分子。迄今为止鉴定的适体几乎所有都是非天然存在的分子。
给定靶标(例如il-11或il-11r)的适体可以通过指数富集的配体系统进化(selextm)的方法来鉴定和/或产生。适体和selex参见tuerk和gold(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment：rnaligandstobacteriophaget4dnapolymerase.science.1990aug3,249(4968)：505-10)和wo91/19813中。
适体可以是dna或rna分子，并且可以是单链或双链的。适体可以包含化学修饰的核酸，例如其中糖和/或磷酸酯和/或碱被化学修饰的核酸。此类修饰可以提高适体的稳定性或使得适体更耐降解，并且可以包括在核糖的2'位上的置修饰。
适体可以通过本领域技术人员熟知的方法合成。例如，适体可以是化学合成的，例如，在固体载体上。
固相合成可以使用亚磷酰胺化学。简而言之，固载核苷酸脱三苯甲基化，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸三酯键。随后可以发生封端，接着用氧化剂(通常为碘)氧化亚磷酸三酯。然后可以重复该循环以组装适体。
适体可以被认为是单克隆抗体的核酸等同物，并且通常具有nm或pm范围内的kd，例如，小于500nm、100nm、50nm、10nm、1nm、500pm、100pm中的一个。与单克隆抗体一样，它们几乎可用于需要靶结合的任何情况，包括在体外或体内的治疗和诊断应用中。体外诊断应用可以包括检测靶分子的存在或不存在的用途。
根据本发明的适体可以以纯化或分离形式提供。根据本发明的适体可以配制成药物组合物或药物。
合适的适体的最小长度可以任选地为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸
合适的适体的最大长度可以任选地为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的核苷酸序列
合适的适体的长度可以任选地为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、55、56号、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、或80个核苷酸。
il-11或il-11r表达的寡核苷酸抑制
寡核苷酸分子，特别是rna，可用于调节基因表达。这些包括反义寡核苷酸，通过小干扰rna(sirna)靶向降解mrna，转录后基因沉默(ptg)，通过微rna(mirna)发育调节的序列特异性翻译抑制和靶向转录基因沉默。
反义寡核苷酸是一种通过互补序列结合靶向和结合靶寡核苷酸(如mrna))的寡核苷酸，优选单链。在目标寡核苷酸是mrna的情况下，反义物与mrna的结合阻断mrna的翻译和基因产物的表达。可以设计反义寡核苷酸以结合正义基因组核酸并抑制靶核苷酸序列的转录。
基于il-11的已知核酸序列(例如可从
il-11或il-11r表达抑制将优选导致细胞(如成纤维细胞或肌成纤维细胞)表达的il-11或il-11r的量减少。例如，在给定的细胞中，通过施用合适的核酸对il-11或il-11r的抑制将导致该细胞表达的il-11或il-11r的量相对于未处理的细胞减少。抑制可能是部分的。优选的抑制程度为至少50％，更优选至少60％、70％、80％、85％或90％中的一个。90％至100％之间的抑制水平被认为是表达或功能的“沉默”。
rnai机器和小rna在靶向异染色质复合物和特定染色体基因位点上的表观遗传学基因沉默中的作用已经得到证明。双链rna(dsrna)依赖的转录后沉默也称为rna干扰(rnai)，其中dsrna复合物可以在短时间内靶向特定的同源基因进行沉默。它作为促进具有序列同一性的mrna降解的信号。20-nt的sirna通常足够长以诱导基因特异性沉默，但足够短以避免宿主反应。靶向基因产物表达的减少可以通过少数分子的sirna诱导的90％沉默而扩大。基于rnai的疗法已经进入用于多种适应症的i、ii和iii期临床试验(nature2009jan22；457(7228)：426-433)。
在本领域中，这些rna序列根据其来源被称为“短或小干扰rna”(sirna)或“微rna”(mirna)。这两种序列可以用来通过与互补rna结合并触发mrna消除(rnai)或阻止mrna翻译成蛋白质，来下调基因表达。sirna通过处理长双链rna衍生而来，在自然界中发现的通常是外源起源的。微干扰rna(mirna)是内源编码的小非编码rna，通过处理短发夹得到。sirna和mirna都可以抑制具有部分互补靶序列的mrna的翻译而无需rna切割，并降解具有完全互补序列的mrna。
因此，本发明提供了寡核苷酸序列在下调il-11或il-11r表达中的用途。
sirna配体通常是双链的，并且为了优化rna介导的靶基因功能下调的有效性，优选选择sirna分子的长度以确保通过risc复合物正确识别sirna，risc复合物通过mrna靶标的sirna介导识别，使得sirna足够短以减少宿主响应。
mirna配体通常是单链的，并且具有部分互补的区域，使配体能够形成发夹。mirna是从dna转录但不翻译成蛋白质的rna基因。编码mirna基因的dna序列比mirna长。该dna序列包括mirna序列和近似的反向互补序列。当该dna序列转录成单链rna分子时，mirna序列及其反向互补碱基对形成部分双链rna片段。johnetal,plosbiology,11(2),1862-1879,2004中讨论了微小rna序列的设计。
通常，旨在模拟sirna或mirna的作用的rna配体具有10至40个核糖核苷酸(或其合成类似物)，更优选17至30个核糖核苷酸，更优选19至25个核糖核苷酸，最优选21至23个核糖核苷酸。在本发明的一些使用双链sirna的实施方案中，该分子可以具有对称的3'突出端，例如，在一个或两个(核糖)核苷酸上，通常是dtdt3'突出端的uu。基于本文公开的内容，技术人员可以容易地使用资源如ambionsirnafinder等设计合适的sirna和mirna序列。sirna和mirna序列可以合成产生并外源添加以引起基因下调，或使用表达系统(例如载体)产生。在一个优选的实施方案中，sirna是人工合成的。
可以在细胞中加工较长的双链rna以产生sirna(参见myers(2003)naturebiotechnology21:324-328等)。较长的dsrna分子可以具有对称的3'或5'突出端，例如在一个或两个(核糖)核苷酸上，或可能具有平端。较长的dsrna分子可以是25个核苷酸或更长。优选地，较长的dsrna分子长度在25至30个核苷酸之间。更优选地，较长的dsrna分子长度在25至27个核苷酸之间。最优选地，较长的dsrna分子长度为27个核苷酸。可使用载体pdecap表达长度为30个核苷酸或更长的dsrna(shinagawaetal,genesanddev.,17,1340-5,2003)。
另一种选择是细胞中短发夹rna分子(shrna)的表达。shrna比合成sirna更稳定。shrna由短反向重复序列组成，由小的茎环序列分隔。一个反向重复序列与基因靶标互补。在细胞中，shrna被dicer加工成sirna，其降解靶基因mrna并抑制表达。在优选的实施方案中，shrna通过从载体转录而内源性产生(在细胞内)。通过用在rna聚合酶iii启动子(如人h1或7sk启动子)或rna聚合酶ii启动子控制下编码shrna序列的载体转染细胞，可以在细胞内产生shrna。或者，可以通过从载体转录来外源性(体外)合成shrna。然后可以将shrna直接导入细胞中。优选地，shrna分子包含il-11或il-11r的部分序列。优选地，shrna序列的长度在40至100个碱基之间，更优选在40至70个碱基之间。发夹的茎优选长19至30个碱基对。所述茎可含有g-u配对以稳定发夹结构。
sirna分子、较长的dsrna分子或mirna分子可通过核酸序列的转录进行重组制备，所述核酸序列优选包含在载体内。优选地，sirna分子、较长的dsrna分子或mirna分子包含il-11或il-11r的部分序列。
在一个实施方案中，sirna、较长的dsrna或mirna通过从载体转录而内源性(在细胞内)产生。所述载体可以以本领域已知的任何方式引入细胞。任选地，可以使用组织特异性(例如心脏、肝脏、肾脏或眼睛特异性)启动子来调节rna序列的表达。在另一个实施方案中，sirna、较长的dsrna或mirna通过从载体转录而外源性(体外)产生。
合适的载体可以是经配置以表达能够抑制il-11或il-11r的寡核苷酸试剂的寡核苷酸载体。这种载体可以是病毒载体或质粒载体。治疗性寡核苷酸可以被整合到病毒载体的基因组中并可操作地连接到调控序列，例如，可以驱动其表达的启动子。术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中选定的核苷酸序列和调控核苷酸序列共价连接，所述共价连接的方式将核苷酸序列的表达置于调控序列的影响或控制下。因此，如果调节序列能够影响形成部分或全部所选核苷酸序列的核苷酸序列的转录，则调控序列与选定的核苷酸序列可操作地连接。
编码启动子表达的sirna序列的病毒载体是本领域已知的并且具有治疗性寡核苷酸长期表达的优势。实例包括慢病毒(nature2009jan22；457(7228):426-433)、腺病毒(shenetal,febslett2003mar27；539(1-3)111-4)和逆转录病毒(bartonandmedzhitovpnasnovember12,2002,vol.99,no.2314943-14945)。
在其他实施方案中，可以配置载体以辅助将治疗性寡核苷酸递送至需要抑制il-11或il-11r表达的位点。此类载体通常涉及将寡核苷酸与带正电荷的载体(例如阳离子细胞穿透肽、阳离子聚合物和树枝状聚合物和阳离子脂质)络合；将寡核苷酸与小分子(例如胆固醇、胆汁酸和脂质)、聚合物、抗体和rna缀合；或将寡核苷酸包封在纳米微粒制剂中(wangetal,aapsj2010dec；12(4):492-503)。
在一个实施方案中，载体可以包含正义和反义取向的核酸序列，使得当以rna表达时，正义和反义部分将结合形成双链rna。
或者，可以使用本领域已知的标准固相或液相合成技术来合成sirna分子。核苷酸之间的连接可以是磷酸二酯键或替代物，例如下式中的连接基团：p(o)s，(硫酯；p(s)s，(二硫酯)；p(o)nr'2；p(o)r'；p(o)or6；co；或conr'2，其中r是h(或盐)或烷基(1-12c)，且r6是烷基(1-9c))，其通过-o-或-s-与相邻的核苷酸连接。
除了天然存在的碱基之外，还可以使用修饰的核苷酸碱基，并且可以赋予含有它们的sirna分子有利的性质。
例如，修饰的碱基可以增加sirna分子的稳定性，从而减少沉默所需的量。提供修饰的碱基还可以提供比未修饰的sirna稳定性更好或更差的sirna分子。
术语“修饰的核苷酸碱基”包括具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰的核苷酸包括具有糖的核苷酸，所述糖共价连接于除3'位羟基和5'位磷酸基以外的低分子量有机基团。因此修饰的核苷酸还可以包括2'取代的糖，如2'-o-甲基-；2'-o-烷基；2'-o-烯丙基；2'-s-烷基；2'-s-烯丙基；2'-氟-；2'-卤代或叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖；差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖，呋喃糖和景天庚酮糖。
修饰的核苷酸在本领域中是已知的，包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤和嘧啶以及其他杂环。这些类型的嘧啶和嘌呤是本领域已知的并且包括假异胞嘧啶、n4,n4-乙内酰胺胞嘧啶、8-羟基-n6-甲基腺嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-尿嘧啶、5-羟基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、n6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、-d-甘露糖基肌酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸2-甲硫氨酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶5-氧乙酸、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2,6，二氨基嘌呤、甲基胍基尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基胞嘧啶。
与使用rnai沉默秀丽隐杆线虫(c.elegans)、果蝇、植物和哺乳动物中的基因有关的方法是本领域已知的(firea,etal.,1998nature391:806-811；fire,a.trendsgenet.15,358-363(1999)；sharp,p.a.rnainterference2001.genesdev.15,485-490(2001)；hammond,s.m.,etal.,naturerev.genet.2,110-1119(2001)；tuschl,t.chem.biochem.2,239-245(2001)；hamilton,a.etal.,science286,950-952(1999)；hammond,s.m.,etal.,nature404,293-296(2000)；zamore,p.d.,etal.,cell101,25-33(2000)；bernstein,e.,etal.,nature409,363-366(2001)；elbashir,s.m.,etal.,genesdev.15,188-200(2001)；wo0129058；wo9932619,和elbashirsm,etal.,2001nature411:494-498)。
因此，本发明提供了能够在适当引入或表达于哺乳动物(例如人)细胞内时抑制rnai对il-11或il-11r的表达的核酸，所述细胞反之则表达il-11或il-11r。
所述核酸可具有与il-11或il-11rmrna的一部分或所述mrna的互补序列基本的序列同一性，如genbank登录号nm_000641.3gi：391353405(il-11)或u32324.1gi：975336(il-11r)所定义的。
核酸可以是双链sirna。(如本领域技术人员将会理解的，并且如下面进一步解释的，sirna分子也可以包括短的3'dna序列。)
或者，所述核酸可以是dna(通常为双链dna)，其在哺乳动物细胞中转录时产生具有通过间隔区连接的两个互补部分的rna，使得互补部分彼此杂交时rna形成发夹形式。在哺乳动物细胞中，发夹结构可以通过酶dicer从分子上切下，以产生两种不同但杂交的rna分子。
在一些优选的实施方案中，所述核酸通常靶向seqidno2-5(il-11；图11)之一或seqidno7-10(il-11r；图12)之一的序列。
预计只有mrna转录物的单链(即非自杂交)区域是rnai的合适靶标。因此提出il-11或il-11rmrna转录物中与seqidno2-5或7-10之一所示序列非常接近的其他序列也可以是rnai的合适靶标。这种靶序列的长度优选为17-23个核苷酸，并且优选与seqidno2-5或7-10之一重叠至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或所有19个核苷酸(在seqidno2-5或7-10之一的任一末端)。
因此，本发明提供了能够在适当引入或表达于哺乳动物细胞内时抑制rnai对il-11或il-11r的表达的核酸，所述细胞反之则表达il-11或il-11r，其中所述核酸通常靶向seqidno2-5或7-10之一的序列。
通过“通常靶向”，所述核酸可以靶向与seqidno2-5或7-10重叠的序列。特别地，所述核酸可以靶向人il-11或il-11r的mrna中的序列，其稍长于或短于seqidno2-5或7-10中的一个(优选长度17至23个核苷酸)，但与seqidno2-5或7-10中的一个在其他方面相同。
预计本发明的核酸与靶序列之间的完美同一性/互补性虽然是优选的，但并不是必需的。因此，与il-11或il-11r的mrna相比，本发明的核酸可以包括单个错配。但是，预计即使只存在单个错配也可能导致效率降低，所以不存在错配是优选的。当存在时，3'突出端可不在错配数目的考虑之内。
术语“互补性”不限于由天然存在的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成的核酸之间的常规碱基配对，还包括mrna和本发明中包含非天然核苷酸的核酸之间的碱基配对。
在一个实施方案中，所述核酸(在本文中称为双链sirna)包括图13中所示的双链rna序列(il-11；seqidno：11-14)。
在另一个实施方案中，所述核酸(在本文中称为双链sirna)包括图14中所示的双链rna序列(il-11r；seqidno15-18)。
然而，预计针对il-11或il-11rmrna的相同区域的稍短或更长的序列也将是有效的。具体地，预计长度为17-23bp的双链序列也是有效的。
形成双链rna的链可以具有短的3'二核苷酸突出端，其可以是dna或rna。与3'rna突出端相比，使用3'dna突出端对sirna活性没有影响，但降低了核酸链的化学合成成本(elbashiretal.,2001c)。由于这个原因，dna二核苷酸可能是优选的。
当存在时，二核苷酸突出端可以彼此对称，但这不是必需的。事实上，正义(上)链的3'突出端与rnai活性无关，因为它不参与mrna识别和降解(elbashiretal.,2001a,2001b,2001c)。
尽管果蝇中的rnai实验显示反义3'突出端可能参与mrna识别和靶向(elbashiretal.,2001c)，但3'突出端似乎不是哺乳动物细胞中sirna的rnai活性所必需的。因此认为3'突出端的不正确退火在哺乳动物细胞中几乎没有影响(elbashiretal.2001c；czaudernaetal.2003)。
因此，任何二核苷酸突出端可以用于sirna的反义链中。尽管如此，二核苷酸优选为-uu或-ug(或者如果突出端是dna，则为-tt或-tg)，更优选为-uu(或-tt)。-uu(或-tt)二核苷酸突出端最有效并且与rna聚合酶iii转录信号端(终止子信号是ttttt)一致(即能够形成其一部分)。因此，该二核苷酸是最优选的。也可以使用二核苷酸aa、cc和gg，但效果较差，因此不太优选。
另外，3'突出端可以完全从sirna中省略。
本发明还提供了分别由上述双链核酸之一的组分链组成的单链核酸(在本文中称为单链sirna)，优选具有3'-突出端，但任选地不具有。本发明还提供了含有成对的此类单链核酸的试剂盒，它们能够在体外相互杂交以形成上述双链sirna，然后可以将其导入细胞中。
本发明还提供了当在哺乳动物细胞中转录时产生具有两个互补部分的rna(在本文中也称为shrna)的dna，所述两个互补部分能够自杂交以产生双链基序，例如，包括选自seqidno.11-14或15-18的序列或与前述序列中的任何一个均不同的通过单碱基对取代的序列。
互补部分通常通过间隔区连接，所述间隔区具有合适的长度和顺序以允许两个互补部分彼此杂交。所述两个互补部分(即正义和反义)可以以任何顺序连接5'-3'。间隔区通常是约4-12个核苷酸的短序列，优选4-9个核苷酸，更优选6-9个核苷酸。
优选地，间隔区的5'末端(紧接上游互补部分的3')由核苷酸-uu-或-ug-组成，同样优选地为-uu-(尽管这些特定二核苷酸的使用不是必需的)。推荐用于oligoengine(美国华盛顿州西雅图市)的psuper系统的合适间隔区是uucaagaga。在这种情况和其他情况下，所述间隔区的末端可以彼此杂交，例如，通过少量(例如1或2个)碱基对延伸超出seqidno11-14或15-18的确切序列的双链基序。
类似地，转录的rna优选包含来自下游互补部分的3'突出端。同样，优选-uu或-ug，更优选-uu。
然后可以通过酶dicer在哺乳动物细胞中切割这种shrna分子以产生如上所述的双链sirna，其中杂交的dsrna的一条链或每条链包含3'突出端。
用于合成本发明核酸的技术当然是本领域众所周知的。
技术人员能够使用众所周知的技术和市售材料为本发明的dna构建合适的转录载体。具体而言，dna将与控制序列相关，包括启动子和转录终止序列。
特别合适的是市售的oligoengine(美国华盛顿州西雅图市)的psuper和psuperior系统。这些使用聚合酶iii启动子(h1)和t5转录终止子序列，其在转录物的3'端贡献两个u残基(其在dicer处理后提供sirna的一条链的3'uu突出端)。
shin等人(rna,2009may；15(5):898-910)描述了另一种合适的系统，其使用另一种聚合酶-iii启动子(u6)。
如下所述，本发明的双链sirna可以使用已知技术在体外或体内引入哺乳动物细胞中以抑制il-11或il-11r的表达。
类似地，使用已知的技术(如下所述)将含有本发明dna的转录载体在体外或体内引入肿瘤细胞中，以进行rna的瞬时或稳定表达，再次抑制il-11或il-11r的表达。
因此，本发明还提供了抑制哺乳动物(例如人)细胞中的il-11或il-11r表达的方法。所述方法包括向细胞施用本发明的双链sirna或本发明的转录载体。
类似地，本发明进一步提供了治疗纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的双链sirna或本发明的转录载体。
本发明进一步提供本发明的双链sirna和本发明的转录载体，其用于治疗方法，优选治疗纤维化的方法。
本发明进一步提供了本发明的双链sirna和本发明的转录载体在制备用于治疗纤维化的药物中的用途。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含本发明的双链sirna或本发明的转录载体与一种或多种药学上可接受的载体的混合物。合适的载体包括可助于细胞膜穿透的亲脂性载体或囊泡。
适合施用本发明的sirna双链体和dna载体的材料和方法在本领域中是公知的，鉴于rnai技术的潜力，正在开发改进的方法。
通常，许多技术可用于将核酸引入哺乳动物细胞。技术的选择将取决于核酸是否在体外或体内转移到患者细胞中的培养细胞中。适用于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、deae葡聚糖和磷酸钙沉淀。体内基因转移技术包括用病毒(通常是逆转录病毒)载体和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染进行转染(dzauetal.(2003)trendsinbiotechnology11,205-210)。
具体而言，用于本发明的核酸的体外和体内细胞给药的合适技术在以下文章中公开：
generalreviews:borkhardt,a.2002.blockingoncogenesinmalignantcellsbyrnainterference--newhopeforahighlyspecificcancertreatment？cancercell.2:167-8.hannon,g.j.2002.rnainterference.nature.418:244-51.mcmanus,m.t.,andp.a.sharp.2002.genesilencinginmammalsbysmallinterferingrnas.natrevgenet.3:737-47.scherr,m.,m.a.morgan,andm.eder.2003b.genesilencingmediatedbysmallinterferingrnasinmammaliancells.currmedchem.10:245-56.shuey,d.j.,d.e.mccallus,andt.giordano.2002.rnai:gene-silencingintherapeuticintervention.drugdiscovtoday.7:1040-6.
systemicdeliveryusingliposomes:lewis,d.l.,j.e.hagstrom,a.g.loomis,j.a.wolff,andh.herweijer.2002.efficientdeliveryofsirnaforinhibitionofgeneexpressioninpostnatalmice.natgenet.32:107-8.paul,c.p.,p.d.good,i.winer,andd.r.engelke.2002.effectiveexpressionofsmallinterferingrnainhumancells.natbiotechnol.20:505-8.song,e.,s.k.lee,j.wang,n.ince,n.ouyang,j.min,j.chen,p.shankar,andj.lieberman.2003.rnainterferencetargetingfasprotectsmicefromfulminanthepatitis.natmed.9:347-51.sorensen,d.r.,m.leirdal,andm.sioud.2003.genesilencingbysystemicdeliveryofsyntheticsirnasinadultmice.jmolbiol.327:761-6.
virusmediatedtransfer:abbas-terki,t.,w.blanco-bose,n.deglon,w.pralong,andp.aebischer.2002.lentiviral-mediatedrnainterference.humgenether.13:2197-201.barton,g.m.,andr.medzhitov.2002.retroviraldeliveryofsmallinterferingrnaintoprimarycells.procnatlacadsciusa.99:14943-5.devroe,e.,andp.a.silver.2002.retrovirus-deliveredsirna.bmcbiotechnol.2:15.lori,f.,p.guallini,l.galluzzi,andj.lisziewicz.2002.genetherapyapproachestohivinfection.amjpharmacogenomics.2:245-52.matta,h.,b.hozayev,r.tomar,p.chugh,andp.m.chaudhary.2003.useoflentiviralvectorsfordeliveryofsmallinterferingrna.cancerbiolther.2:206-10.qin,x.f.,d.s.an,i.s.chen,andd.baltimore.2003.inhibitinghiv-1infectioninhumantcellsbylentiviral-mediateddeliveryofsmallinterferingrnaagainstccr5.procnatlacadsciusa.100:183-8.scherr,m.,k.battmer,a.ganser,andm.eder.2003a.modulationofgeneexpressionbylentiviral-mediateddeliveryofsmallinterferingrna.cellcycle.2:251-7.shen,c.,a.k.buck,x.liu,m.winkler,ands.n.reske.2003.genesilencingbyadenovirus-deliveredsirna.febslett.539:111-4.
peptidedelivery:morris,m.c.,l.chaloin,f.heitz,andg.divita.2000.translocatingpeptidesandproteinsandtheiruseforgenedelivery.curropinbiotechnol.11:461-6.simeoni,f.,m.c.morris,f.heitz,andg.divita.2003.insightintothemechanismofthepeptide-basedgenedeliverysystemmpg:implicationsfordeliveryofsirnaintomammaliancells.nucleicacidsres.31:2717-24.适合于将sirna递送至靶细胞的其他技术基于纳米颗粒或纳米胶囊，如美国专利号6,649,192b和5,843,509b中所述的那些。
制剂
在治疗应用中，能够抑制il-11作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂优选与一种或多种其它药学上可接受的成分一起配制成药剂或药物，所述其它药学上可接受的成分为本领域技术人员所熟知，包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
本文使用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内适合用于与所述受试者(例如人类)的组织接触的化合物、成分、材料、组合物、剂型等，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的利益/风险比。就与制剂的其他成分相容的意义而言，每种载体、辅助剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。
合适的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准药学教科书中找到，例如remington'spharmaceuticalsciences(第18版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1990)；和handbookofpharmaceuticalexcipients(第2版，1994)。
所述制剂可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，所述制剂是通过将活性化合物与载体(例如液体载体、细碎的固体载体等)均匀且紧密地结合在一起，然后使产物成形(如果需要)来制备的。
所述制剂可以制备用于局部、肠胃外、全身、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、皮下、口服或透皮施用途径，其可以包括注射。可注射制剂可将选择的试剂包含在无菌或等渗介质中。
优选给药“治疗有效量”，这足以向个体显示有益效果。实际给药量、给药速度和时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在remington'spharmaceuticalsciences(第20版，2000，pub.lippincott,williams&wilkins)中找到。
纤维化
如本文所用，“纤维化”是指由于细胞外基质成分(例如胶原蛋白)的过量沉积而形成过量纤维结缔组织。纤维结缔组织的特征在于具有高胶原蛋白含量的细胞外基质(ecm)。胶原蛋白可以以股线或纤维提供，其可以不规则排列或对齐。纤维结缔组织的ecm也可以包括糖胺聚糖。
如本文所用，“过量纤维结缔组织”是指在给定位置(例如给定组织或器官，或给定组织或器官的一部分)处的结缔组织的量大于在没有纤维化的情况下(例如，在正常的非病理条件下)存在于其上的结缔组织的量。如本文所用，“细胞外基质组分的过量沉积”是指一种或多种细胞外基质组分的沉积水平高于在不存在纤维化的情况下(例如，在正常的非病理条件下)沉积水平。
纤维化的细胞和分子机制描述于wynn,j.pathol.(2008)214(2):199-210，以及wynn和ramalingam,naturemedicine(2012)18:1028-1040，其通过引用整体并入本文。
纤维化的主要细胞效应物是肌成纤维细胞，其产生富含胶原蛋白的细胞外基质。
为响应组织损伤，损伤的细胞和白细胞产生促纤维化因子如tgfβ、il-13和pdgf，其将成纤维细胞活化为表达αsma的肌成纤维细胞，并将成肌纤维细胞募集到损伤部位。肌成纤维细胞产生大量细胞外基质，是有助于伤口挛缩和闭合的重要介质。然而，在持续感染或慢性炎症的情况下，可能存在肌成纤维细胞的过度活化和募集，并因此过度产生细胞外基质成分，导致形成过量的纤维结缔组织。
在一些实施方案中，纤维化可由导致促纤维化因子如tgfβ1产生的病理学条件(例如病症、感染或疾病状态)触发。在一些实施方案中，纤维化可由物理损伤/刺激、化学损伤/刺激或环境损伤/刺激引起。手术过程中可能会出现物理损伤/刺激，例如医源性原因。化学损伤/刺激可能包括药物诱导的纤维化，例如，长期服用药物如博来霉素、环磷酰胺、胺碘酮、普鲁卡因胺、青霉胺、金和呋喃妥因(dabaetal.,saudimedj2004jun；25(6):700-6)。环境损伤/刺激可能包括暴露于石棉纤维或二氧化硅。
纤维化可以发生在身体的许多组织中。例如，纤维化可以发生在肝脏(例如肝硬化)、肺、肾、心脏、血管、眼睛、皮肤、胰腺、肠、脑和骨髓中。纤维化可在多个器官中同时发生。
在本文的实施方案中，纤维化可能涉及胃肠系统的器官，如肝脏、小肠、大肠或胰腺。在一些实施方案中，纤维化可以涉及呼吸系统的器官，如肺。在实施方案中，纤维化可以涉及心血管系统的器官，如心脏或血管。在一些实施方案中，纤维化可能涉及皮肤。在一些实施方案中，纤维化可涉及神经系统的器官，如大脑。在一些实施方案中，纤维化可涉及泌尿系统的器官，如肾。在一些实施方案中，纤维化可以涉及肌肉骨骼系统的器官，如肌肉组织。
在一些优选的实施方案中，纤维化是心脏或心肌纤维化、肝纤维化或肾纤维化。在一些实施方案中，心脏或心肌纤维化与肌肉组织的功能障碍或心脏的电特性或心脏瓣膜壁增厚有关。在一些实施方案中，纤维化存在于心脏的心房和/或心室。治疗或预防心房或心室纤维化可能有助于降低房颤、心室纤颤或心肌梗塞的风险或发作。
在一些优选的实施方案中，肝纤维化与慢性肝病或肝硬化相关。在一些优选的实施方案中，肾纤维化与慢性肾病有关。
以根据本发明的纤维化为特征的疾病/病症包括但不限于：呼吸病症如肺纤维化、囊性纤维化、特发性肺纤维化、进行性块状纤维化、硬皮病、闭塞性细支气管炎，hermansky-pudlak综合征、石棉肺、矽肺、慢性肺动脉高压、艾滋病相关的肺动脉高压、结节病、肺病中的肿瘤基质和哮喘；慢性肝病、原发性胆汁性肝硬化(pbc)、血吸虫性肝病、肝硬化；心血管疾病如肥厚型心肌病、扩张型心肌病(dcm)、心房纤维化、心房纤维性颤动、心室纤维化、心室纤维性颤动、心肌纤维化、brugada综合征、心肌炎、心内膜心肌纤维化、心肌梗塞、纤维化血管疾病、高血压性心脏病、致心律失常性右心室心肌病(arvc)、肾小管间质和肾小球纤维化、动脉粥样硬化、静脉曲张、脑梗塞；神经疾病如神经胶质增生和阿尔茨海默病；肌营养不良症如duchenne型肌营养不良症(dmd)或becker肌营养不良症(bmd)；胃肠病症如克罗恩病、显微镜结肠炎和原发性硬化性胆管炎(psc)；皮肤病如硬皮病、肾性系统性纤维化和皮肤瘢痕疙瘩；关节纤维化；dupuytren的挛缩；纵隔纤维化；腹膜后纤维化；骨髓纤维化；佩罗尼氏病；粘性囊炎；肾脏疾病(例如肾纤维化、肾病综合征、alport综合征、hiv相关性肾病、多囊肾病、法布里氏病、糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎及与系统性红斑狼疮有关的肾炎)；进行性系统性硬化症(pss)；慢性移植物抗宿主病；眼部疾病如格雷夫氏眼病、视网膜前纤维化、视网膜纤维化、视网膜下纤维化(例如与黄斑变性(例如湿性年龄相关性黄斑变性(amd)相关)、糖尿病性视网膜病、青光眼、角膜纤维化、手术后纤维化(例如，在白内障手术后的后囊或青光眼小梁切除术后的囊泡)、结膜纤维化、结膜下纤维化；关节炎；纤维化的瘤前和纤维化肿瘤疾病；以及化学或环境损伤诱导的纤维化(例如癌症化疗、杀虫剂、放疗/癌症放疗)。
应该理解的是，上面列出的许多疾病/病症是相互关联的。例如，心肌纤维化可能发生在心肌梗死后，并与dcm、hcm和心肌炎有关。
在具体实施方案中，疾病/病症可以是肺纤维化、心房纤颤、心室纤颤、肥厚性心肌病(hcm)、扩张型心肌病(dcm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、慢性肾病、硬皮病、全身性硬化症、瘢痕瘤、囊性纤维化、克罗氏病、手术后纤维化或视网膜纤维化。
根据本发明的治疗、预防或缓解的纤维化可以是与il-11上调有关的纤维化，例如，在发生或可能发生纤维化的细胞或组织中上调il-11或上调细胞外il-11或il-11r。
纤维化的治疗或缓解可有效预防纤维化的进展，例如，防止病情恶化或减缓纤维化发展的速度。在一些实施方案中，治疗或缓解可导致纤维化的改善，例如，沉积胶原纤维量的减少。
纤维化的预防可指预防疾病恶化或预防纤维化发展，例如，预防早期纤维化发展到后期慢性阶段。
受试者
被治疗的受试者可以是任何动物或人类。受试者优选是哺乳动物，更优选人。受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受试者可能是男性或女性。所述受试者可能是患者。
样本
从受试者获得的样本可以是任何种类的。生物样本可以从任何组织或体液取得，例如，血液样本、血液源样本、血清样本、淋巴样本、精液样本、唾液样本、滑液样本。血液源样本可以是患者血液的选定部分，例如选定的含有细胞的部分或血浆或血清部分。样本可以包含组织样本或活检组织；或从受试者分离的细胞。样本可以通过已知技术收集，如活检或针头抽吸。可以存储和/或处理样本以用于随后il-11表达水平的测定。
可以使用样本来确定从中取出样本的受试者中il-11或il-11r的上调。
在一些优选实施例中，样本可以是组织样本，例如，取自心脏、肝脏或肾脏组织的活检。在一些实施例中，样本可以是组织样本，例如，取自眼睛的活检。
样本可以含有细胞，并且可以优选含有成纤维细胞和/或肌成纤维细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞或肌成纤维细胞可以从心脏、肝或肾组织获得，例如，它们可以是心脏成纤维细胞或心肌成纤维细胞(例如参见colbyetal.,circulationresearch2009；105:1164-1176)，肝成纤维细胞或肝成肌纤维细胞(例如参见zeisbergetal.,thejournalofbiologicalchemistry,august10,2007,282,23333-23347；brenner，fibrogenesis&tissuerepair2012,5(suppl1):s17)或肾成纤维细胞或肾成肌纤维细胞(例如参见strutz和zeisberg.jasnnovember2006vol.17no.112992-2998)。在一些实施方案中，成纤维细胞或肌成纤维细胞可以从眼组织获得，例如，它们可能是角膜成纤维细胞。
il-11或il-11r表达上调
本发明的一些方面和实施方案涉及检测il-11或il-11r的表达，例如，在从受试者获得的样品中。
在一些方面和实施方案中，本发明涉及il-11或il-11r的表达(为编码各自il-11或il-11r的蛋白质或寡核苷酸)的上调(过度表达)以及检测此类上调作为使用能够抑制il-11作用的试剂或与能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂进行治疗的适用性指标。
il-11或il-11r表达的上调包括il-11或il-11r以大于给定类型的细胞或组织的正常预期的水平的表达。上调可以通过确定细胞或组织中il-11或il-11r的表达水平来确定。可以比较来自受试者的细胞或组织样品中的il-11或il-11r表达水平与il-11或il-11r的参考水平(例如，表示相同或相应的细胞或组织类型的il-11或il-11r的正常表达水平的值或值范围。在一些实施方案中，参考水平可以通过检测对照样本(例如来自健康受试者或来自相同受试者的健康组织的相应细胞或组织)中的il-11或il-11r的表达来确定。在一些实施方式中，参考水平可以从标准曲线或数据集中获得。
表达水平可以定量以进行绝对比较，或者可以进行相对比较。
在一些实施方案中，当测试样本中的表达水平是参考水平的表达水平的至少1.1倍时，可以认为存在il-11或il-11r的上调。更优选地，表达水平可以选自至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少一个至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4、至少2.5、至少2.6、至少2.7、至少2.8、至少2.9、至少3.0、至少3.5、至少4.0、至少5.0、至少6.0、至少7.0、至少8.0、至少9.0、或至少10.0倍于参考水平。
il-11或il-11r表达水平可以通过许多已知的体外测定技术之一来确定，例如基于pcr的测定、原位杂交测定、流式细胞术测定、免疫学或免疫组织化学测定。
举例来说，合适的技术涉及通过使样本与能够结合il-11或il-11r的试剂接触并检测样品中试剂与il-11或il-11r复合物形成的方法来检测样品中il-11或il-r的水平。所述试剂可以是任何合适的结合分子，例如抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体或小分子，并且可以任选地被标记以允许检测，例如可视化、形成的复合体。本领域技术人员熟知适合的标记和检测手段，包括荧光标记(例如荧光素，罗丹明，曙红和ndb，绿色荧光蛋白(gfp)，稀土螯合物如铕(eu)、铽(tb)、和钐(sm)，四甲基罗丹明，德克萨斯红，4-甲基伞形酮，7-氨基-4-甲基香豆素，cy3，cy5)、同位素标记、放射性同位素(例如32p、33p、35s)、化学发光标记(例如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)、酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶)、抗体、配体和受体。检测技术对于本领域技术人员来说是公知的并且可以选择为与标记试剂相对应。合适的技术包括寡核苷酸标签的pcr扩增、质谱、荧光或颜色的检测，例如，通过报告蛋白质对底物进行酶促转化，或放射性检测。
可配置试验以定量样品中il-11或il-11r的量。将定量的来自测试样品的il-11或il-11r与参考值进行比较，该比较用于确定测试样品所含il-11或il-11r的量是否以选定统计学显著程度高于或低于参考值。
被测il-11或il-11r的定量可用于确定编码il-11或il-11r的基因的上调或下调或扩增。在测试样品含有纤维化细胞的情况下，可以将这种上调、下调或扩增与参考值比较以确定是否存在任何统计学显著性差异。
受试者筛选
基于对受试者具有上调的il-11或il-11r表达水平的确定，可以筛选受试者进行治疗。因此，il-11或il-11r可以用作适于用能够抑制il-11的作用的试剂或用能够预防或减少il-11或il-11r的表达的试剂治疗的纤维化的标志物。
上调可能存在于给定组织或来自给定组织的选定细胞中。优选的组织可以是心脏、肝脏或肾脏之一。优选的组织可以是眼睛。优选的细胞类型可以是成纤维细胞或肌成纤维细胞。上调也可以在循环液体中确定，例如，血液或血液衍生的样品。上调可以是细胞外的il-11或il-11r的上调。
如本文所述，il-11或il-11r水平的测定可以通过在从受试者获得的样品上进行的试验(优选体外)。
筛选后，通过施用能够抑制il-11作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂，可以为受试者提供纤维化治疗。
在一些实施方案中，受试者可能已经被诊断为患有纤维化，被怀疑患有纤维化或被认为有发生纤维化的风险，人们感兴趣的是受试者是否将受益于用能够抑制il-11的作用的试剂进行或用能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂进行的治疗。在这样的实施方案中，受试者对于这种治疗的适用性可以通过确定受试者中il-11或il-11r表达是否上调来确定。在一些实施方案中，受试者中il-11或il-11r表达局部或全身上调。
诊断和预后
il-11或il-11r表达上调的检测也可以用于诊断受试者中纤维化或发生纤维化风险的方法中，以及预测或预知受试者对用能够抑制il-11的作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂进行的治疗的反应的方法中。
在一些实施方案中，可能怀疑受试者患有纤维化，例如根据受试者体内或受试者身体的选定细胞/组织中存在指示纤维化的其他症状，或被认为有发生纤维化的风险，例如，因为遗传倾向或暴露于环境条件下，如石棉纤维。
确定il-11或il-11r的上调可证实纤维化的诊断或疑似诊断，或可证实受试者处于发生纤维化的风险中。该测定还可诊断适合用能够抑制il-11作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂治疗的病症或倾向。
如此，提供了为患有或疑似患有纤维化的受试者提供预后的方法，所述方法包括确定从受试者获得的样本中il-11或il-11r是否上调，并且基于该测定提供用能够抑制il-11作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂对受试者进行的治疗的预后。
在一些方面，诊断方法或预测或预知受试者对用能够抑制il-11作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂治疗的响应的方法可能不需要确定il-11或il-11r水平，但可以基于确定预测为il-11或il-11r表达上调或il-11或il-11r活性上调的确定受试者中的遗传因子。这些遗传因子可以包括确定il-11和/或il-11r中的基因突变、单核苷酸多态性(snp)或基因扩增，其有关于和/或可预测il-11或il-11r表达或活性或il-11介导的信号传导的活性的上调。使用遗传因子预测对疾病状态或治疗反应的倾向性是本领域已知的，例如，参见
可以通过本领域普通技术人员已知的方法测定遗传因子，包括基于pcr的测定，例如定量pcr竞争性pcr。通过在从受试者获得的样品中确定遗传因子的存在，可以确认纤维化的诊断，和/或可以将受试者分类为处于发生纤维化的风险中，和/或可以确定受试者适合用能够抑制il-11的作用的试剂或能够预防或减少il-11或il-11r表达的试剂进行的治疗。
一些方法可以包括确定一种或多种与il-11分泌相关的snp的存在或对发生纤维化的易感性。snp通常是双等位基因的，因此可以使用本领域技术人员已知的许多常规测定法之一容易地测定(例如参见anthonyj.brookes.theessenceofsnps.genevolume234,issue2,8july1999,177-186；fanetal.,highlyparallelsnpgenotyping.coldspringharbsympquantbiol2003.68:69-78；matsuzakietal.,parallelgenotypingofover10,000snpsusingaone-primerassayonahigh-densityoligonucleotidearray.genomeres.2004.14:414-425)。
该方法可以包括确定从受试者获得的样品中存在哪个snp等位基因。在一些实施方案中，确定次要等位基因的存在可能与增加的il-11分泌或对纤维化发生的易感性有关。
相应地，在本发明的一个方面中，提供了一种用于筛选受试者的方法，所述方法包括：
从受试者获得核酸样本；
测定样本中在图33和/或图34和/或图35中列出的一个或多个snp或与列出的snp中的一个连锁不平衡(r2≥0.8)的snp的多态性核苷酸位置处存在哪个等位基因。
确定步骤可以包括确定样本中在选定的多态性核苷酸位置处是否存在次要等位基因。它可以包括确定是否存在0、1或2个次要等位基因。
筛选方法可以是一种用于确定受试者发生纤维化的易感性的方法或如本文所述的诊断或预后方法，或者形成其一部分。
所述方法可以进一步包括鉴定受试者对发生纤维化具有易感性或增加发生纤维化风险的步骤，例如如果确定受试者在多态性核苷酸位置具有次要等位基因。所述方法可以进一步包括筛选用于用能够抑制白细胞介素11(il-11)作用的试剂进行治疗中的受试者和/或向所述受试者施用能够抑制白细胞介素11(il-11)作用的试剂，目的在于为受试者中的纤维化提供治疗或预防受试者中纤维化的发生或恶化。
可以确定的snp包括图33、图34或图35中列出的一个或多个snp。在一些实施方案中，所述方法可以包括确定图33中列出的一个或多个snp。在一些实施方案中，所述方法可以包括确定图34中列出的一个或多个snp。在一些实施方案中，所述方法可以包括确定图35中列出的一个或多个snp。可以选择snp用于确定具有低p值或fdr(错误发现率)。
在一些实施方案中，基于反式调控vststim(图33)，选择snp作为对抗il-11治疗的响应的良好预测因子。在一些实施方案中，方法可以包括确定针对一个或多个以下snp存在哪个等位基因：rs10831850、rs4756936、rs6485827、rs7120273和rs895468。在一些实施方案中，基于顺式调控vststim-vstunstim(图34)，选择snp作为对抗il-11治疗的响应的良好预测因子。
在一些实施方案中，基于反式调节vststim-vstunstim(图35)，选择snp作为对抗il-11治疗的响应的良好预测因子。在一些实施方案中，方法可以包括确定针对一个或多个以下snp存在哪个等位基因：rs7120273、rs10831850、rs4756936、rs6485827(图35)。
snp：rs7120273、rs10831850、rs4756936、rs6485827在第11号染色体上(在所谓的ld区段中)处于高度连锁不平衡(ld)，因此非常普遍地共同遗传。
基因频率相关性的平方(r2)反映了两个snp之间的连锁不平衡程度(ld)。由于基因组中局部并因此共同遗传的区域中snp之间的ld，可以通过确定标签/代理snp的基因型来推断给定snp的基因型。本领域中用于鉴定成对标签/代理snp的ld的阈值是r2为0.8(wangetal.2005,nat.rev.genet.6(2):109-18；barrettetal.2006,natgenet.,38(6):659-662)。因此可以通过确定具有r2≥2.8的连锁不平衡的标签/代理snp的基因型来推断给定snp的基因型。
使用“rs”号表示snp的核苷酸序列。全序列可从美国国家生物技术信息中心(ncbi)的单核苷酸多态性数据库(dbsnp)获得，网址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp。
诊断或预后的方法可以在从受试者获得的样品上在体外进行，或在处理从受试者获得的样品后进行。一旦收集到样本，体外诊断或预后的方法不需要患者再次，因此该方法可以是不在人体或动物体上实施的方法。
其他诊断或预后测试可以与这里描述的那些结合使用以增强诊断或预后的准确性或者确认通过使用在此描述的测试获得的结果。
根据本发明的方法可以在体外、离体或体内进行，或者产物可以在体外、离体或体内存在。术语“体外”旨在包括在实验室条件下或在培养物中对材料、生物物质、细胞和/或组织进行的实验，而术语“体内”旨在包括用完整的多细胞生物体进行的实验和过程。“离体”是指存在于或发生在生物体外(例如，在人体或动物体外)的某物，其可以在从生物体获取的组织(例如整个器官)或细胞上。
本发明包括所描述的各个方面和优选特征的组合，除非明确地不允许或明确避免这样的组合。
这里使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图举例说明本发明的各方面和实施例。其他方面和实施例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书(包括随后的权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”将被理解为暗示包含所陈述的整体或整体的步骤或组或步骤，但不排除任何其他整体或整体的步骤或组或步骤。
必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物。在本文中范围可表达为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当数值通过使用先行词“约”被表示为近似值时，将理解特定值形成另一个实施例。
附图说明
现在将参考附图讨论表明本发明的原理的实施例和实验，其中：
图1、tgfβ1刺激上调成纤维细胞中的il-11。原代成纤维细胞来源于80个个体的人心房组织，并在有和没有tgfβ1(5ng/ml)的情况下温育24h。(a)图显示与11,433个表达基因相比，il-11是tgfβ1刺激的成纤维细胞中上调最多的基因(fpkm≥0.5)。(b)图显示用tgfβ1激活成纤维细胞后，il-11表达显著增加平均超过8倍(fdr＝9.1×10-125)。(c)图显示rt-qpcr证实了基于il-11rna表达的倍数变化(tgfb1+/tgfb1-；r2＝0.94)和(d)图显示elisa检测到刺激的成纤维细胞分泌的il-11蛋白显著增加。
图2、人心房成纤维细胞与5ng/mltgfβ1或5ng/mlil-11温育24小时。图表显示(a)α-sma(肌成纤维细胞)、(b)edu(增殖)、(c)胶原蛋白和(d)骨膜蛋白的细胞染色，以鉴定成肌纤维细胞和高度增殖细胞并定量细胞外基质蛋白的产量。发现il-11以与tgfβ1信号传导相似的速率增加肌成纤维细胞比率并诱导胶原蛋白和骨膜蛋白的产生。该实验重复多次，结果相似。
图3、用中和抗体抑制il-11防止tgfβ1诱导的纤维化。用tgfβ1(5ng/ml)、tgfβ1和针对il-11的抗体、或tgfβ1和同种型对照刺激人心房成纤维细胞。图和照片显示了(a)α-sma、(b)edu、(c)胶原蛋白和(d)骨膜蛋白在染色24小时后的细胞，以鉴定成肌纤维细胞和高增殖性细胞并定量细胞外基质蛋白的产量。在operetta平台上对荧光进行定量，每个条件最多21个场。用来自不同个体的成纤维细胞重复该实验，得到相似的结果。在存在阻断il-11的抗体的情况下，与对照细胞相比，tgfβ1刺激的成纤维细胞具有降低的成肌纤维细胞比率、较少增殖并表达较少的胶原蛋白和骨膜蛋白。这表明il-11是以自分泌和/或旁分泌前馈方式作用的tgfβ1信号传导途径的必需成分，其抑制减少了人类纤维化关键调节剂的促纤维化作用。
图4、tgfβ1刺激上调成纤维细胞中的il-11。原代成纤维细胞来源于80个个体的人心房组织，并在有和没有tgfβ1(5ng/ml)的情况下温育24h。(a)图显示通过全球转录组分析评估整个基因组，与11,433个表达基因相比，il-11是tgfβ1刺激的成纤维细胞中上调最多的rna(fpkm≥0.5)。(b)图显示与通过gtex项目(consortium,gte.humangenomics.thegenotype-tissueexpression(gtex)pilotanalysis:multitissuegeneregulationinhumans.science(newyork,n.y.)348,(2015))分析评估的所有人类组织相比，未刺激(tgf-β-)和受刺激(tgf-β+)原代人成纤维细胞中il-11的表达显示升高的il-11水平对成纤维细胞和特特异性活化的成纤维细胞的高特异性，其信号在包含多种细胞类型和少量表达il11的成纤维细胞的整个器官的水平上不被识别。
图5、il-11作为成纤维细胞上的自分泌因子并通过单独的翻译调控诱导其自身表达。原代成纤维细胞用tgf-β刺激24小时。(a)图显示80个个体中il-11rna表达显著增加(fdr＝9.1x10-125)平均超过8倍。(b)图显示elisa测定结果，证实刺激的成纤维细胞分泌的il-11蛋白显著增加(t检验)。(c)图显示原代成纤维细胞与il-11温育不增加il-11rna水平(rt-qpcr)。(d)图显示通过elisa检测的原代成纤维细胞与il-11的温育显著诱导il-11蛋白分泌(dunnett)。调整的p值给出为****p<0.0001。
图6、il-11驱动成纤维细胞的增殖和活化以及细胞外基质产生，并且是tgfβ1介导的纤维化反应所需的。将来自3个个体的心脏成纤维细胞与tgfβ1(5ng/ml)、il-11(5ng/ml)或tgfβ1和中和il-11/对照抗体一起温育24小时。图表和照片显示温育后细胞染色的结果(a)α-sma含量以估计肌成纤维细胞的分数，(b)edu以追踪活跃增殖细胞(c)骨膜蛋白以估计ecm产量。用operetta平台对每个患者的2个孔进行14个场的荧光测量。图表还显示通过elisa评估的纤维化标志物il-6(d)、timp1(e)和mmp2(f)的分泌。将荧光归一化至没有刺激的对照组，绘制具有标准偏差的平均值。il-11以与tgfβ1相似的水平诱导纤维化响应，并且抑制il-11在蛋白质水平上挽救tgfβ1表型。与未受刺激的细胞(dunnett)相比，实验组调整的p值为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001或****p<0.0001。异常值被删除(rout，q＝2％)。
图7、il-11促进胶原蛋白合成并在rna水平阻止tgfβ1的促纤维化作用。将来自3个个体的心脏成纤维细胞与tgfβ1(5ng/ml)、il-11(5ng/ml)或tgfβ1和中和il-11抗体温育24小时。温育后(a)图显示使用operetta测定温育后胶原蛋白的细胞染色结果；如上文图6所述定量荧光。(b)图显示用天狼星红染色评估的分泌胶原蛋白水平和(c)图显示通过rt-qpcr测量的胶原蛋白rna水平。il-11仅在蛋白质水平以与tgfβ1相似水平诱导纤维化响应。如果用抗体中和il-11，则tgfβ1的胶原蛋白rna转录物的更高表达不会导致蛋白质生产增加。与未受刺激的细胞对照组(dunnett)相比，实验组的调整的p值为*p<0.05、***p<0.001或****p<0.0001。
图8、il-11是跨越多种组织的纤维化标志物和活化剂。除了tgfβ1之外，还可以通过多种上游促纤维化刺激物来诱导il-11的表达。(a)图显示tgfβ1对il-11表达的影响。(b)图显示et-1(内皮素)上调肝和肺成纤维细胞中il-11；(c)图显示pdgf(血小板衍生的生长因子)诱导肾成纤维细胞中il-11表达。通过rt-qpcr测量il-11rna水平；调整的p值为*p<0.05、**p<0.01或****p<0.0001(dunnett)。为了研究il-11的系统性作用，在c57bl/6小鼠(200μg/kg)中每周只注射6次生理盐水(灰色)或重组il-11(黑色)。用羟脯氨酸测定法(quickzyme)在蛋白质水平上评估组织中的胶原蛋白含量，结果显示在图(d)中。用ril-11处理的动物组织具有比对照更高的胶原蛋白含量(anova；p＝0.012)。(e)western印迹的照片显示在il-11处理的小鼠的肾脏和心脏中αsma水平增加，表明存在肌成纤维细胞。
图9、说明il-11作为纤维化响应的基本调节剂的作用的图。il-11是纤维化响应所需的必需调节剂。为响应组织损伤或慢性炎症，释放细胞因子如tgfβ1、et-1或pdgf以上调纤维化标志基因的转录。然后产生自分泌剂il-11以响应于这些上游刺激物，确保上调的转录物以细胞特异性方式有效翻译成功能相关的蛋白质。抑制il-11阻断关键细胞外基质和肌成纤维细胞蛋白质的合成并阻止不同组的上游刺激物的促纤维化作用。
图10、il-11的抑制停止胶原蛋白合成以响应促纤维化细胞因子ang2(血管紧张肽ii)、pdgf和et-1响应。将心脏成纤维细胞与ang2、pdgf或et-1和中和il-11抗体一起温育24小时。温育后，对细胞染色胶原并定量荧光。这些刺激物以与tgfβ1相似的水平诱导纤维化响应。然而，如果用抗体中和il-11，则胶原表达不会增加。p值如下：****p<0.0001(t检验)。
图11、取自genbank登录号gi|391353405|ref|nm_000641.3(智人白细胞介素11(il11)，转录变体1，mrna)的人il-11的核苷酸序列[seqidno:1]。加下划线的序列编码il-11mrna。阴影序列用于设计il-11敲除sirna并分别显示为seqidno2-5。seqidno3和4在seqidno:1内彼此重叠。
图12、取自genbank登录号gi|975336|gb|u32324.1|hsu32324(人白细胞介素-11受体α链mrna，完整cds)[seqidno:6]的人il-11rα的核苷酸序列。加下划线的序列编码il-11rαmrna。阴影序列用于设计il-11rα敲除sirna并分别显示为seqidno:7-10。
图13、显示il-11敲除的sirna序列[seqidno:11-14]的表。
图14、显示il-11rα敲除的sirna序列[seqidno15-18]的表。
图15、显示hek细胞中il-11rα的sirna敲除的图。
图16、显示来自人心房成纤维细胞的全部转录组测序的读取深度图，所述人心房成纤维细胞来自具有和不具有tgfβ1刺激的160个个体。
图17、显示由起源组织(人心房组织样品，n＝8)和原代未刺激的成纤维细胞培养物的rna-seq确定的内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞标记基因表达图。(a)pecam1，(b)myh6(c)tnnt2，(d)col1a2和(e)acta2。
图18、显示响应于tgfβ1刺激而在成纤维细胞中il-11表达上调的图。(a和b)图显示纤维化中基因表达的倍数变化；il-11是响应tgfβ1治疗而上调最高的基因。(c)成纤维细胞分泌il-11以响应tgfβ1刺激。(d)在有或没有tgfβ1刺激的情况下，健康个体的组织和心房成纤维细胞中il-11基因表达的比较。(e)通过rna-seq与qpcr所测定的il-11表达倍数变化的对应关系。
图19、显示通过elisa测定的各种促纤维化细胞因子诱导原代成纤维细胞中il-11分泌的图。(a)tgfβ1、et-1、angii、pdgf、osm和il-13诱导il-11分泌，并且il-11也在正反馈环中诱导il-11表达。(b)图显示elisa仅检测从细胞分泌的天然il-11，并且未检测用于il-11刺激条件的重组il-11。(c)和(d)用重组il-11刺激细胞，测量il-11rna，并在指定的时间点通过elisa在细胞培养上清液中测量天然il-11蛋白水平。
图20、显示心房成纤维细胞响应tgfβ1或il-11刺激而生成肌成纤维细胞、产生ecm并表达细胞因子的图和图像。(a)在tgf-β1或il-11刺激后通过原代心房成纤维细胞生成肌成纤维细胞并产生ecm，如通过荧光显微镜在α-sma、胶原蛋白或骨膜蛋白染色后测量的。(b)通过天狼星红染色测定的细胞培养上清液的胶原蛋白含量。通过elisa测量的纤维化标志物(c)il-6、(d)timp1和(e)mmp2的分泌。(f)通过用人或小鼠重组il-11刺激活化鼠成纤维细胞。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001[平均值±sd，dunnett]。
图21、显示il-11的促纤维化作用的图。(a)来自不同来源组织的小鼠成纤维细胞可被il-11活化并显示ecm产量增加。[平均值±sd，dunnett]。用重组il-11或angii注射小鼠导致(b)器官重量增加[平均值±sem]，和(c)胶原蛋白含量增加(通过hpa试验测定)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001[平均值±sd，dunnett]。
图22、显示tgfβ1对成纤维细胞的促纤维化作用需要il-11的图和图像。(a)在对(a)α-sma、(b)edu或(c)periostin染色后，通过荧光显微镜测量，在有或无tgfβ1刺激和存在/不存在中和抗il-11抗体或同种型对照igg的情况下原代心房成纤维细胞的肌成纤维细胞生产和ecm产量。(d至f)通过elisa分析纤维化标志物(d)il-6、(e)timp1和(f)mmp2的分泌。将荧光归一化至无刺激的对照组。[平均值±sd，dunnett]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001或****p<0.0001。
图23、显示中和il-11对由tgfβ1触发的胶原蛋白的产生的影响的图和图像。如(a)operetta试验或(b)天狼星红染色测定，在有或无tgfβ1刺激的情况下以及在存在/不存在中和抗il-11抗体或同种型对照igg的情况下心脏成纤维细胞的胶原蛋白的产量。[平均值±sd，dunnett]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001或****p<0.0001。
图24、显示各种il-11和il-1拮抗剂抑制纤维化的能力的图。用针对il-11的中和抗体、针对il-11rα的中和抗体、结合il-11的诱饵il-11受体分子、下调il-11表达的sirna或下调il-11ra表达的sirna治疗人心房纤维化，并分析了其对体外成纤维细胞中tgfβ1驱动的促纤维化响应的影响。[平均值±sd，dunnett]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001或****p<0.0001。
图25、显示来自il-11-ra敲除小鼠的成纤维细胞对促纤维化治疗的响应的条形图。将来源于il-11rawt(+/+)、杂合子(+/-)和纯合子空白(-/-)小鼠的成纤维细胞与tgfβ1、il-11或angii(5ng/ml)温育24小时。(a)通过分析αsma含量测定的成肌纤维细胞的百分比，(b)通过对edu染色测定的增殖细胞百分比，(c)通过骨膜蛋白检测测量的(c)胶原蛋白含量和(d)ecm产量[平均值±sd]。
图26、显示il-11中和对响应于各种促纤维化刺激物的纤维化的影响的图。在存在/不存在各种不同的促纤维化因子的情况下并且在存在/不存在中和抗il-11抗体或泛抗tgfβ抗体的情况下体外培养成纤维细胞，通过分析αsma表达来确定(a)胶原蛋白产量和(b)肌成纤维细胞产量。[平均值±sd，dunnett]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001或****p<0.0001。
图27、显示了用angii处理后wt和il-11ra(-/-)动物的心房和心脏中纤维化标志物的表达的柱状图。(a)通过羟脯氨酸试验测量的胶原蛋白含量。(b)胶原蛋白(col1a2)的表达。(c)αsma(acta2)表达。(d)纤连蛋白(fn1)的表达。
图28、显示通过肾组织中的胶原蛋白含量测量的il-11ra敲除对叶酸诱导的肾纤维化的影响的图。
图29、与il-11ra+/+小鼠相比，分析il-11ra-/-小鼠(a)肺、(b)皮肤和(c)眼中纤维化的实验程序的示意图。
图30、显示基因表达倍数变化的散点图。(a)用tgfβ1、il-11或tgfβ1和il-11刺激后成纤维细胞中基因表达的变化倍数。(b)在用tgfβ1刺激后，从il-11ra+/+和il-11ra-/-小鼠中获得的成纤维细胞中基因表达的倍数变化。
图31、显示在小梁切除术(过滤手术)后il-11ra敲除对伤口愈合和眼睛纤维化的影响的照片。(a)过滤手术后7天的il-11ra+/+(wt)和il-11ra-/-(ko)动物的眼部切片。(b)通过皮罗-天狼星红/偏振光技术(
图32、显示诱饵il-11受体对响应于tgfβ1刺激的纤维化影响的图。在存在/不存在tgfβ1(5ng/ml)的情况下，在存在或不存在(a)d11r1(诱饵受体50aa连接子)或(b)d11r2(诱饵受体33aa连接子)的情况下，以各种不同浓度体外培养成纤维细胞。浓度。通过分析αsma表达来测定24小时后的肌成纤维细胞生成(即活化的成纤维细胞的百分比)。
图33、显示反式il-11vststim的snp调控表。
图34、显示顺式il-11vststim-vstunstim的snp调控表。
图35、显示反式il-11vststim-vstunstim的snp调控表。
图36a、36b、36c和36d显示局部snp对il-11响应的调控。对来自69个基因型个体的未刺激和刺激的(tgfb1，5ng/ml，24h)成纤维细胞的rna进行测序。根据基因型将样本分组，并比较具有0、1或2个次要等位基因的组之间il-11表达(vststim-vstunstim)的增加。
图37、显示远处snp对il-11响应的调节的图表。对来自69个基因型个体的未刺激和刺激的(tgfb1,5ng/ml，24h)成纤维细胞的rna进行测序。根据基因型将样品分组，并比较具有0个或1个次要等位基因的组之间il11表达(vststim-vstunstim)的增加。
图38a，38b，38c和38d显示tgfβ1在肝成纤维细胞中的促纤维化作用需要il-11。通过分析(a)α-sma阳性细胞、(b)edu阳性细胞、(c)胶原蛋白阳性细胞和(d)骨膜蛋白阳性细胞相对于未刺激细胞(基线)的百分比测定，在存在/不存在中和抗-il-11抗体或同种型对照igg的情况下以及在有或无tgfβ1刺激的情况下的原代人肝脏成纤维细胞的活化和增殖。[平均值±sd，dunnett]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001或****p<0.0001。
图39、显示tgf-β1在皮肤成纤维细胞中的促纤维化作用需要il-11的条形图。通过分析α-sma阳性细胞(活化的成纤维细胞)的百分比测定，在有或无tgfβ1刺激的情况下以及在存在/不存在中和抗-il-11抗体的情况下的小鼠皮肤成纤维细胞的活化。
图40、显示有和无il-11信号传导的肺成纤维细胞迁移的条形图。在没有刺激或在tgfβ1或il-11存在下，通过体外划痕试验分析来自il-11ra+/+(wt)和il-11ra-/-(ko)动物的肺成纤维细胞的迁移。
具体实施方式
实施例1
纤维化响应的特征在于活化的固有成纤维细胞中的广泛的分子变化。为了确定il-11作为这一转变的关键标志物的作用，我们评估了转化生长因子β-1(tgfβ1)活化之前和24小时之后来自80个个体的心房成纤维细胞中的全局rna表达差异，并对其进行分级。我们培养了来自正在进行冠状动脉疾病心脏手术的80个个体的心房的原代成纤维细胞。使用全基因组表达分析(rna-seq)结合表型分析和基因分型，在基线和用tgfβ1(一种强有力的促纤维化刺激物)刺激后，离体研究成纤维细胞。
响应于tgfβ1治疗，il-11表达被显著诱导，rna水平增加30倍(平均>8x)。il-11的表达高于所有其他单个基因的表达(图1a，b)，这意味着在成纤维细胞中表达的约11,500个基因中il-11是最显著上调的。用rt-qpcr和elisa实验(图1c，d)证实了这种上调il-11，表明活化的成纤维细胞中il-11蛋白产生和释放的增加是纤维化的主要驱动因素。
为了评估il-11是否起驱动纤维化的自分泌信号因子的作用，我们将未刺激的心房成纤维细胞与重组il-11一起温育，并监测细胞增殖、肌成纤维细胞生成以及蛋白质水平上的胶原蛋白和骨膜蛋白表达。我们观察到胶原蛋白产量、细胞增殖和骨膜蛋白表达增加的水平与tgfβ1信号通路诱导的相似。il-11活化的成纤维细胞也分化成α-sma+肌成纤维细胞(图2)。
除了其促纤维化功能外，还发现il-11在tgfβ1诱导的纤维化响应本身中起关键作用。用中和抗人il-11单克隆抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)抑制il-11减少了通过tgfβ1对成纤维细胞的活化。当存在il-11抗体时，用tgfβ1温育的细胞不产生更多的细胞外基质蛋白(图3)。
我们发现il-11中和抗体阻止tgfβ1诱导的成纤维细胞活化。
实施例2
炎症和组织损伤刺激涉及成纤维细胞的募集、增殖和活化以产生细胞外基质并启动伤口愈合和瘢痕形成的动态过程。这种纤维化响应的特征在于活化的固有成纤维细胞中的广泛分子变化，其可由tgfβ1(一种局部和浸润细胞释放的多功能细胞因子)诱导。
为了鉴定这种转变的关键标记，我们通过转录组测序评估了tgfβ1活化之前和24小时之后来自80个个体的心房成纤维细胞中的全局rna表达差异，并对其进行分级。如实施例1中所讨论的，活化的成纤维细胞中的il-11表达显著上调，并且我们首次显示il-11转录响应高于所有其他在纤维化中调节的单个基因的转录响应(图4a)。我们的模型系统中的il-11表达水平与各种人类组织的比较表明，高il-11水平对于纤维化响应也是非常特异的(图4b)，使其成为评估人体内纤维化程度的理想标志物。
为了进一步评估il-11是否作为驱动纤维化的自分泌信号因子，我们证实il-11rna的上调(图5a)导致来自心房成纤维细胞的il-11分泌增加(图5b)。用il-11温育成纤维细胞不会增加il-11rna表达(图5c)，但会导致细胞分泌il-11增加(图5d)。这表明il-11对成纤维细胞具有自分泌作用，成纤维细胞在翻译水平上调节il-11蛋白的产量。
然后，我们用tgfβ1、重组il-11或tgfβ1和中和抗人il-11单克隆抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)温育心房成纤维细胞并监测细胞增殖、肌成纤维细胞生成以及蛋白质水平上的骨膜蛋白的表达。我们观察到活化的成纤维细胞(αsma阳性细胞)、骨膜蛋白生成和细胞增殖在tgfβ1和il-11刺激的成纤维细胞中以相似水平增加。除了其促纤维化功能外，还发现il-11在tgfβ1纤维化本身中起关键作用。当用抗体中和il-11时，tgfβ1的促纤维化作用被抑制(图6a-c)。当我们监测纤维化标志物如il6、mmp2和timp1的分泌时观察到相同的模式(图6d-f)。
然后，我们使用覆盖几个基因表达调控水平的大量试验来监测胶原蛋白沉积、纤维化反应的特征性标志。发现tgfβ1增加了细胞内胶原蛋白(图7a)、分泌胶原蛋白(图7b)以及胶原rna水平(图7c)。仅在蛋白质水平(图7a、b)而不在rna水平上观察到对il-11的响应(图7c)。用tgfβ1刺激同时抑制il-11导致胶原rna增加，但是这种tgfβ1驱动的作用未被转发至蛋白质水平。
为了进一步建立il-11在多种促纤维化刺激的纤维化下游中的中心作用，我们评估了来自四种不同组织的成纤维细胞群对tgfβ1(图8a)、et-1(图8b)和pdgf(图8c)响应的的il-11表达。我们还将重组il-11全身给予c57bl/6小鼠并监测胶原蛋白和αsma表达。肾脏、心脏和肝脏中的胶原蛋白产量增加(图8d)，并且我们还在心脏和肾脏中检测到更多活化的成纤维细胞，如较高的αsma蛋白水平所示(图8e)。
我们的研究结果证明了il-11在纤维化中的新颖和中心作用，并且最重要的是，显示il-11在几种组织中关键促纤维化刺激的下游。这些结果显示il-11是tgfβ1从转录调节进行到蛋白质翻译所必需的。il-11的抑制阻止tgfβ1对转录组的促纤维化作用(图9)。
实施例3：抗il-11抗体抑制促纤维化刺激物
在与图3c相似的实验中，将心房成纤维细胞暴露于血管紧张素ii(ang2)、血小板衍生生长因子(pdgf)和内皮素1(et-1)形式的其它促纤维化刺激物中，并测量胶原蛋白产量。
除诱导il-11mrna表达外，ang2、pdgf和et-1各自诱导il-11蛋白表达。中和抗人il-11单克隆抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)对il-11的抑制阻断这些促纤维化作用刺激物各自的促纤维化作用(图10)，表明il-11是主要促纤维化刺激物(tgfβ1、ang2、pdgf和et-1)的中心效应物。
实施例4：il-11r敲除
用非靶向(nt)sirna或针对il11ra1受体的四种不同sirna(sirnas5-8；图14；seqidnos15-18)中的一种转染hek细胞(24h)。提取rna并通过qpcr测定il11ra1mrna表达。数据为相对于对照(nt)的mrna表达水平，如图15所示。
实施例5：il-11在纤维化中的作用
5.1il-11在纤维化中上调
为了解成纤维细胞向活化的肌成纤维细胞转变的分子过程，从新加坡国家心脏中心接受心脏搭桥手术的200多例患者获得了心房组织。细胞在低传代时(传代<4)体外培养，并且未刺激或用tgfβ1刺激24小时。随后，我们对160个个体的未受刺激的成纤维细胞和用原型促纤维化刺激物tgfβ1刺激的细胞进行高通量rna测序(rna-seq)分析；平均读取深度为每个样品～70m读数(配对末端100bp；图16)。
为确保心房成纤维细胞培养物的纯度，我们分析了rna-seq数据集中来自心房的内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞细胞型标记基因的表达(hsuetal,2012circulationcardiovascgenetics5,327-335)。
结果显示在图17a至17e中，并证实了心房成纤维细胞培养物的纯度。
基因表达通过起源组织(人心房组织样品，n＝8)和原代未刺激的成纤维细胞培养物的rna-seq来评估。在成纤维细胞培养物样品中检测不到或检测到非常低的内皮细胞标志物pecam1(图17a)和心肌细胞标志物myh6(图17b)和tnnt2(图17c)的表达。与起源组织相比，成纤维细胞col1a2(图17d)和acta2(图17e)的标志物高度表达。
接下来，分析rna-seq数据以鉴定在用tgfβ1刺激后其表达增加或减少的基因，并且将该信息整合到gtex项目提供的35个以上人类组织中的大rna-seq数据集(gtexconsortium,2015science348,648-660)。这使得能够鉴定特异于成纤维细胞-肌成纤维细胞转变的基因表达特征。
结果显示在图18a至18e中。在成纤维细胞中表达的10000+基因中，响应于tgfβ1刺激，il-11是最强烈上调的基因，平均而言，160个个体中上调超过10倍(图18a)。
通过elisa分析tgfβ1刺激的成纤维细胞的细胞培养物上清液来证实il-11表达的上调(图18c)。与健康个体的其他组织中il-11的表达水平相比，观察到该响应对活化的成纤维细胞高度特异性(图18d)。通过qpcr分析也证实了il-11rna表达的各种倍数变化(图18e)。
接下来，将成纤维细胞在体外培养并用几种其它已知的促纤维化因子：et-1、angii、pdgf、osm和il-13以及人重组il-11刺激。为了分析响应il-11刺激产生的il-11的上调，证实了elisa只能检测从细胞分泌的天然il-11，没有检测用于刺激的重组il-11(图19b)。
结果如图19a所示。发现每个因子显著诱导成纤维细胞分泌il-11。il-11在成纤维细胞中的自分泌循环中起作用，其可在72小时后导致il-11蛋白上调多达100倍(图19d)。
有趣的是，il-11的这种自分泌循环与il-6的自分泌生成类似。il-6来自相同的细胞因子家族，并且还通过gp130受体发信号(garbersandscheller,2013biolchem394,1145-1161)，其被提出以确保肺和乳腺癌细胞的持续存活和生长(grivennikovandkarin,2008cancercell13,7-9)。
未检测到il-11rna水平增加以响应il-11的刺激(图19d)。因此，与tgfβ1在rna和蛋白质水平上增加il-11表达不同，il-11似乎仅在转录后水平上调il-11的表达。
5.2il-11在心脏组织的纤维化中具有促纤维化作用
为了研究il-11的自分泌产生是促纤维化还是抗纤维化，用重组il-11体外培养成纤维细胞，分析肌成纤维细胞(αsma阳性细胞)和细胞外基质产量的分数。
用operettahigh-content成像系统以自动化、高通量的方式监测αsma、胶原蛋白和骨膜蛋白的表达。平行地，通过elisa分析分析诸如mmp2、timp1和il-6等的纤维化标记蛋白的分泌，并且通过对细胞培养上清液进行量热天狼星红分析确认胶原蛋白的水平。
简而言之，来自3个个体的心房成纤维细胞在2个孔中各自在没有刺激的情况下用tgfβ1(5ng/ml)或用il-11(5ng/ml)温育24h。温育后，将细胞染色以分析α-sma含量以估计肌成纤维细胞的分数，以及胶原蛋白和骨膜素的分数以估计ecm产量。对每个孔在7个场中测量荧光。还通过天狼星红染色评估每个个体2个孔的上清液的胶原蛋白含量。信号对没有刺激的对照组进行归一化。通过elisa分析纤维化标志物il-6、timp1和mmp2的分泌。
结果显示在图20a至20f中。tgfβ1活化成纤维细胞并增加ecm产量(图20a)。出乎意料地，与科学文献中对心脏组织中il-11所述的抗纤维化作用相反，重组il-11引起成纤维细胞培养物中肌成纤维细胞分数的增加，并且还促进细胞外基质蛋白胶原和骨膜蛋白的产量达到与tgfβ1相同的程度(图20a)。il-11和tgfβ1细胞因子也显著增加促纤维化标志物il-6、timp1和mmp2的分泌(图20b至20e)，并且达到相似的水平。
本发明发现il-11在心脏组织中促纤维化，而文献中描述其为抗纤维化作用，本发明人假设两者之间的矛盾可能与先前那些研究中在啮齿动物中使用人il-11有关(obanaetal.,2010,2012；stangouetal.,2011；trepicchio和dorner，1998)。
为了研究这个假设，进行人和小鼠il-11的连续稀释，并监测人心房成纤维细胞的活化(图20f)。在低浓度的人il-11时小鼠细胞上未观察到成纤维细胞的活化，这表明先前对il-11功能的见解可部分归因于il-11非特异性观察。
5.3il-11在多种组织的纤维化中具有促纤维化作用
为了测试il-11的促纤维化作用是否对心房成纤维细胞具有特异性，在体外培养来源于几种不同组织(心脏、肺、皮肤、肾和肝)的人成纤维细胞，用人il-11刺激以活化成纤维细胞，如上所述分析ecm的产量。与来自每个待分析组织的成纤维细胞的未刺激培养物相比，观察到成纤维细胞活化增加和ecm产量。
5.3.1肝纤维化
为了测试il-11信号传导在肝纤维化中是否重要，将人原代肝成纤维细胞(cellbiologics，目录号：h-6019)在96孔板的孔中低传代培养，或未刺激，或用tgfβ1(5ng/ml，24h)或il-11(5ng/ml，24h)刺激，或用tgfβ1(5ng/ml)和中和il-11抗体(2μg/ml)一起温育，或用tgfβ1(5ng/ml)和同种型对照抗体一起温育。使用operetta平台分析成纤维细胞活化(αsma阳性细胞)、细胞增殖(edu阳性细胞)和ecm产量(骨膜蛋白和胶原蛋白)。
图38a至38d显示了原代人肝成纤维细胞的实验结果。发现il-11活化肝成纤维细胞，并且发现il-11信号传导对tgfβ1在肝成纤维细胞中的促纤维化作用是必需的。成纤维细胞的活化和增殖都被中和抗il-11抗体抑制。
5.3.2皮肤纤维化
为了测试il-11信号传导在皮肤纤维化中是否重要，将原代小鼠皮肤成纤维细胞在96孔板的孔中以低传代培养，或未刺激，或用tgfβ1(5ng/ml，24h)刺激，或与tgfβ1(5ng/ml)和中和il-11抗体(2μg/ml)一起温育。然后使用operetta平台分析成纤维细胞活化(αsma阳性细胞)。
结果显示在图39中。tgfβ1介导的皮肤成纤维细胞的活化被中和抗il-11抗体抑制。
5.3.3多器官纤维化
接下来，将小鼠重组il-11注射(100μg/kg，3天/周，28天)到小鼠中以测试il-11是否可以驱动体内全身组织纤维化。
结果显示在图21中。与注射angii(引起血压升高和心脏肥大的细胞因子)相比，il-11也增加了心脏重量，但还增加了肾脏、肺和肝的重量，重量均以体重为指数(图21b)。通过羟脯氨酸试验对这些组织中的胶原蛋白含量进行评估，显示这些组织中胶原蛋白的产量上调，表明纤维化是器官重量增加的可能原因(图6c)。通过对从这些动物的心脏、肾、肺和肝组织分离的rna的qpcr分析还检测到纤维化标志物基因acta2(＝αsma)、col1a1、col3a1、fn1、mmp2和timp1的表达。
实施例6：il-11/il-11r拮抗的治疗潜力
6.1使用il-11/il-11r的中和拮抗剂抑制纤维化响应
接下来研究tgf-β1对成纤维细胞的促纤维化作用是否需要il-11分泌的自分泌环。
使用市售中和抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)抑制il-11。在存在或不存在抗体的情况下用tgfβ1处理成纤维细胞，并测量成纤维细胞活化、增殖细胞的比例和ecm产量以及纤维化响应的标志物。
简而言之，将来自3个个体的心房成纤维细胞与tgfβ1(5ng/ml)或在中和抗il-11抗体或同种型对照抗体存在下与tgfβ1一起温育24小时。温育后，将细胞针对αsma进行染色以确定肌成纤维细胞的分数，通过分析细胞的edu掺入来确定增殖细胞的比例，并且测量骨膜蛋白以确定ecm产量。用operetta平台测量每个个体2个孔在14个场的荧光。还通过elisa分析了纤维化标志物il-6、timp1和mmp2的分泌。将荧光归一化至未刺激的对照组。
结果显示在图22a至22f中。发现il-11的抑制可改善tgfβ1诱导的纤维化，并且显示il-11对于tgfβ1的促纤维化作用是必需的。发现il-11的抑制在蛋白质水平上“拯救”tgfβ1表型。
还分析了胶原蛋白产量。将源自3个个体的心脏成纤维细胞与tgfβ1(5ng/ml)或tgfβ1和中和il-11抗体温育24小时。温育后，使用operetta测定法将细胞染色以获得胶原蛋白，并如上所述定量荧光。通过天狼星红染色评估细胞培养物上清液中分泌的胶原蛋白水平。
结果显示在图23a和23b中，并证实了使用中和抗体抑制il-11的抗纤维化作用。
接下来，使用上文所述的心房成纤维细胞、tgfβ1诱导的肌成纤维细胞转变试验体外分析几种其他il-11/il-11r拮抗剂抑制纤维化的能力。
简而言之，体外培养人心房成纤维细胞，用tgfβ1(5ng/ml)刺激24小时或不刺激，在存在/不存在下列物质的情况下：(i)中和抗il-11抗体，(ii)il-11ra-gp130融合蛋白，(iii)中和抗il-11ra抗体，(iv)用针对il-11的sirna处理或(v)用针对il-11ra的sirna处理。通过如上所述评估αsma含量，分析活化的成纤维细胞(肌成纤维细胞)的比例。
结果显示在图24中。发现每种il-11/il-11r信号传导的拮抗剂都能够消除tgfβ1介导的促纤维化响应。
实施例7：il-11/il-11r信号传导的促纤维化作用的体内确认
7.1使用来自il-11ra基因敲除小鼠的细胞的体外研究
将所有小鼠饲养在同一房间内，并随意提供食物和水。缺乏il-11rα功能性等位基因的小鼠(il-11ra1ko小鼠)在c57b1/6遗传背景上。小鼠是9-11周龄，动物体重没有显著差异。
为了进一步证实il-11/il-11r信号传导抑制的抗纤维化作用，il-11ra基因敲除小鼠产生原代成纤维细胞，并与从il-11ra+/+(即野生型)、il-11ra+/-(即杂合敲除)和il-11ra-/-(即纯合敲除)的动物收获的原代成纤维细胞以及tgfβ1、il-11或angii一起温育。分析成纤维细胞的活化和增殖以及ecm产量。
将源自il-11ra+/+、il-11ra+/-和il-11ra-/-小鼠的成纤维细胞与tgfβ1、il-11或angii(5ng/ml)一起温育24小时。温育后，针对αsma含量进行细胞染色以估计肌成纤维细胞的分数，针对edu以鉴定增殖细胞的分数，以及针对胶原蛋白和骨膜蛋白以估计ecm产量。使用operetta平台测量荧光。
结果显示在图25a至25d中。发现il-11ra-/-小鼠不响应促纤维化刺激。这些结果表明il-11信号传导也是angii诱导的纤维化所必需的。
接下来，研究了其他促纤维化细胞因子是否也是如此。
简而言之，在存在/不存在各种不同的促纤维化因子(ang2、et-1或pdgf)和存在/不存在中和抗il-11抗体或泛抗-tgfβ抗体的情况下，体外培养成纤维细胞。24小时后，如上所述通过使用operetta系统分析确定细胞的胶原蛋白产量，并且通过如上所述分析αsma表达来测定肌成纤维细胞的产量。
结果显示在图26a和26b中。发现il-11对于各种促纤维化刺激物的纤维化下游是必需的，并且因此被鉴定为由各种不同促纤维化因子诱导的纤维化的中心介质。
在进一步的实验中，使用肺成纤维细胞迁移的体外划痕试验来研究il-11信号传导的作用在肺纤维化中的作用。响应于促纤维化刺激，成纤维细胞被活化并在体内纤维化生态位内迁移。细胞的迁移速率是细胞-细胞和细胞-基质相互作用的量度以及体内伤口愈合的模型(liangetal.,2007；natprotoc.2(2):329-33)。
源自野生型(wt)和纯合il-11ra(-/-)敲除小鼠的肺组织的成纤维细胞在塑料表面上以低传代生长，直到它们形成均匀的细胞单层。然后在细胞层中产生划痕，并在无刺激或存在tgfβ1或il-11的情况下监测接近划痕的细胞迁移。在产生划痕之后立即和之后24小时这两个时间点拍摄的图像用于确定细胞覆盖的区域，并比较wt和ko成纤维细胞之间的迁移速率。将细胞迁移(24小时后由细胞覆盖的划痕中的区域)归一化至无刺激的wt细胞的迁移速率。
结果显示在图40中。显示来自wt小鼠的肺成纤维细胞在tgfβ1和il-11存在下迁移得更快，表明两种细胞因子在肺成纤维细胞中的促纤维化作用。与wt细胞相比，缺乏源自ko小鼠的il-11信号传导的细胞迁移得更慢。它们在tgfβ1的存在下也没有迁移得更快。划痕试验揭示缺乏il-11信号传导的肺成纤维细胞在tgfβ1或il-11存在下和在基线时均具有降低的细胞迁移速率。因此，抑制il-11信号传导在肺中是抗纤维化的。
7.2心脏纤维化
体内研究了il-11抑制对治疗纤维化病症的功效。用于心脏纤维化的小鼠模型(其中通过用angii处理诱导纤维化)用于研究il-11ra-/-小鼠是否免于心脏纤维化。
简而言之，植入泵，并用angii(2mg/kg/天)处理野生型(wt)il-11ra(+/+)和敲除(ko)il-11ra(-/-)小鼠28天。在实验结束时，使用基于羟基脯氨酸的量热试验试剂盒评估小鼠的心房中胶原蛋白含量，并通过qpcr分析标志物或纤维化col1a2、αsma(acta2)和纤连蛋白(fn1)的rna表达水平。
结果显示在图27a至27d中。发现il-11ra-/-小鼠免受angii的促纤维化作用。
7.3肾纤维化
在野生型(wt)il-11ra(+/+)和敲除(ko)il-11ra(-/-)小鼠中通过腹膜内注射含叶酸(180mg/kg)的载体(0.3mnahco3)来建立肾纤维化小鼠模型；向对照小鼠单独施用载体。在注射后28天取出肾脏，称重并且固定在10％中性缓冲液的福尔马林中用于masson三色染色和sirius染色或速冻以进行胶原蛋白测定、rna和蛋白质研究。
使用trizol试剂(invitrogen)和qiagentissuelyzer方法从速冻的肾中提取总rna，然后用rneasy柱(qiagen)纯化。按照制造商的说明书，使用iscripttmcdna合成试剂盒制备cdna，其中每个反应含有1μg的总rna。用taqman(appliedbiosystems)或快速sybrgreen(qiagen)技术使用steponeplustm(appliedbiosystem)在40个循环中对样品(一式三份)进行定量rt-pcr基因表达分析。将表达数据归一化至gapdhmrna表达水平，并且我们使用2-δδct方法来计算倍数变化。速冻的肾脏通过在浓度为50mg/ml的6mhcl中加热进行酸水解(95℃，20小时)。根据制造商的说明书，使用quickzymetotalcollagen测定试剂盒(quickzymebiosciences)，基于羟脯氨酸的比色检测对水解产物中的总胶原蛋白量进行定量。
分析结果显示在图28中，显示叶酸诱导的肾纤维化依赖il-11介导的信号传导。在il-11ra+/+小鼠中观察到肾组织中胶原蛋白含量的显著增加，表明肾纤维化。在il-11ra-/-小鼠中未观察到胶原蛋白含量显著增加。与野生型动物相比，il-11信号传导缺陷的动物在毒性损伤后肾中的胶原蛋白沉积显著减少。
7.4肺纤维化
使用il-11ra-/-敲除小鼠，在进一步的体内模型中，il-11被证实是肺、皮肤和眼睛中纤维化的关键介质。实验示意图如图29a至29c所示。
为了分析肺纤维化，在第0天通过气管内给予博来霉素来处理il-11ra-/-小鼠和il-11ra+/+小鼠，以在肺中建立纤维化响应(肺纤维化)。肺的纤维化发展21天，此时动物被处死并分析具有和不具有il-11信号传导的动物之间的纤维化标志物的差异。如纤维化标志物表达减少所证明的，与il-11ra+/+小鼠相比，il-11ra-/-小鼠在肺组织的纤维化反应减少。
7.5皮肤纤维化
为了分析皮肤的纤维化，在第0天通过皮下给予博来霉素处理il-11ra-/-小鼠和il-11ra+/+小鼠以在皮肤中建立纤维化反应。皮肤纤维化形成28天，此时动物处死并分析动物间具有和不具有il-11信号传导的纤维化标志物的差异。如纤维化标志物表达减少所证明的，与il-11ra+/+小鼠相比，il-11ra-/-小鼠在皮肤组织中的纤维化反应减少。
7.6眼纤维化
为了分析眼中的纤维化，il-11ra-/-小鼠和il-11ra+/+小鼠在第0天接受小梁切除术以启动眼内的伤口愈合反应。眼睛纤维化在7天内发生。在il-11ra-/-小鼠和il-11ra+/+小鼠之间测量和比较纤维化响应。如纤维化标志物表达减少所证明的，与il-11ra+/+小鼠相比，il-11ra-/-小鼠在眼组织中的纤维化反应减少。
7.7其他组织
il-11ra敲除对纤维化的作用也在其他组织如肝脏、肠的纤维化小鼠模型中进行分析，并且还在与多器官(即全身性)纤维化有关的模型中进行分析。在il-11ra-/-小鼠和il-11ra+/+小鼠之间测量和比较纤维化响应。如纤维化标志物表达减少所证明的，与il-11ra+/+小鼠相比，il-11ra-/-小鼠纤维化反应减少。
实施例8：分析il-11介导的纤维化诱导的分子机制
il-11的典型作用模式被认为是通过stat3介导的转录调控rna表达(zhuetal.,2015plosone10,e0126296)，并且还通过erk的活化。
在用il-11刺激后观察到stat3活化。然而，当成纤维细胞与tgfβ1一起温育时，仅观察到典型smad途径和erk途径的活化，但未观察到stat3的活化，即使尽管响应于tgfβ1而分泌il-11。只有erk活化对于tgfβ1和il-11信号转导是共同的。
先前已经描述了tgfβ1和il-6信号传导之间的串扰，其中tgfβ1通过il-6阻断stat3的活化(waliaetal.,2003fasebj.17,2130-2132)。鉴于il-6和il-11之间的密切关系，对于il-11介导的信号传导可以观察到类似的串扰。
本发明人通过rna-seq分析研究了rna丰度的调节是否为纤维化标志物蛋白质表达增加以响应il-11的机制，这将表明stat3作为il-11介导的促纤维化过程的潜在信号传导途径。成纤维细胞在未刺激、或存在tgfβ1、il-11或tgfβ1和il-11的情况下温育24小时。
结果如图30a所示。tgfβ1在rna水平诱导胶原蛋白、acta2(αsma)等纤维化标志物的表达。然而，il-11不调节这些基因的表达，而是调节不同的一组基因。
基因本体论分析表明，成纤维细胞中的促纤维化作用是由il-11调节rna表达驱动的。tgfβ1和il-11都在rna水平上调节几乎完全不同的一组基因。
虽然tgfβ1增加il-11的分泌，但当tgfβ1和il-11都存在时，il-11的靶基因不受调控。这表明tgfβ1上调il-11，同时通过stat3阻断典型il-11驱动的rna表达调控，类似于已知的关于tgfβ1和il-6途径的相互作用(walia等，2003fasebj.17，2130-2132)。
我们还通过分析从il-11ra-/-小鼠获得的成纤维细胞中rna表达与il-11ra+/+小鼠相比的变化，分析了由tgfβ1诱导的rna表达差异是否依赖于il-11信号传导。当tgf-β1刺激il-11ra敲除细胞时，仍观察到tgfβ1调节的rna表达，并且在没有il-11信号传导的情况下，αsma、胶原蛋白等rna水平仍上调(在il-11ra-/-成纤维细胞中)。如通过qpcr测定，当体外研究il-11的促纤维化作用和il-11抑制的抗纤维化作用时，仅在蛋白质水平观察到纤维化标志物表达的降低，而不是在转录水平。
已知非典型途径(例如erk信号转导)的活化对于tgfβ1的促纤维化作用很重要(guo和wang，2008cellres19,71-88)。非典型途径很可能对于所有已知的促纤维化细胞因子的信号传导都很重要，并且il-11很可能是纤维化所必需的转录后调节物。
实施例9：人抗人il-11抗体
通过噬菌体展示开发完全人抗人il-11抗体。
从genscript(nj，usa)获得重组人il-11(目录号z03108-1)和重组鼠il-11(目录号z03052-1)。重组人il-11在cho细胞中表达，均为fc标记形式和无标记形式。无标记的鼠il-11在hek293细胞中表达。
通过使用原代成纤维细胞培养物的体外分析证实了重组人il-11和小鼠il-11的il-11生物活性。
根据标准方法，还通过重组人il-11和鼠il-11分子的生物素化来制备重组生物素化的人il-11和鼠il-11。
通过噬菌体展示鉴定能够结合人il-11和鼠il-11两者的抗体(即交叉反应性抗体)，其中，根据16中不同的筛选策略，使用生物素化的和非生物素化的重组人和鼠il-11进行筛选，使用人初始文库进行噬菌体展示。
噬菌体展示鉴定出175个scfv结合物，为“首击”。对来自这些175scfv的cdr序列进行序列分析，鉴定出86个独特的scfv。
通过在大肠杆菌中重组表达产生可溶性scfv，并通过elisa分析其结合人il-11和鼠il-11的能力。简而言之，将各自的抗原包被在elisa平板的孔中，以1:2稀释度添加含有各自scfv的细胞培养上清液，然后检测结合情况。
elisa分析的结果显示：
·8个scfv能够仅结合人il-11的；
·6个scfv仅能结合鼠il-11；
·32个scfv显示仅与人/鼠il-11弱结合并具有高信噪比，和；
·40个scfv对人il-11和鼠il-11都具有交叉反应性。
从这86个scfv中，选择了56个候选物用于进一步的功能表征。为了进一步分析，在大肠杆菌中将scfv克隆为scfv-fc形式。
将抗体的vh和vl序列克隆到用于产生scfv-fc(人lgg1)抗体的表达载体中。所述载体在无血清培养基中培养的哺乳动物细胞中瞬时表达，并通过蛋白a纯化分离。
实施例10：人抗人il-11抗体的功能表征
在体外试验中分析实施例9中描述的抗体的(i)抑制人il-11介导的信号传导和(ii)抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力。还通过elisa分析抗体对人il-11的亲和力。
10.1抑制人il-11介导的信号传导的能力
为了研究中和人il-11介导的信号传导的能力，在存在或不存在抗-il-11抗体的情况下，存在或不存在抗il-11抗体情况下，和存在tgf-β1(5ng/ml)的情况下，将心房心脏人成纤维细胞在的96孔板的孔中培养24小时。tgfβ1促进il-11的表达，其继而驱动静止的成纤维细胞转化为活化的αsma阳性的成纤维细胞。先前已经显示中和il-11阻止tgfβ1诱导的向活化的αsma阳性的成纤维细胞的转变。
使用operettahigh-content成像系统以自动化高通量方式分析αsma的表达。
在未刺激的培养物中，约29.7％(＝1)的成纤维细胞在24小时培养期结束时为αsma阳性、活化的成纤维细胞，而在不存在抗il-11抗体而用tgfβ1刺激的培养物中约52％(＝1.81)的成纤维细胞为αsma阳性。
向用tgfβ1刺激的成纤维细胞培养物中加入抗il-11抗体(2μg/ml)，并且在24小时培养期结束时，测定αsma阳性成纤维细胞的百分比。基于在未用tgfβ1刺激的成纤维细胞培养物中观察到的αsma阳性成纤维细胞的百分比，将百分比归一化。
证明其中28种抗体能够中和人il-11介导的信号传导。
在实验中也分析了市售单克隆小鼠抗il-11抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)抑制人il-11信号传导的能力。发现该抗体能够将活化的成纤维细胞的百分比降低至28.3％(＝0.99)。
几种克隆比市售小鼠抗il-11抗体(工业标准)更大程度地中和人il-11的信号传导。
10.2抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力
还按照上述10.1部分所述的相同程序，但使用小鼠真皮成纤维细胞而不是人心房成纤维细胞，研究人抗体抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力。
培养24小时后，培养物中约31.8％(＝1)未刺激的细胞为活化的成纤维细胞。与未刺激的培养物相比，用tgfβ1刺激导致活化的成纤维细胞百分比增加约2倍(68.8％＝2.16)。
证明了抗体能够中和由小鼠il-11介导的信号传导。还分析了小鼠抗-il-11抗体(单克隆小鼠lgg2a克隆#22626，目录号mab218)抑制小鼠il-11的信号传导的能力。发现该抗体能够将活化的成纤维细胞的百分比降低至39.4％(＝1.24)。
几种克隆比市售小鼠抗il-11抗体(工业标准)更大程度地中和小鼠il-11的信号传导。
10.3分析人il-11的抗体亲和力
通过elisa试验分析人抗人il-11抗体与人il-11结合的亲和力。
从genscript获得重组人il-11，从sigma获得辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗人lgg(fc特异性)抗体。corning96孔elisa板获自sigma。pierce3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)elisa底物试剂盒获自lifetechnologies(0.4g/mltmb溶液，0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液)。牛血清白蛋白和硫酸获自sigma。洗涤缓冲液为包含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pbs-t)。如上所述产生scfv-fc抗体。纯化的小鼠和人lgg对照购自lifetechnologies。使用tecaninfinite200pronanoquant来测量吸光度。
如hornbecketal.,(2015)currprotocimmunol110,2.1.1-23所述进行十字交叉系列稀释分析以确定包被抗原、一抗和二抗的最佳浓度。
如先前所述(unverdorbenetal.,(2016)mabs8,120-128)，进行间接elisa以评估初级scfv-fc抗体在50％有效浓度(ec50)下的结合亲和力。用1μg/ml的重组人il-11包被elisa平板，在4℃下过夜，剩余的结合位点用2％bsa的pbs封闭。将scfv-fc抗体稀释于1％bsa的pbs溶液中，滴定以获得800、200、50、12.5、3.125、0.78、0.195和0.049ng/ml的工作浓度，并在室温下一式两份温育2小时。用15.625ng/ml的hrp缀合的抗人lgg(fc-特异性)抗体进行抗原-抗体结合的检测。在与检测抗体温育2小时后，加入100μl的tmb底物15分钟，用100μl2mh2so4终止显色反应。在450nm处测量吸光度读数，参考波长校正在570nm。用graphpadprism软件对数据进行拟合，先进行抗体浓度的对数转换，然后用不对称(五参数)对数剂量-响应曲线进行非线性回归分析，以确定单个ec50值。
进行与上述相同的材料和程序以确定对鼠单克隆抗il-11抗体的结合亲和力，不同之处在于使用hrp缀合的抗小鼠lgg(h&l)代替hrp缀合的抗il-人igg。
进行与上述相同的材料和程序以确定从人单克隆抗il-11抗体和鼠单克隆抗il-11抗体与从genscript获得的重组鼠il-11的结合亲和力。
elisa试验的结果用于确定抗体的ec50值。
10.4在各种组织中抑制人il-11介导的信号传导的能力
基本上如部分10.1所述，研究了在由多种不同组织获得的成纤维细胞中抗体中和il-11介导的信号传导的能力，不同之处在于，将来自肝、肺、肾、眼、皮肤、胰腺、脾脏、肠、脑和骨髓的人成纤维细胞用于实验，代替心脏心房人成纤维细胞。
通过观察在抗il-11抗体的存在下在24小时培养期结束时αsma阳性成纤维细胞比例与不存在抗体时的培养相比相对降低，证明了抗il-11抗体能够中和源自各种不同组织的成纤维细胞中的信号传导。
实施例11：使用抗il-11抗体体内抑制纤维化
在用于各种不同组织的纤维化的体内小鼠模型中证实了抗人il-11抗体的治疗用途。
11.1心脏纤维化
将泵植入，并用angii(2mg/kg/天)处理小鼠28天。
通过静脉注射将中和抗il-11抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在实验结束时，使用基于羟基脯氨酸的量热试验试剂盒评估小鼠的心房中胶原蛋白的含量，并通过qpcr分析标志物或纤维化col1a2、αsma(acta2)和纤连蛋白(fn1)的rna表达水平。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗-il-11抗体处理的小鼠在心脏组织中的纤维化反应减少。
11.2肾纤维化
建立肾纤维化小鼠模型，其中通过腹膜内注射含叶酸(180mg/kg)的载体(0.3mnahco3)来诱导纤维化；对照小鼠单独施用载体。
通过静脉注射将中和抗il-11抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第28天取出肾脏，称重并固定在10％中性缓冲的福尔马林中，用于masson三色染色和sirius染色或速冻以进行胶原蛋白测定、rna和蛋白质研究。
使用trizol试剂(invitrogen)和qiagentissuelyzer方法从速冻的肾中提取总rna，然后用rneasy柱(qiagen)纯化。按照制造商的说明，使用iscripttmcdna合成试剂盒制备cdna，其中每个反应含有1μg总rna。用taqman(appliedbiosystems)或快速sybrgreen(qiagen)技术使用steponeplustm(appliedbiosystem)在40个循环上对样品(一式三份)进行定量rt-pcr基因表达分析。将表达数据归一化至gapdhmrna表达水平，并使用2-δδct方法计算倍数变化。快速冷冻的肾脏通过在浓度为50mg/ml的6mhcl中加热进行酸水解(95℃，20小时)。根据制造商的说明书，使用quickzymetotalcollagen测定试剂盒(quickzymebiosciences)，根据羟脯氨酸的比色检测对水解产物中的总胶原蛋白含量进行定量。
如用纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11抗体处理的小鼠在肾组织中的纤维化反应减少。
11.3肺纤维化
在第0天通过气管内施用博来霉素来治疗小鼠以建立肺中的纤维化响应(肺纤维化)。
通过静脉注射将中和抗il-11抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
正如纤维化标志物表达降低所证明的，与用对照抗体治疗的小鼠相比，用中和抗il-11抗体治疗的小鼠在肺组织中的纤维化反应减少。
11.4皮肤纤维化
在第0天通过皮下施用博来霉素处理小鼠以在皮肤中建立纤维化反应。
通过静脉注射将中和抗il-11抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
正如纤维化标记物表达降低所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11抗体处理的小鼠在皮肤组织中的纤维化反应减少。
11.5眼纤维化
小鼠在第0天接受小梁切除术以启动眼睛中的伤口愈合反应。
通过静脉注射将中和抗il-11抗体或对照抗体给予不同组的小鼠，并在眼组织中监测纤维化。
正如纤维化标记物表达降低所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11抗体处理的小鼠在眼组织中的纤维化反应减少。
11.6其他组织
还在用于其他组织(例如肝、肾、肠)的纤维化小鼠模型中分析用中和抗il-11抗体治疗对纤维化的作用，并且还在与多器官(即全身性)纤维化有关的模型中进行分析。
如用纤维化标志物表达降低所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11抗体处理的小鼠的纤维化反应减少。
实施例12：抗人il-11rα抗体
针对人il-11rα蛋白的小鼠单克隆抗体如下产生。
将编码人il-11rα氨基酸的cdna克隆到表达质粒(aldevrongmbh，freiburg，德国)中。
通过使用用于粒子轰击的手持装置(“基因枪”)皮内施用dna包被的金颗粒来免疫小鼠。在一系列免疫后从小鼠收集血清样品，并在用人il-11rα表达质粒瞬时转染的hek细胞上进行流式细胞术测试(通过瞬时转染的hek细胞对人il-11rα的细胞表面表达通过抗标签抗体识别添加到il-11rα蛋白的n-末端的标签来证实)。
根据标准程序从小鼠分离抗体生成细胞并与小鼠骨髓瘤细胞(ag8)融合。
通过流式细胞术筛选与表达il-11rα的hek细胞结合的能力，鉴定产生il-11rα特异性抗体的杂交瘤。
使用rna保护剂(thermofisherscientific的rnalater，目录号am7020)制备阳性杂交瘤细胞的细胞团并进一步处理以对抗体的可变结构域测序。
根据制造商的说明使用
总共产生了17个小鼠单克隆抗人il-11rα抗体克隆。
实施例13：抗人il-11rα抗体的功能表征
13.1抑制人类il-11/il-11r介导的信号传导的能力
为了研究抗il-11rα抗体中和人il-11/il-11r介导的信号传导的能力，在存在或不存在抗il-11rα抗体的情况下，在tgf-β1(5ng/ml)存在下，将心房心脏成纤维细胞在96孔板的孔中培养24小时。这种促纤维化刺激物促进il-11的表达，其继而驱动静止的成纤维细胞转变为活化的αsma阳性成纤维细胞。先前已经显示中和il-11阻止tgfβ1诱导的向活化的αsma阳性成纤维细胞的转变。
将抗il-11rα抗体(2μg/ml)加入到用tgfβ1刺激的成纤维细胞培养物中，并且在24小时培养期结束时，测定αsma阳性成纤维细胞的百分比。基于在未用tgfβ1刺激的成纤维细胞培养物中观察到的αsma阳性成纤维细胞的百分比，将百分比归一化。
使用operettahigh-content成像系统以自动化高通量方式分析αsma的表达。
在不存在抗il-11rα抗体的情况下，用tgfβ1刺激导致在24小时培养期结束时αsma阳性、活化的成纤维细胞数量增加1.58倍。
用市售的单克隆小鼠抗il-11抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)作为对照。发现该抗体能够将活化的成纤维细胞的百分比降低至未刺激培养物(即在不存在用tgfβ1刺激的情况下)中活化的成纤维细胞百分比的0.89倍。
发现抗il-11rα抗体能够抑制人成纤维细胞中的il-11/il-11r信号传导，并且其中几种能够比单克隆小鼠抗il-11r抗体更大程度地抑制il-11/il-il-11信号传导。
13.2抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力
还按照上文第13.1节所述的相同程序，但使用小鼠心房成纤维细胞而不是人心房成纤维细胞，研究了抗il-11rα抗体抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力。
在不存在抗il-11rα抗体的情况下，用tgfβ1刺激导致24小时培养期结束时αsma阳性活化的成纤维细胞数量增加2.24倍。
用市售单克隆小鼠抗il-11抗体(单克隆小鼠lgg2a；克隆#22626；目录号mab218；r&dsystems，mn，usa)作为对照。发现该抗体能够将活化的成纤维细胞的百分比降低至未刺激的培养物(即在不存在用tgfβ1刺激的情况下)中活化的成纤维细胞百分比的1.44倍。
发现抗il-11rα抗体能够抑制小鼠成纤维细胞中的il-11/il-11r信号传导，并且其中几种能够比单克隆小鼠抗il-11r抗体更大程度地抑制il-11/il-il-11信号传导。
13.3筛选结合il-11rα的能力
亚克隆产生抗人il-11rα抗体的小鼠杂交瘤，并通过“混合-测量”ique测定法分析来自亚克隆杂交瘤的细胞培养上清液的(i)结合人il-11rα的能力，(ii)与il-11rα以外的抗原的交叉反应性。
简而言之，将标记的对照细胞(在细胞表面不表达il-11rα)和在其表面表达人il-11rα的未标记靶细胞(用编码flag-标记人il-11rα的质粒瞬时转染后)与细胞培养上清液(含有小鼠抗il-11rα抗体)和第二检测抗体(荧光标记抗小鼠ligg抗体)混合。
然后使用htfc筛选系统(ique)分析两种标记(即细胞标记和二抗上的标记)。对未标记的il-11rα表达细胞上的第二抗体的检测表明小鼠抗il-11rα抗体结合il-11rα的能力。标记的对照细胞上的第二抗体的检测表明小鼠抗il-11rα抗体对il-11rα以外的靶标具有交叉反应性。
作为阳性对照条件，将标记和未标记的细胞与作为第一抗体的小鼠抗flag标签抗体一起温育。
大多数亚克隆杂交瘤表达能够结合人il-11rα的抗体，并且其以高特异性识别该靶标。
13.4分析人il-11rα的抗体亲和力
通过elisa试验分析抗人il-11rα抗体与人il-11rα结合的亲和力。
从genscript获得重组人il-11rα，从sigma获得辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗人lgg(fc-特异性)抗体。corning96孔elisa板获自sigma。pierce3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)elisa底物试剂盒从lifetechnologies获得(0.4g/mltmb溶液，0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液)。牛血清白蛋白和硫酸获自sigma。洗涤缓冲液为包含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pbs-t)。纯化的lgg对照购自lifetechnologies。tecaninfinite200pronanoquant用于测量吸光度。
如hornbecketal.,(2015)currprotocimmunol110,2.1.1-23所述进行十字交叉系列稀释分析，以确定包被抗原、一抗和二抗的最佳浓度。
如先前所述(unverdorbenetal.,(2016)mabs8,120-128)进行间接elisa以评估小鼠抗il-11rα抗体在50％有效浓度(ec50)下的结合亲和力。用1μg/ml的重组人il-11rα包被elisa板，在4℃下过夜，剩余的结合位点用pbs中的2％bsa封闭。将抗体稀释于含1％bsa的pbs中，滴定以获得800、200、50、12.5、3.125、0.78、0.195和0.049ng/ml的工作浓度，并在室温下一式两份温育2小时。用15.625ng/ml的hrp缀合的抗小鼠igg抗体进行抗原-抗体结合的检测。在与待检测抗体温育2小时后，加入100μltmb底物15分钟，并用100μl2mh2so4终止显色反应。在450nm处测量吸光度读数，并在570nm处进行参考波长校正。使用graphpadprism软件对数据进行拟合，先进行抗体浓度的对数转换，然后用非对称(五参数)对数剂量-反应曲线进行非线性回归分析以确定单个ec50值。
13.5在各种组织中抑制人类il-11/il-11r信号传导的能力
基本上如部分13.1中所述，研究了抗体中和在从各种不同组织获得的成纤维细胞中的il-11/il-11r信号传导的能力，不同之处在于，将衍生自肝、肺、肾、眼睛、皮肤、胰腺、脾、肠、脑和骨髓的人成纤维细胞用于实验，代替心脏心房人成纤维细胞。
通过观察在抗il-11rα抗体的存在下培养24小时培养期结束时αsma阳性成纤维细胞比例与不存在抗体时的培养相比相对降低，证明了抗il-11rα抗体能够中和源自各种不同组织的成纤维细胞中的信号传导。
实施例14：使用抗il-11rα抗体体内抑制纤维化
抗人il-11rα抗体的治疗用途在各种不同组织的纤维化小鼠模型中体内证实。
14.1心脏纤维化
将泵植入，并用angii(2mg/kg/天)处理小鼠28天。
通过静脉内注射将中和抗il-11rα抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在实验结束时，使用基于羟基脯氨酸的量热测定试剂盒评估小鼠的心房中胶原蛋白含量，并通过qpcr分析标志物或纤维化col1a2、αsma(acta2)和纤连蛋白(fn1)的rna表达水平。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体治疗的小鼠相比，通过中和抗il-11rα抗体治疗的小鼠在心脏组织中的纤维化反应减少。
14.2肾纤维化
建立肾纤维化小鼠模型，其中通过腹膜内注射含叶酸(180mg/kg)的载体(0.3mnahco3)诱导纤维化；对照小鼠单独施用载体。
通过静脉内注射将中和性抗il-11rα抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第28天取出肾脏，称重并固定在10％中性缓冲的福尔马林中用于masson三色染色和sirius染色或速冻以进行胶原蛋白测定、rna和蛋白质研究。
使用trizol试剂(invitrogen)和qiagentissuelyzer方法从速冻的肾中提取总rna，然后用rneasy柱(qiagen)纯化。按照制造商的说明书，使用iscripttmcdna合成试剂盒制备cdna，其中每个反应含有1μg总rna。用taqman(appliedbiosystems)或快速sybrgreen(qiagen)技术使用steponeplustm(appliedbiosystem)在40个循环上对样品(一式三份)进行定量rt-pcr基因表达分析。将表达数据归一化至gapdhmrna表达水平，并使用2-δδct方法计算倍数变化。快速冷冻的肾脏通过在浓度为50mg/ml的6mhcl中加热进行酸水解(95℃，20小时)。根据制造商的说明书，使用quickzymetotalcollagen测定试剂盒(quickzymebiosciences)，基于羟脯氨酸的比色检测对水解产物中的总胶原蛋白量进行定量。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体治疗的小鼠相比，通过中和抗il-11rα抗体治疗的小鼠在肾组织中的纤维化反应减少。
14.3肺纤维化
在第0天通过气管内施用博来霉素来治疗小鼠以建立肺中的纤维化响应(肺纤维化)。
通过静脉内注射将中和抗il-11rα抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11rα抗体处理的小鼠在肺组织中的纤维化反应减少。
14.4皮肤纤维化
在第0天通过皮下给予博来霉素处理小鼠以在皮肤中建立纤维化响应。
通过静脉内注射将中和抗il-11rα抗体或对照抗体给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11rα抗体处理的小鼠在皮肤组织中的纤维化反应减少。
14.5眼纤维化
小鼠在第0天接受小梁切除术以启动眼睛中的伤口愈合反应。
通过静脉内注射将中和抗il-11rα抗体或对照抗体给予不同组的小鼠，并且在眼组织中监测纤维化。
如用纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，用中和抗il-11rα抗体处理的小鼠在眼组织中的纤维化反应减少。
14.6其他组织
还在用于其他组织(例如肝、肾、肠)的纤维化小鼠模型中分析用中和抗il-11rα抗体治疗对纤维化的作用，并且也在与多器官(即全身性)纤维化有关的模型中进行分析。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与用对照抗体处理的小鼠相比，通过中和抗il-11rα抗体处理的小鼠纤维化反应减少。
实施例15：诱饵il-11受体
15.1诱饵il-11受体构建体
设计诱饵il-11受体分子并将其克隆到ptt5载体中以在293-6e细胞中重组表达。
简而言之，用于质粒的插入片段包含编码gp130的配体结合结构域d1、d2和d3的cdna，其与编码50个氨基酸或33个氨基酸的接头区域的cdna符合读框，然后是编码人il-11rα的配体结合结构域d2和d3的cdna，然后是编码flag标签的cdna。该cdna插入片段在5'末端掺入一个前导序列kozak序列，并包括一个5'ecori限制性酶切位点和一个3'hindiii限制性酶切位点(终止密码子的下游)，用于插入ptt5载体。
编码具有50个氨基酸或33个氨基酸序列的诱饵il-11受体分子的两种构建体分别称为诱饵il-11受体1(d11r1)和诱饵il-11受体2(d11r2)。
15.2诱饵il-11受体的表达和纯化
将构建体转染到293-6e细胞中用于重组表达和纯化。
使293-6e细胞在无血清freestyletm293表达培养基(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)中生长。在定轨摇床(vwrscientific，chester，pa)上，在37℃和5％co2下将细胞维持在锥形瓶(corninginc.，acton，ma)中。
转染前一天，将细胞以适当的密度接种在corning锥形瓶中。在转染当天，将dna和转染试剂以最佳比例混合，然后加入装有待转染细胞的烧瓶中。编码d11r1和d11r2的重组质粒在两天内瞬时转染到293-6e细胞悬液中。
在第6天收集细胞培养物上清液并用于纯化。简而言之，将细胞培养肉汤离心并过滤。向细胞培养上清液中加入0.5ml树脂并温育3-4小时以捕获靶蛋白。
用合适的缓冲液洗涤和洗脱后，使用兔抗flag多克隆ab(genscript，目录号a00170)通过sds-page和蛋白质印迹法(westernblot)对洗脱的级分进行分析，以确认flag标记的诱饵il-11受体分子的表达。
将纯化的物质定量并保存在-80℃。
实施例16：诱饵il-11受体的功能表征
16.1抑制人il-11介导的信号传导的能力
为了研究中和人il-11介导的信号传导的能力，在存在或不存在各种浓度的d11r1或d11r2的情况下，在存在tgfβ1(5ng/ml)的96孔板的孔中培养心脏心房成纤维细胞24小时。
tgfβ1促进il-11的表达，其继而驱动静止成纤维细胞向活化的αsma阳性成纤维细胞的转变。先前已经显示中和il-11阻止tgfβ1诱导的向活化的αsma阳性成纤维细胞的转变。
使用operettahigh-content成像系统以自动化高通量方式分析αsma的表达。
将d11r1或d11r2以终浓度为5ng/ml、50ng/ml和500ng/ml添加到用tgfβ1刺激的成纤维细胞培养物中，并且在24小时培养期结束时，测定培养物中αsma阳性成纤维细胞的百分比。
证明d11r1和d11r2都能以剂量依赖性方式中和人il-11介导的信号传导。
图32a和32b显示了实验的结果。证明d11r1和d11r2都能以剂量依赖性方式中和人il-11介导的信号传导。
d11r1和d11r2分子的ic50被确定为～1nm。
16.2抑制小鼠il-11介导的信号传导的能力
研究d11r1和d11r2抑制小鼠il-11介导的信号转导的能力，按照与上述16.1节中所述相同的程序，但使用小鼠皮肤成纤维细胞而不是人心房成纤维细胞。
与不存在诱饵il-11受体时的培养相比，在d11r1或d11r2的存在下，在24小时培养期结束时，观察到αsma阳性成纤维细胞比例相对降低，由此确定d11r1和d11r2被证明能够中和小鼠真皮成纤维细胞中的il-11/il-11r信号传导。
16.3诱饵il-11受体对il-11的亲和力分析
通过elisa试验分析d11r1和d11r2与人il-11结合的亲和力。
从genscript获得重组人il-11，并获得辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗flag抗体。corning96孔elisa板获自sigma。pierce3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)elisa底物试剂盒从lifetechnologies获得(0.4g/mltmb溶液，0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液)。牛血清白蛋白和硫酸获自sigma。洗涤缓冲液为包含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pbs-t)。tecaninfinite200pronanoquant用于测量吸光度。
如先前所述进行间接elisa以评估d11r1和d11r2在50％有效浓度(ec50)时的结合亲和力(unverdorbenetal.,(2016)mabs8,120-128)。elisa板用1μg/ml的重组人il-11包被，在4℃下过夜，剩余的结合位点用pbs中的2％bsa封闭。将d11r1和d11r1在含1％bsa的pbs中稀释，滴定以获得800、200、50、12.5、3.125、0.78、0.195和0.049ng/ml的工作浓度，并在室温下一式两份温育2小时。用hrp缀合的抗flag抗体进行抗原-诱饵il-11受体结合的检测。在与待检测抗体温育2小时后，加入100μltmb底物15分钟，并用100μl2mh2so4终止显色反应。在450nm处测量吸光度读数，并在570nm处进行参考波长校正。用graphpadprism软件对数据进行拟合，将诱饵il-11受体浓度进行对数转换，然后用不对称(五参数)对数剂量-反应曲线进行非线性回归分析以确定ec50值。
进行与上述相同的材料和程序以确定从genscript获得的重组鼠il-11的结合亲和力。
16.4在各种组织中抑制人il-11介导的信号传导的能力
基本上如部分18.1中所述，研究了诱饵il-11受体d11r1和d11r2中和从多种不同组织获得的成纤维细胞中的il-11介导的信号传导的能力，不同之处在于，将源自肝、肺、肾、眼、皮肤、胰腺、脾、肠、脑和骨髓的人成纤维细胞用于实验，代替心脏心房人成纤维细胞。
与不存在诱饵il-11受体时的培养相比，在诱饵il-11的存在下，在24小时培养期结束时，观察到αsma阳性成纤维细胞比例相对降低，由此确定d11r1和d11r2能够中和来源于各种不同组织的成纤维细胞中的信号传导。
实施例17：使用诱饵il-11受体抑制体内纤维化
诱饵il-11受体的治疗用途在各种不同组织的纤维化的小鼠模型中得到体内证实。
17.1心脏纤维化
将泵植入，并用angii(2mg/kg/天)处理小鼠28天。
诱饵il-11受体d11r1或d11r2通过静脉注射给予不同组的小鼠。在实验结束时，使用基于羟基脯氨酸的量热测定试剂盒评估小鼠的心房中胶原蛋白的含量，并通过qpcr分析标志物或纤维化col1a2、αsma(acta2)和纤连蛋白(fn1)的rna表达水平。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与未处理的/媒介物处理的对照组相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠在心脏组织中的纤维化反应减少。
17.2肾纤维化
建立肾纤维化小鼠模型，其中通过腹膜内注射含叶酸(180mg/kg)的赋形剂(0.3mnahco3)诱导纤维化；对照小鼠单独施用载体。
诱饵il-11受体d11r1或d11r2通过静脉注射给予不同组的小鼠。在第28天取出肾脏，称重并固定在10％中性缓冲的福尔马林中用于masson三色染色和sirius染色或速冻以进行胶原蛋白测定、rna和蛋白质研究。
使用trizol试剂(invitrogen)和qiagentissuelyzer方法从速冻的肾中提取总rna，然后用rneasy柱(qiagen)纯化。按照制造商的说明，使用iscripttmcdna合成试剂盒制备cdna，其中每个反应含有1μg总rna。用taqman(appliedbiosystems)或快速sybrgreen(qiagen)技术使用steponeplustm(appliedbiosystem)在40个循环上对样品(一式三份)进行定量rt-pcr基因表达分析。将表达数据标准化为gapdhmrna表达水平，并使用2-δδct方法计算倍数变化。快速冷冻的肾脏通过在浓度为50mg/ml的6mhcl中加热进行酸水解(95℃，20小时)。根据制造商的说明书，使用quickzymetotalcollagen测定试剂盒(quickzymebiosciences)，根据羟脯氨酸的比色检测对水解产物中的总胶原蛋白量进行定量。
如通过纤维化标志物表达减少所证明的，与未处理的/载体处理的对照相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠在肾组织中的纤维化反应降低。
17.3肺纤维化
在第0天通过气管内施用博来霉素来治疗小鼠以建立肺中的纤维化反应(肺纤维化)。
诱饵il-11受体d11r1或d11r2通过静脉注射给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
如纤维化标志物表达减少所证实的，与未处理的/媒介物处理的对照组相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠在肺组织中的纤维化反应降低。
17.4皮肤纤维化
在第0天通过皮下给予博来霉素处理小鼠以在皮肤中建立纤维化反应。
诱饵il-11受体d11r1或d11r2通过静脉注射给予不同组的小鼠。在第21天将小鼠处死，并分析纤维化标志物的差异。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与未处理的/载体处理的对照相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠在皮肤组织中纤维化反应减少。
17.5眼纤维化
小鼠接受上述实施例7.6中所述的小梁切除手术以启动眼内的伤口愈合反应。
诱饵il-11受体d11r1或d11r2通过静脉注射给予不同组的小鼠，并且在眼组织中监测纤维化。
如纤维化标志物表达减少所证明的，与未处理的/媒介物处理的对照相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠在眼组织中的纤维化反应减少。
17.6其他组织
还在其他组织(例如肝、肾、肠)的纤维化小鼠模型中分析用诱饵il-11受体d11r1或d11r2治疗纤维化的效果，并且也在与多器官(即全身性)纤维化模型中进行分析。
在用诱饵il-11受体处理的小鼠与未处理的小鼠或载体处理的对照之间测量和比较纤维化反应。如纤维化标志物表达减少所证明的，与未处理的/媒介物处理的对照相比，用诱饵il-11受体处理的小鼠纤维化反应减少。
实施例18：用于il-11应答的遗传生物标志物
除了测量il-11蛋白作为纤维化的潜在生物标志物之外，我们还开发了可以预测人体中il-11分泌状态的试验。该试验可用作il-11相关临床试验中的伴随诊断。
我们首先生成rna-seq数据(图16错误！未找到参比资源)，并使用基于由illumina(humanomniexpress24)提供的荧光探针杂交的snp阵列确定队列中69个种族匹配(中国)个体的基因型。
然后，我们进行全基因组连锁eqtl分析，以评估未刺激的成纤维细胞中和在tgfb1刺激(5ng/ml，24h)成纤维细胞中单核苷酸多态性(snp)是否影响il-11或il-11ra的rna转录水平。我们还测试了tgfβ1刺激(＝反应)后il-11的增加是否依赖于基因型。
首先，我们量化所有个体中il-11和il-11ra的读数，并使用deseq2方法的变异稳定(vst)方法转化这些计数(love等，genomebiology201415：550)。然后，我们考虑il-11和il-11ra在未刺激(vstunstim)和刺激(vststim)细胞中的表达。为了评估il-11的增加，我们还计算了δ，其表达式为vststim_vstunstim。我们在分析前使用协变量校正了表达值，所述协变量例如rna测序文库批次、rnarin质量评分、文库浓度、文库片段大小、年龄，性别。使用基质eqtl方法分析snp和转录物表达或δ表达对(andreya.shabalin，bioinformatics2012may15；28(10)：1353-1358)。
我们在未刺激细胞中没有观察到显著影响il-11表达的顺式或反式的变化。然而，我们检测到调节刺激的纤维化成纤维细胞中表达的远程snp。这些变体在纤维化中确实表达低水平il-11的个体与表达大量il-11的个体之间进行群体分层。我们还检测了预测il-11在tgfβ1反应中表达增加的局部和远端变体。这些变体可用于将个体分为高纤维化和低纤维化的反应者。
所鉴定的snp显示在图33至35中，伴随的数据显示在图36和37中。
序列表
<110>新加坡保健集团
新加坡国立大学
<120>纤维化治疗
<130>ric/fp7164916
<150>gb1522186.4
<151>2015-12-16
<160>77
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>2381
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
actgccgcggccctgctgctcagggcacatgcctcccctccccaggccgcggcccagctg60
accctcggggctcccccggcagcggacagggaagggttaaaggcccccggctccctgccc120
cctgccctggggaacccctggccctgtggggacatgaactgtgtttgccgcctggtcctg180
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cgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctc300
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cacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacag420
ctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcag480
tggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctg540
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ggtccccgaggaggaggggactggggtcccggattcttgggtctccaagaagtctgtcca1020
cagacttctgccctggctcttccccatctaggcctgggcaggaacatatattatttattt1080
aagcaattacttttcatgttggggtggggacggaggggaaagggaagcctgggtttttgt1140
acaaaaatgtgagaaacctttgtgagacagagaacagggaattaaatgtgtcatacatat1200
ccacttgagggcgatttgtctgagagctggggctggatgcttgggtaactggggcagggc1260
aggtggaggggagacctccattcaggtggaggtcccgagtgggcggggcagcgactggga1320
gatgggtcggtcacccagacagctctgtggaggcagggtctgagccttgcctggggcccc1380
gcactgcatagggccttttgtttgttttttgagatggagtctcgctctgttgcctaggct1440
ggagtgcagtgaggcaatctgaggtcactgcaacctccacctcccgggttcaagcaattc1500
tcctgcctcagcctcccgattagctgggatcacaggtgtgcaccaccatgcccagctaat1560
tatttatttcttttgtatttttagtagagacagggtttcaccatgttggccaggctggtt1620
tcgaactcctgacctcaggtgatcctcctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacag1680
gtgtgagccaccacacctgacccataggtcttcaataaatatttaatggaaggttccaca1740
agtcaccctgtgatcaacagtacccgtatgggacaaagctgcaaggtcaagatggttcat1800
tatggctgtgttcaccatagcaaactggaaacaatctagatatccaacagtgagggttaa1860
gcaacatggtgcatctgtggatagaacgccacccagccgcccggagcagggactgtcatt1920
cagggaggctaaggagagaggcttgcttgggatatagaaagatatcctgacattggccag1980
gcatggtggctcacgcctgtaatcctggcactttgggaggacgaagcgagtggatcactg2040
aagtccaagagttcgagaccggcctgcgagacatggcaaaaccctgtctcaaaaaagaaa2100
gaatgatgtcctgacatgaaacagcaggctacaaaaccactgcatgctgtgatcccaatt2160
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<210>2
<211>19
<212>dna
<213>homosapiens
<400>2
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<210>3
<211>19
<212>dna
<213>homosapiens
<400>3
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<210>4
<211>19
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<213>homosapiens
<400>4
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<210>5
<211>19
<212>dna
<213>homosapiens
<400>5
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<210>6
<211>1696
<212>dna
<213>homosapiens
<400>6
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gatgagcagcagctgctcagggctgagcagggtcctggtggccgtggctacagccctggt120
gtctgcctcctccccctgcccccaggcctggggccccccaggggtccagtatgggcagcc180
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