线粒体DNA的定量及确定胚胎质量的方法与流程
本专利申请要求于2015年10月16日提交的序列号为62/242,460的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本发明一般涉及生殖医学领域。更具体地说，本发明涉及用于确定胚胎植入并引发妊娠的潜力的无创检测方法和试剂盒。
背景技术：
选择具有较高植入潜力的胚胎是诸如体外受精(ivf)等辅助生殖技术中的主要挑战之一。ivf包括将卵子和精子在实验室中体外结合以形成胚胎。胚胎一旦形成，就会植入子宫内，胚胎在其中进一步发育。ivf技术面临的一个挑战是胚胎植入和妊娠的成功率低。因此，有必要更好地理解影响正确胚胎发育的机制，这反过来将允许开发用于鉴定具有高植入潜力的胚胎的工具，并提高妊娠成功率。通过选择具有最佳植入潜力的胚胎，成功体外受精程序的可能性将得以提高。考虑到ivf的费用，这可能会节省数千或数万美元，因为在成功妊娠之前可能不需要经常重复该程序。
因此，为了提高辅助生殖治疗的效率，迫切需要优质的活体胚胎鉴定方法。在转移到子宫之前对胚胎进行细胞遗传学异常的筛选使造成胚胎衰竭(即，非整倍体)的主要原因得以避免。然而，即使转移形态学上“完美”的胚胎(在活检细胞分析后额外考虑为染色体正常)，也不能保证妊娠成功开始(只有约三分之二的此类胚胎实际上产生了儿童)。很明显，额外的元素在胚胎的存活中起作用。重要的因素可能包括线粒体数量/容量以及对atp含量和/或代谢活性的附带影响[17]。
线粒体在胚胎发育中起着至关重要的作用。它们是能源生产的主要场所，并具有各种其他关键的细胞功能。线粒体参与调节多种必需的细胞过程，如细胞凋亡，氨基酸合成，钙稳态以及通过氧化磷酸化(oxphos)过程以atp的形式产生能量[1-5]。出于这个原因，线粒体被认为是主要的细胞动力室。它们与动物细胞中的其他细胞器相比是独特的，因为它们含有一个或多个其自身基因组的复制。尽管已知这种细胞器的重要性，但对植入前各个人类胚胎之间mtdna变异程度或mtdna相对数量与人类胚胎植入子宫的能力之间的关联知之甚少。
技术实现要素：
本发明部分基于意外的发现，即胚胎(例如人类胚胎)中mtdna的相对数量预示胚胎植入子宫的能力。因此，本文提供了用于确定胚胎的植入阈值并基于胚胎中发现的mtdna的相对数量确定胚胎(例如整倍体胚胎)的植入潜力的材料和方法。本文提供的材料和方法克服了与已知的线粒体dna(mtdna)定量分析的相关限制。本文所述的本发明方法表现出高灵敏度和特异性。
如本文所证明的，mtdna数量与胚胎植入潜力之间存在相关性。mtdna数量的评估可用于鉴定具有最高植入潜力的胚胎，从而导致健康妊娠。
在一个方面，本公开内容提供了用于确定胚胎中线粒体dna的相对数量的方法，其包括提供从胚胎获得的dna样品，确定dna样品中线粒体dna(mtdna)的量，确定dna样品中的参考dna，并将mtdna的量与参考dna的量进行比较以确定胚胎中mtdna的相对数量。胚胎中mtdna的相对数量提供了胚胎植入潜力的可靠指标。
在一个方面，本公开提供了用于确定胚胎的植入潜力的方法，该方法包括提供从胚胎获得的dna样品，确定dna样品中线粒体dna(mtdna)的量，确定dna样品中的参考dna的量，并将mtdna的量与参考dna的量进行比较以确定胚胎中mtdna的相对数量，其中胚胎中mtdna的相对数量表示胚胎的植入潜力。在一些实施方式中，胚胎是整倍体胚胎。
确定dna样品中mtdna的量和确定dna样品中参考dna的量可以使用定量pcr进行，例如实时pcr。
在本文公开的方法的一些实施例中，从植入后1、2、3、4、5、6或7天的胚胎获得dna样品。例如，dna样品从胚胎获得或在受精后1-3天、2-4天、3-5天、5-7天、1-7天或4-7天获得。
在一些实施例中，确定dna样品中mtdna的量包括通过使dna样品与包括靶向转录16s的序列的seqidno：2和3的引物对接触以产生16s扩增子，或者与包括靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的序列的seqidno：8和9的引物对接触以产生mt-nd4扩增子来扩增mtdna。该方法可以进一步包括通过使dna样品与包括靶向16s扩增子内的序列的seqidno：4的探针接触来检测16s扩增子，和/或通过使dna样品与包括靶向mt-nd4扩增子内的序列的seqidno：10的探针接触来检测mt-nd4扩增子。
在一些实施例中，确定dna样品中参考dna的量包括通过使dna样品与包括靶向alu序列的seqidno：5和6的引物对接触以产生alu扩增子来扩增参考dna。该方法可以进一步包括通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触来检测alu扩增子。
在一些实施例中，确定dna样品中参考dna的量包括通过使dna样品与靶向重复dna序列或多复制序列(例如l1重复序列或alu序列)的引物对接触来扩增参考dna以产生靶扩增子。该方法可以进一步包括通过使dna样品与靶向扩增子内的序列的探针接触以检测靶扩增子。本文所述实施例中靶向的重复dna序列或多复制序列在本领域中是已知的。在一些实施例中，确定dna样品中参考dna的量包括扩增至少一个dna(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)。
在一些方面，本文公开的方法包括将整倍体胚胎中的mtdna的相对数量与植入潜力阈值进行比较，其中胚胎中的mtdna的相对数量低于植入潜力阈值表示整倍体胚胎的有利植入潜力，并且胚胎中的mtdna的相对数量超过植入潜力阈值表示整倍体胚胎的不利植入潜力。
在一个方面，本公开内容提供了用于选择用于植入胚胎的方法，该方法包括确定胚胎样品中与胚胎中的参考核酸序列相比的线粒体dna的相对量，其中确定包括制备反应混合物，其包括i)来自胚胎的核酸样品；ii)指向第一线粒体dna序列的第一合成寡核甘酸引物对；以及iii)指向参考靶核酸序列的参考合成寡核甘酸引物对，扩增反应混合物以产生第一线粒体dna序列产物和参考靶核酸序列产物；与扩增的参考靶核酸序列产物的量比较以评估扩增的第一线粒体dna序列产物的量，以及当扩增的第一线粒体dna序列产物相对于扩增的参考靶核酸序列产物的测量量低于植入潜力阈值时，选择胚胎进行植入。参考核酸序列可以是染色体核酸序列。
反应混合物可以包括指向第二线粒体dna序列的第二合成寡核苷酸引物对。在一些实施例中，反应混合物可以包括指向第三线粒体dna序列的第三合成寡核苷酸引物对。在一些实施例中，反应混合物可以包括指向第四线粒体dna序列的第四合成寡核苷酸引物对。在一些实施例中，反应混合物可以包括5个或更多个(例如5个、6个、7个、8个、9个或10个等)合成寡核甘酸引物对，其指向5个或更多个(例如5个、6个、7个、8个、9个或10个等)线粒体dna序列。
在一些实施例中，该方法包括扩增反应混合物以产生第一线粒体dna序列产物、第二线粒体dna序列产物和参考染色体靶核酸序列产物；并且测量每种扩增产物的量；将扩增的第一线粒体dna序列产物和扩增的第二线粒体dna序列产物的测量量与扩增的参考染色体靶核酸序列产物进行比较；以及当扩增的第一线粒体dna序列产物和扩增的第二线粒体dna序列产物相对于扩增的参考染色体靶核酸序列产物的测量量低于植入潜力阈值时选择胚胎进行植入。在一些实施例中，反应混合物可以包括指向第三线粒体dna序列的第三合成寡核甘酸引物对。
在一个方面，本公开内容提供了用于选择胚胎进行植入的方法，该方法包括测量与参考核酸样品相比胚胎样品中的线粒体dna的相对量，其中测量包括制备反应混合物，其包括：i)来自胚胎的核酸样品；ii)指向第一线粒体dna序列的第一合成寡核苷酸引物对；iii)指向第二线粒体dna序列的第二合成寡核甘酸引物对；以及iv)指向参考染色体靶核酸序列的参考合成寡核甘酸引物对，扩增该反应混合物以产生第一线粒体dna序列产物、第二线粒体dna序列产物以及参参考染色体靶核酸序列产物；并测量每种扩增产物的量；将测量的第一线粒体dna序列产物和第二线粒体dna序列产物的量与参考染色体靶核酸序列产物的量进行比较；以及当所测量的第一线粒体dna序列产物和第二线粒体dna序列产物相对于参考染色体靶核酸序列产物的测量量低于植入潜力阈值时，选择胚胎进行植入。在一些实施例中，当第一线粒体dna序列产物和第二线粒体dna序列产物相对于参考染色体靶核酸序列产物的量高于植入潜力阈值时，胚胎被鉴定为不适合植入。
在一些实施例中，靶向mtdna(例如第一或第二)的合成寡核甘酸引物对指向选自以下组的线粒体dna序列：编码12srna的线粒体dna序列、编码16srna的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)的线粒体dna序列、线粒体dna序列nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)、编码nadh脱氢酶亚基2(mt-nd2)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基3(mt-nd3)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基4(mt-nd4)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基5(mt-nd5)的线粒体dna序列、编码细胞色素b的线粒体dna序列、编码线粒体细胞色素c氧化酶亚基1、2或3的线粒体dna序列，以及编码atp合成酶的线粒体dna序列。
在一些实施例中，第一合成寡核甘酸引物对指向编码16srrna基因序列的线粒体dna序列。例如，第一合成寡核甘酸引物对包括与seqidno：2的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物，以及与seqidno：3的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物。
在一些实施例中，第二合成寡核甘酸引物对指向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)基因序列的线粒体dna序列。例如，第二合成寡核甘酸引物对包括与seqidno：8的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物以及与seqidno：9的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物。
在一些实施例中，参考合成寡核甘酸引物对指向alu序列、l1序列、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)或β-肌动蛋白(actb)。在一些实施例中，参考合成寡核甘酸引物对指向alu序列。例如，参考合成寡核甘酸引物对包括与seqidno：5的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物以及与seqidno：6的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物。
在一些实施例中，扩增步骤使用定量或半定量rt-pcr方法进行。
在一个方面，本公开提供了用于确定胚胎植入潜力的试剂盒，该试剂盒包括指向第一线粒体dna序列的第一合成寡核苷酸引物对和指向参考基因序列dna的第二合成寡核苷酸引物对。参考基因序列可以是染色体基因序列。在一些实施例中，第一合成寡核苷酸引物对指向选自以下组的线粒体dna序列：编码12srna的线粒体dna序列、编码16srna的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)的线粒体dna序列、线粒体dna序列nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)、编码nadh脱氢酶亚基2(mt-nd2)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基3(mt-nd3)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基4(mt-nd4)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基5(mt-nd5)的线粒体dna序列、编码细胞色素b的线粒体dna序列、编码线粒体细胞色素c氧化酶亚基1、2或3的线粒体dna序列以及编码atp合成酶的线粒体dna序列。
在一些实施例中，试剂盒可以包括引物对，其包括靶向转录16s的序列的seqidno：2和3或靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的序列的seqidno：8和9以产生mt-nd4扩增子。试剂盒可进一步包括探针，其包括靶向16s扩增子内的序列的seqidno：4，和/或靶向mt-nd4扩增子内的序列的seqidno：10。
在一些实施例中，试剂盒包括具有靶向alu序列的seqidno：5和/或6的序列以产生alu扩增子的参考合成寡核甘酸。试剂盒可进一步包括靶向alu扩增子内的序列的包括seqidno：7的探针。
在一些实施例中，试剂盒包含指向alu序列、l1序列，3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)或β-肌动蛋白(actb)的参考合成寡核甘酸引物对。例如，参考合成寡核甘酸引物对可指向alu序列。
在一些实施例中，该试剂盒包括参考合成寡核甘酸，该参考合成寡核甘酸具有与seqidno：5的核酸序列具有至少70％序列同源性的序列以及与seqidno：6的核酸序列具有至少70％序列同源性的引物。试剂盒还可以包括指向alu序列的探针，其中探针包括seqidno：7。
在一些实施例中，该试剂盒包括脱氧核苷酸(dntp)、dna聚合酶(例如热稳定dna聚合酶，例如taqdna聚合酶或
在一个方面，本公开提供了用于确定胚胎的植入潜力阈值的方法，该方法包括确定从植入整倍体胚胎获得的一个或多个dna样品中的线粒体dna(mtdna)的量，确定一个或多个dna样品中的mtdna的量，并将从植入整倍体胚胎获得的mtdna的量与从非植入胚胎获得的mtdna的量进行比较，通过确定从植入整倍体胚胎的mtdna相对于从植入整倍体胚胎获得的mtdna的量的相对数量来识别植入潜力阈值。使用定量pcr如实时pcr来确定dna样品中mtdna的量。
在一些实施例中，确定第一dna样品中mtdna的量包括通过使dna样品与包括靶向转录16s的序列的seqidno：2和3的引物对接触以产生16s扩增子或与包括靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的序列的seqidno：8和9的引物对接触以产生mt-nd4扩增子，并且通过使dna样品与包括靶向alu序列的seqidno：5和6的引物对接触以扩增参考dna序列以产生alu扩增子。
在一些实施例中，该方法包括通过使dna样品与包括靶向16s扩增子内的序列的seqidno：4的探针接触和/或通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触以检测alu扩增子。
在一些实施例中，该方法包括通过使dna样品与包括靶向mt-nd4扩增子内的序列的seqidno：10的探针接触和/或通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触以检测alu扩增子。
在一个方面，本公开提供了用于确定胚胎中线粒体dna的相对数量的方法，其中该方法包括提供从胚胎获得的dna样品；确定dna样品中线粒体dna(mtdna)的量；确定dna样品中参考dna的量；并将mtdna的量与参考dna的量进行比较以确定胚胎中mtdna的相对数量。在所有方面的一些实施例中，胚胎中mtdna的相对数量表示胚胎的植入潜力。
在所有方面的一些实施例中，确定dna样品中mtdna的量和确定dna样品中参考dna的量包括定量pcr。在所有方面的一些实施例中，定量pcr包括实时pcr。
在所有方面的一些实施例中，从植入胚胎1、2、3、4、5、6或7天后，或受精1-3天、2-4天、3-5天、5-7天、1-7或4-7天后获得dna样品。在一些实施例中，胚胎是整倍体胚胎。
在一些实施例中，确定dna样品中mtdna的量包括通过使dna样品与包括靶向转录16s的序列的seqidno：2和3的引物对接触以产生16s扩增子或与包括靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的序列的seqidno：8和9的引物对接触以产生mt-nd4扩增子。在一些实施例中，该方法还包括通过使dna样品与包括靶向16s扩增子内的序列的seqidno：4的探针接触来检测16s扩增子。在一些实施例中，该方法进一步包括通过使dna样品与包括靶向mt-nd4扩增子内的序列的seqidno：10的探针接触来检测mt-nd4扩增子。
在一些实施例中，确定dna样品中参考dna的量包括通过使dna样品与包括靶向alu序列的seqidno：5和6的引物对接触以产生alu扩增子来扩增参考dna。
在一些实施例中，该方法还包括通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触来检测alu扩增子。
一些实施例还包括：将整倍体胚胎中mtdna的相对数量与植入潜力阈值进行比较；其中胚胎中低于植入潜力阈值的mtdna的相对数量表示整倍体胚胎的有利植入潜力，并且胚胎中超过植入潜力阈值的mtdna的相对数量表示整倍体胚胎的不利的植入潜力。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括确定从植入整倍体胚胎获得的一个或多个dna样品中线粒体dna(mtdna)的量；确定从非植入整倍体胚胎获得的一个或多个dna样品中mtdna的量；并通过将植入整倍体胚胎的mtdna的量与从非植入整倍体胚胎获得的mtdna的量进行比较来计算植入潜力阈值。
在一些实施例中，使用定量pcr确定dna样品中mtdna的量。在一些实施例中，定量pcr包括实时pcr。
在一些实施例中，确定第一dna样品中mtdna的量包括：通过使dna样品与包括靶向转录16s的序列的seqidno：2和3的引物对接触以产生16s扩增子或与包括靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的序列的seqidno：8和9的引物对接触以产生mt-nd4扩增子；通过使dna样品与包括靶向alu序列的seqidno：5和6的引物对接触以产生alu扩增子来扩增参考dna序列。
在一些实施例中，该方法还包括：通过使dna样品与包括靶向16s扩增子内的序列的seqidno：4的探针接触来检测16s扩增子；并通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触来检测alu扩增子。
在一些实施例中，该方法还包括：通过使dna样品与包括靶向mt-nd4扩增子内的序列的seqidno：10的探针接触来检测mt-nd4扩增子；并通过使dna样品与包括靶向alu扩增子内的序列的seqidno：7的探针接触来检测alu扩增子。
在一个方面，本公开提供了用于确定胚胎的植入潜力的方法，该方法包括确定与参考核酸样品相比胚胎样品中线粒体dna的相对数量，其中确定包括制备反应混合物，该反应混合物包括：i)来自胚胎的核酸样品；ii)指向第一线粒体dna序列的第一合成寡核甘酸引物对；以及iii)指向参考染色体靶核酸序列的参考合成寡核甘酸引物对；扩增该反应混合物以产生第一线粒体dna序列产物和参考染色体靶核酸序列产物；以及与扩增的参考染色体靶核酸序列产物的量相比较评估扩增的第一线粒体dna序列产物的量，其中，胚胎中mtdna的相对数量表示胚胎的植入潜力。
在所有方法的一些实施例中，确定线粒体dna的相对数量还包括：iv)指向第二线粒体dna序列的第二合成寡核甘酸引物对；并且扩增步骤还包括扩增反应混合物以产生第二线粒体dna序列产物；并且评估步骤进一步包括用扩增的参考染色体靶核酸序列产物的量评估扩增的第二线粒体dna序列产物的量，其中第一和第二线粒体dna序列产物的相对数量表示胚胎的植入潜力。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本公开内容的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和示例仅是说明性的而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献的全部内容通过引用并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，这些材料、方法和示例仅仅是说明性的而不是限制性的。
在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
图1示出了人类线粒体dna的染色体图。
图2示出了一系列图表，显示了mtdna数量、女性年龄和胚胎染色体构成之间的关系。a)在从302个囊胚中取出的te样品的定量实时pcr分析期间获得的数据证明，与提高女性年龄相关的mtdna水平在统计上显著增加(p＝0.003)。这种现象对于整倍体和非整倍体囊胚都是明显的。b)39个卵裂球的实时pcr分析表明，与生殖年龄较大的女性相比，生殖年龄较轻的女性的卵裂期胚胎含有更高的mtdna水平(p＝0.01)。c)te样品的实时pcr分析还表明，与整倍体囊胚(n＝203)相比，所有年龄的非整倍体囊胚(n＝99)含有显着(p＝0.025)更大量的mtdna。使用不成对的双尾t检验进行mtdna值的统计分析。
图3示出了通过染色体正常和异常囊胚的ngs分析的mtdna定量的图。从38个胚胎活检的te样品的ngs分析示出出现染色体错误时mtdna水平在统计上显着增加(p＝0.006)。
图4示出了与临床结果相关的染色体正常囊胚的mtdna含量的图。平均而言，能够建立临床妊娠的染色体正常囊胚与未能这样做的染色体正常囊胚相比显着降低了mtdna水平(p＝0.007)。
图5a-5c示出了与临床结果相关的囊胚mtdna数量阈值的一系列图。5a)通过回顾性分析来自已知结果的转移胚胎的te活检，建立了整倍体囊胚的mtdna量活性能力阈值。所有产生活性妊娠的囊胚都含有低于0.003值(红线)的mtdna数量，而高于此值的mtdna数量与未能实现正在进行的临床妊娠相关。5b)前瞻性盲法研究的结果。使用的mtdna阈值与回顾性研究(a)中建立的阈值相同。有效性得到证实，因为所有产生活性妊娠的囊胚都含有低于截止值(红线)的mtdna数量，并且没有超过此值的mtdna数量的囊胚实现了正在进行的临床妊娠。5c)23个整倍体te样品中mtdna水平的ngs分析。在set周期中转移相应的胚胎，其中21个已知临床结果。与实时pcr实验一样，7种植入胚胎的mtdna水平较低(注意：ngs分析的y轴比例不同，因此截止值不同)。
具体实施方式
本文提供了用于确定胚胎(例如整倍体胚胎)植入子宫(即，“植入潜力”)并引发妊娠的潜力的材料和方法。如本文所证明的，线粒体dna(mtdna)数量与胚胎植入潜力之间存在相关性。线粒体dna数量的评估可用于鉴定导致健康妊娠和活产能力最高的胚胎。因此，在一些方面，本公开内容提供了用于定量植入前(即胚胎期)，胚胎(例如受精卵或囊胚)中的线粒体dna(mtdna)以用于确定胚胎的植入潜力的组合物和方法。例如，本文提供了可用于定量pcr方法(例如实时pcr)以确定胚胎的植入潜力的引物和探针。
术语“胚胎”是指受精的卵母细胞或受精卵。所述受精可以在经典体外受精(civf)下或在胞质内的精子注射(icsi)方案下进行干预。
在一个方面，本公开提供了用于选择胚胎进行植入的方法，该方法包括：确定与胚胎样品中的参考核酸序列相比较的线粒体dna的量，并且当已确定的线粒体dna的量与胚胎中已确定的参考核酸样品的量相比为增加时，选择胚胎进行植入。
术语“增加的”、“增加”或“上调”在本文中全部用于通常意指统计上量的显着增加；为避免任何疑问，术语“增加的”或“增加”是指与参考水平相比增加至少约10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或者至少约40％、或者至少约50％、或者至少约60％、或者至少约70％、或者至少约80％、或者至少约90％或者与参考水平相比达到并包括100％增加或10-100％之间的任何增加，或者至少约0.5倍、或者至少约1.0倍、或者至少约1.2倍、或者至少约1.5倍、或者至少约2倍、或者至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或者与参考水平相比在1.0倍和10倍或更大之间的任何增加。在一些实施例中，参考水平是胚胎样品中参考核酸序列的水平。
术语“降低”、“降低的”、“减少的”，“减少”或“下调”在本文中通常全部用于表示统计上量的显着减少。然而，为了避免疑义，“减少的”、“减少”、“下调”、“降低的”或“降低”意味着与参考水平相比降低至少约10％，例如降低至少约20％、或者至少约30％、或者至少约40％、或者至少约50％、或者至少约60％、或者至少约70％、或者至少约80％、或至少约90％或与参考水平相比达到并包括100％降低(即与参考样品相比不存在的水平)或10-100％之间的任何降低，或者至少约0.5倍、或者至少约1.0倍、或者至少约1.2倍、或者至少约1.5倍、或者至少约2倍、或者至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的降低，或者与参考水平相比在1.0倍和10倍或更大之间的任何降低。在一些实施例中，参考水平是胚胎样品中参考核酸序列的水平。
本领域技术人员将会理解，可以对本文所述的任何核酸分子(例如引物和/或探针)进行微小改变，并且变体核酸分子可以用于本文提供的方法中，例如与本文描述的核酸分子(例如seqidno：2-10)具有至少或约90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性的核酸分子。
本领域技术人员将认识到，本文所述的核酸分子(例如引物和/或探针)可通过分子生物学最新方案(1999ausubeletal.(editors)约翰威利父子公司.：霍博肯)所述的标准分子生物学技术或通过化学合成或通过核酸类似物获得。
线粒体dna
线粒体dna(mtdna)是环状的，由16.6kb的双链dna组成。(图1)由该dna分子编码的基因在细胞代谢中具有直接作用，其产生了几个在电子传递链(etc)中起关键作用的复合物的亚基[6]。由线粒体基因组编码的复合物与其他etc组分一起位于线粒体内膜中，并且对细胞中atp的产生至关重要。此外，mtdna编码细胞器转录和翻译机制的一些组成部分，包括22个trna和2个rrna，其余部分由核基因组编码[6]。已经表明，细胞能够重新分布其线粒体以取代受损的细胞器，并适应细胞内能量需求的变化[7]。
哺乳动物细胞的线粒体含量从几百到几千不等，由细胞的体积和能量需求决定。人类成熟卵母细胞是线粒体和mtdna含量最高的细胞类型[1]。卵母细胞线粒体复制始于胎儿发育期间，含有约200个线粒体的卵原细胞[8]。复制与成熟同步进行，因此就在受精前，在中期ii处停滞的卵母细胞含有大约100,000个线粒体和50,000至550,000个mtdna的复制[1，9-13]。
哺乳动物胚胎仅在受精前从卵母细胞中发现的群体中继承线粒体(并因此mtdna)。来自人类卵裂期胚胎的mtdna定量数据表明，在植入前发育的前三天内数量保持稳定[1，12-16]。mtdna的显着复制直到胚胎经历了第一次细胞分化为滋养外胚层(te)和内细胞团并且已经变成囊胚之后才开始被认为是后动的[3，8]。
植入前的发育是一个动态和能量需求的过程，在这个过程中线粒体功能是至关重要的。早期胚胎需要足够的能量水平，以便他们可以成功地通过每个细胞分裂。现有数据表明，在这些早期阶段，正确的卵母细胞线粒体功能和mtdna基因表达是至关重要的。具体而言，人类卵母细胞的atp含量，胚胎的发育潜力与ivf周期的结果之间存在关联[17]。
由于线粒体功能在生命的最初几天内至关重要，本发明人对已经成功到达囊胚发育阶段的人类植入前胚胎中的mtdna进行了彻底调查。具体而言，发明人检查了人类囊胚mtdna含量、女性患者年龄、胚胎染色体状态、存活力和植入潜力之间的关系。此外，我们试图揭示mtdna复制首次上调的植入前发育阶段，并具有潜力以增加单个细胞的mtdna含量。除了线粒体dna的相对定量，还对线粒体基因组进行了详细分析，寻找突变、缺失和多态性。
在一些实施例中，胚胎是整倍体胚胎。如本文所示，可以使用从植入和非植入整倍体囊胚获得的mtdna的定量来建立阈值。该阈值是允许临床医生确定整倍体胚胎的植入潜力的值。例如，低于阈值的mtdna量表示胚胎有利的植入潜力，而超过阈值的mtdna量表明胚胎不利的植入潜力。
在相对定量中，检测靶dna(例如，mtdna)的量并将其标准化为单个样品中参考dna的量以确定靶dna的相对数量。分析mtdna的相对数量允许确定阈值以确定胚胎植入的潜力(即“植入潜力”)并引发妊娠。如本文所述，可通过许多手段确定mtdna的相对数量，该手段包括但不限于实时pcr或下一代测序(ngs)。
该阈值可以通过分析已知妊娠结果的样品中存在的线粒体数量来确定。在一些实施例中，分析与具有阳性和阴性妊娠结果的胚胎相关的一个或多个样品以确定阈值。可以使用标准曲线和绝对定量，但不是必需的。本领域技术人员将理解，用于确定胚胎植入潜力的阈值可能需要基于许多变量进行优化，包括但不限于测定灵敏度、执行测定的技术人员和/或参考dna的数量/质量。
在一些实施例中，通过实时pcr确定mtdna的相对数量，例如定量pcr，并且确定植入的阈值相对mtdna的量是0.003。具有相对mtdna量小于约0.003的植入前胚胎预计将被植入。例如，预测植入的植入前胚胎可以具有约0.0029、约0.0025、约0.002、约0.0015、约0.001、约0.0008、约0.0005、约0.0003、约0.0002、约0.0001、约0.00008或约0.00008、约0.00005、约0.00004、约0.00003或约0.00002的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有小于0.002的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有小于0.001的相对mtdna量。
具有大于约0.003的相对mtdna量的植入前胚胎不能被植入。例如，预测不植入的植入前胚胎可具有约0.0031、约0.0035、约0.004、约0.0045、约0.005、约0.006、约0.007、约0.008、约0.009、约0.01或约0.02的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有大于约0.004的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有大于约0.005的相对mtdna量。
在一些实施例中，由ngs确定一定数量的mtdna，并且确定植入的阈值相对mtdna量为0.07。具有相对mtdna量小于约0.07的植入前胚胎预计被植入。例如，预测植入的植入前胚胎可具有约0.068、约0.065、约0.0625、约0.06、约0.055、约0.05、约0.045、约0.04、约0.035、约0.03、约0.025或约0.02的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有小于0.06的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有小于0.05的相对mtdna量。
具有大于约0.07的相对mtdna量的植入前胚胎不能被植入。例如，预测不植入的植入前胚胎可以具有约0.075、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.18、约0.20、约0.22、约0.25、约0.28、约0.30或约0.32的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有大于0.08的相对mtdna量。在一些实施例中，预测植入的植入前胚胎具有大于0.10的相对mtdna量。
另外，根据用于检查胚胎的技术(例如使用下一代测序的定数量阈值可能具有与从定量pcr获得的数值不同的数值)，分配给阈值本身的数值将会不同。
靶序列的扩增
根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、重组dna、免疫学、细胞生物学和其他相关技术。参见例如：sambrooketal.，(2001)分子克隆：实验室手册.第3版.冷泉港实验室出版社：冷泉港，n.y.；sambrooketal.，(1989)分子克隆：实验室手册.第2版.冷泉港实验室出版社：冷泉港，n.y.；ausubeletal.，eds.(2005)分子生物学最新方案.约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j；bonifacinoetal.，eds.(2005)细胞生物学最新方案.约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j.；coliganetal.，eds.(2005)免疫学最新方案，约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j.；coicoetal.，eds.(2005)微生物学最新方案，约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j.；coliganetal.，eds.(2005)蛋白质科学最新方案，约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j.；ennaetal.，eds.(2005)药理学最新方案，约翰威利父子公司.：霍博肯，n.j.；hamesetal.，eds.(1999)蛋白质表达：一种实用的方法.牛津大学出版社：牛津；freshney(2000)动物细胞培养：基本技术手册.第4版.wiley-liss等。上面列出的最新协议每年更新多次。
扩增核酸靶序列(例如，mtdna或参考dna)的方法在本领域中是公知的，并且包括例如聚合酶链式反应(pcr)。在一些实施例中，靶序列的扩增包括实时pcr。实时pcr可以是标准实时pcr或快速实时pcr。技术人员将会理解，为了适应快速实时pcr，可能需要对例如仪器(例如，以执行更快的温度变化)、酶(例如，维持准确度的更快的酶)和/或循环参数(例如，缩短或甚至组合pcr步骤)进行修改。
实时pcr包括至少三个步骤的热循环(即重复加热和冷却的循环)：分离dna双螺旋的两条链的第一变性步骤，允许引物结合dna的第二退火步骤，以及促进dna聚合酶(例如热稳定dna聚合酶)进行dna合成的第三延伸步骤。在一些情况下，可以包括第四步骤和中等高温(例如80℃)，在此期间可以测量荧光。
第一步骤包括打破将双链dna保持在一起的氢键的高温。第一步骤可以包括约95℃的温度。第一步骤可以包括约10秒到1分钟的时间。例如，第一步骤可以持续约15秒。在一些实施例中，第一步骤包括95℃的温度并持续15秒。
第二步骤包括较低的温度，以便pcr引物可以与dna靶序列结合。第二步骤可以包括约50-60℃的温度。例如，温度可以是约50℃、约52℃、约54℃、约55℃、约57℃、约59℃或约60℃。第二步骤可以持续约15秒、约30秒或约60秒。在一些实施例中，第二步骤包括55℃的温度并持续15秒。
第三步骤包括允许dna聚合酶(例如热稳定的dna聚合酶)沿着dna靶序列延伸引物的中间温度。第三步骤可以包括约58-72℃的温度。例如，温度可以是约58℃、约62℃、约65℃、约68℃、约70℃或约72℃。第三步骤可以持续约45秒、约60秒或约90秒。在一些实施例中，第三步骤包括60℃的温度并持续1分钟。
通常重复这些步骤(即循环)25-50次。如本领域技术人员将理解的那样，pcr扩增有三个阶段：1)指数阶段，在该阶段期间试剂是新鲜且可用的，并且在每个循环中发生产物的精确加倍(假定100％反应效率)；2)线性阶段，在该阶段期间，一些试剂由于扩增而消耗，并且pcr产物在每个循环不再加倍；以及3)平稳阶段，在该阶段期间反应停止。在一些实施例中，循环次数不超过指数阶段。例如，热循环步骤可以重复25次、30次、32次、35次、38次、40次、45次或50次。在一些实施例中，热循环步骤重复35次。
实时pcr热循环之前可以在高温(例如约95℃)下延长保持以活化在室温下无活性的热稳定dna聚合酶。包括这种扩展保持的循环设置通常被称为“热后动”循环。延长的保持可以是约20秒至约10分钟。如本领域技术人员将理解的，各种热稳定dna聚合酶需要不同的活化时间。例如，一些热稳定dna聚合酶(如taqdna聚合酶)需要在95℃下进行10分钟的活化，其中其他热稳定dna聚合酶(例如
本领域技术人员将理解的，热循环参数可能需要基于许多因素进行调节。例如，最佳引物退火温度可以取决于碱基组成(即，a、t、g和c核苷酸的比例)、引物浓度和离子反应环境。例如，延伸时间可能取决于扩增子长度(即延伸时间通常需要约1分钟/kb)。
在一些实施例中，实时pcr包括在约95℃下保持延伸10分钟以及热循环，其包括在约95℃下进行约15秒的第一步骤、在约50-60℃下进行约15秒的第二步骤、在约68-72℃下进行约1分钟的第三步骤，其中第一、第二和第三步骤循环约35次。
pcr包括含有与mtdna序列区域互补的序列的至少两个引物(即“引物对”或“引物组”)。引物是可用于后动较长核酸序列合成的短合成寡核苷酸分子。引物可以通过核酸杂交与互补的靶dna序列(例如，mtdna)退火以在引物和靶dna序列之间形成杂交体，然后引物通过dna聚合酶沿着靶dna序列延伸。可以使用位于靶dna序列侧翼的一组至少两个引物(例如，正向引物和反向引物)来扩增靶dna序列以产生扩增产物(也称为扩增子)。可以与所公开的方法一起使用的引物可以是约10-50个核苷酸，例如约12-50个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸、12-40个核苷酸、18-35个核苷酸、18-30个核苷酸、19至30个核苷酸、19至29个核苷酸或20至29个核苷酸。
靶序列可以是一个或多个mtdna序列。pcr引物可以是任何旨在靶向任何mtdna的部分的引物。靶mtdna可以是例如nc_012920(seqidno：1)中所示的人类mtdna。示出人类mtdna靶位置的示意图在图1中列出。例如，pcr引物可以靶向但不限于编码12srna的线粒体dna序列、编码16srna的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)的线粒体dna序列、线粒体dna序列nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)、编码nadh脱氢酶亚基2(mt-nd2)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基3(mt-nd3)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基4(mt-nd4)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基5(mt-nd5)的线粒体dna序列、编码细胞色素b的线粒体dna序列、编码线粒体细胞色素c氧化酶亚基1、2或3的线粒体dna序列、编码atp合成酶的线粒体dna序列。用于设计pcr引物的工具和策略在本领域中是已知的。
在一些实施例中，可以将pcr引物设计成靶向编码16srna的线粒体dna序列(例如，人类16s序列)，如在fregeletal.(2011法医科学国际遗传学补充系列3(1)：e303-304)所述。例如，靶向转录16srna的一部分人类mtdna的引物对可以包括包含序列ggtgatagctggttgtccaagat(seqidno：2)的正向引物和包含序列cctactatgggtgttaaattttttactctctc(seqidno：3)的反向引物。
在一些实施例中，可以将pcr引物设计为靶向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)(例如人类mt-nd4序列)的线粒体dna序列。例如，靶向编码mt-nd4的人类mtdna的一部分的引物对可以包括包含序列ctgttccccaaccttttcct(seqidno：8)的正向引物，以及包含序列ccatgattgtgaggggtagg(seqidno：9)的反向引物。
在一些实施例中，可以将pcr引物设计成靶向编码nadh脱氢酶亚基5(nadh5)的线粒体dna序列(例如，人类nadh5序列)，如kavlicketal.(美国9,080,205；发行于2015年7月14日)中描述的。
靶序列可以是染色体dna。相对定量是基于比较样品中靶dna(例如，mtdna)的量与样品中参考dna(例如染色体dna)的量。参考dna可以是任何染色体dna(例如持家基因、多复制基因或重复序列基因)。例如，参考dna可以是alu序列、l1序列、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)或β-肌动蛋白(actb)、白蛋白，β-球蛋白或18srrna。在一些实施例中，参考dna可以是人类核基因组中的多复制序列(例如alu或l1)。在一些实施例中，预期使用多个单独的dna片段作为参考对照，将它们的结果总计在一起以产生单一参考值。然而，实际上基因组中的任何dna序列组合都可用于此目的，因此尝试指定它们毫无意义。指向参考dna序列的引物和/或探针可以被设计和/或合成。或者，可以商业获得指向参考dna序列的引物和/或探针。
在一些实施例中，可以将pcr引物设计为靶向alu序列(例如人类alu序列)作为参考dna。例如，靶向人类alu序列的引物对可以包括包含序列gtcaggagatcgagaccatcct(seqidno：5)的正向引物以及包含序列agtggcgcaatctcggc(seqidno：6)的反向引物。
mtdna的pcr扩增可以是单重pcr(靶mtdna的扩增和参考dna的扩增在独立反应中进行；例如在分开的管或孔中)或双重pcr(靶mtdna的扩增和参考dna的扩增在相同反应中进行；例如在相同的管或孔中)。
本文描述的任何pcr试剂可以作为反应混合物一起提供。例如，反应混合物可以包括引物对、脱氧核苷酸(dntps；有或没有dutp)、缓冲液(例如tris-edta(te)缓冲液)、dna聚合酶(例如热稳定dna聚合酶，诸如taqdna聚合酶或
扩增的靶序列的检测
定量pcr(例如实时pcr)包括检测扩增子。可以与所公开的方法一起使用的扩增子可以是大约70-200个核苷酸，例如大约80-180个核苷酸、90-170个核苷酸、100-160个核苷酸或110-150个核苷酸。扩增子可以通过任何合适的手段检测(例如荧光)。例如，靶序列的扩增可以产生荧光，并且扩增子的检测可以包括荧光的检测。实时pcr中荧光的产生可以包括，例如插入任何双链dna的非特异性荧光染料或由用荧光报告染料标记的寡核苷酸组成的序列特异性探针，只有在探针与其互补序列杂交后才允许检测。
在实时pcr包括插入任何双链dna的非特异性荧光染料的情况下，可以使用任何插入dna的荧光染料。插入dna的荧光染料的非限制性示例包括
在实时pcr包括荧光标记探针的情况下，可以使用任何合适的探针。探针是与扩增子的区域互补或基本上互补并可用于检测或捕获扩增子的寡核苷酸。例如，适用于基于扩增的检测方法的探针可以根据位于扩增子内的任何序列设计。可以与所公开的方法一起使用的探针可以是约10-50个核苷酸，例如约12-50个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸、12-40个核苷酸、18-35个核苷酸、18-30个核苷酸、19-30个核苷酸、19-29个核苷酸或20-29个核苷酸。
在一些实施例中，探针可以靶向由靶向部分转录16srna的mtdna(例如人类mtdna16s)的引物对产生的扩增子。例如，靶向人类mtdna16s扩增子的探针可以包括序列aatttaactgttagtccaaagag(seqidno：4)。
在一些实施例中，探针可以靶向由靶向部分编码mt-nd4的mtdna(例如编码mt-nd4的人类mtdna)的引物对产生的扩增子。例如，靶向人类mt-nd4扩增子的探针可以包括序列gaccccctaacaaccccc(seqidno：10)。
在一些实施例中，可以设计pcr引物以靶向编码nadh脱氢酶亚基5(nadh5)的mtdna部分(例如人类nadh5序列)。
在一些实施例中，探针可以靶向由靶向参考dna(例如人类alu序列)的引物对产生的扩增子。例如，靶向人类alu扩增子的探针可以包括序列agctactcgggaggctgaggcagga(seqidno：7)。
在实时pcr包括荧光标记探针的情况下，可以使用任何合适的荧光报告染料。荧光报告染料的非限制性示例包括nedtm、花菁素(例如cytm2、cytm3、cytm3.5、cytm5、cytm5.5以及cytm7)、荧光素(例如异硫氰酸荧光素(fitc)以及fam亚磷酰胺)、罗丹明(例如羧甲基四甲基罗丹明(tamratm)、四甲基罗丹明(tmr)，四甲基罗丹明(tritc)、磺酰罗丹明101、
在一些情况下，荧光标记的探针在一端包括荧光报告染料而在另一端包括猝灭分子。猝灭分子与荧光报告染料的紧密接近允许猝灭分子消除或减少荧光报告染料的发射(例如通过吸收激发能量)。dna聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性破坏物理报告-猝灭的接近性并因此允许荧光报告染料的非猝灭发射。淬火分子的非限制性示例包括非荧光猝灭剂(nfq)、二甲基氨基偶氮苯磺酸(dabsyl)、黑洞淬灭剂、qx1猝灭剂、爱荷华黑fq、爱荷华黑rq、ir染色qc-1。如本领域技术人员将理解的，猝灭分子通常在荧光发射的特定范围上最有效。例如，dabsyl吸收绿色光谱并经常与荧光素一起使用。
探针可以包括槽沟结合剂(mgb)部分。当探针与扩增子退火时，mgb部分增加形成的双链体的稳定性。mgb部分可以与探针的一端缀合。在探针是荧光标记探针的情况下，mgb部分可以位于探针和荧光标记之间或猝灭剂或mgb部分可以位于荧光标记或猝灭剂的末端。
在一些实施例中，探针是荧光标记的探针(例如，包括序列aatttaactgttagtccaaagag(seqidno：4))，其在一端包括fam荧光报告染料并且在相对端包括mbg部分和nfq猝灭分子。
在一些实施例中，探针是荧光标记的探针(例如，包括序列gaccccctaacaaccccc(seqidno：10))，其在一端包括ned荧光报告染料而在另一端包括nfq猝灭分子。
在一些实施例中，探针是荧光标记的探针(例如，包括序列agctactcgggaggctgaggcagga(seqidno：7))，其在一端包括fam荧光报告染料并且在相反端包括mbg部分和nfq猝灭分子。
如本文所证明的，可以使用mtdna量来确定囊胚的植入潜力。在阈值量的mtdna之上从未观察到囊胚植入(例如整倍体囊胚)。无论其他考虑事项如胚胎形态或患者接受治疗的临床情况如何，这一临界值仍然有效。
靶序列的定量
如本文所用，“确定dna的量”是指定量样品中存在的核酸的量。
在这里的一些方法中，希望检测和定量样品中存在的dna。dna的检测和定量可以通过本领域众所周知的多种方法中的任何一种来实现。使用mtdna或参考dna序列的已知序列，可以设计特异性探针和引物以适用于下文所述的检测方法。
定量核酸靶序列(例如mtdna或染色体dna)的方法是本领域公知的，包括例如实时聚合酶链式反应(pcr)、下一代测序(ngs)、分光光度的定量以及在dna染料存在下的uv荧光。本公开不限于特定的定量方法。在一些实施例中，mtdna的定量包括实时pcr。
实时pcr可以被定量使用(定量实时pcr)、半定量使用(半定量实时pcr)或定性使用(定性实时pcr)。如本领域所理解的，pcr包括几个数量级的dna片段的单一复制或几个复制的扩增。在一些实施例中，实时pcr是定量的。
在相对定量中，相对于同一样品中参考dna(例如染色体dna)的量，分析样品中靶序列(例如，mtdna)的量。如本文所述，可通过许多手段确定mtdna的相对数量，所述手段包括但不限于实时pcr或下一代测序(ngs)。
在一些实施例中，通过实时pcr确定相对数量的mtdna。使用实时pcr定量靶dna的方法包括例如比较ct(δct)方法(相对定量)、相对标准曲线方法(相对定量)以及标准曲线方法(绝对定量)。
可以通过例如由livik等人(2001方法25：402-408)所述的等式2-δδct计算mtdna的相对数量。实时pcr着眼于指数阶段计算每个样品的检测阈值(即，反应达到高于背景的荧光强度时的检测水平)和阈值周期(ct；即样品越过检测阈值的周期数)。
δct值描述样品中靶mtdna的ct值与参考dna的ct值(δct＝靶dnact-参考dnact)之间的差异，并且用于归一化在样品中使用的模板的量。例如，δct可以是(mtdna16sct)-(aluct)或δct可以是(mt-nd4ct)-(aluct)。可以为多个样品确定δct值；例如样品胚胎、植入胚胎和/或非植入胚胎。在一些实施例中，可使用从单一样品的多次(例如，两次、三次等)运行获得的平均ct来计算δct值。
δδct值描述第一样品(例如，样品胚胎)中mtdna的平均δct值与第二样品(例如，植入胚胎或非植入胚胎)中mtdna的平均δct值之间的差异。例如，δδct可以是mtdna植入δct-mtdna非植入δct。
植入胚胎中mtdna的相对数量和非植入胚胎中mtdna的相对数量被用于确定阈值，其允许临床医生确定胚胎的植入潜力。
使用方法
本文提供的方法包括用于确定植入阈值的方法、用于选择胚胎进行植入的方法以及用于确定胚胎(例如整倍体胚胎)的植入潜力的方法。
用于确定植入阈值的方法包括例如提供从植入胚胎获得的第一dna样品和确定第一dna样品中线粒体dna(mtdna)的量，提供从非植入胚胎获得的第二dna样品和确定第二dna样品中mtdna的量。用于确定植入阈值的方法还包括将第一dna样品中的mtdna的量与第二样品中的mtdna的量进行比较以确定植入潜力阈值。
例如，可以将第一dna样品(例如，来自植入胚胎的dna样品)中的mtdna的相对数量与第二dna样品(例如，来自非植入胚胎的dna样品)中的mtdna的量进行比较。对植入胚胎与非植入胚胎中mtdna的相对数量的分析允许建立用于确定胚胎植入的潜力(即“植入潜力”)并引发妊娠的阈值。
确定胚胎植入潜力的方法包括例如提供从胚胎获得的dna样品，确定dna样品中线粒体dna(mtdna)的量，并确定dna样品中参考dna的量。用于确定胚胎植入潜力的方法还包括将mtdna的量与参考dna的量进行比较以确定胚胎中mtdna的相对数量，其中胚胎中的mtdna的相对数量表示胚胎的植入潜力。
例如，可以将dna样品(例如来自样品胚胎的dna样品)中的mtdna的量与相同dna样品中的参考dna的相对数量进行比较以建立mtdna的相对数量。对mtdna的相对数量的分析允许临床医生确定胚胎植入的潜力(即“植入潜力”)并引发妊娠。在一些情况下，可以将dna样品(例如来自样品胚胎的dna样品)中mtdna的相对数量与确定胚胎植入潜力的建立阈值进行比较。例如，低于确定胚胎植入潜力的阈值的第一dna样品(例如，来自植入胚胎的dna样品)中的mtdna的相对数量表示胚胎有利的植入潜力(即，胚胎很可能会植入)。例如，超过用于确定胚胎植入潜力的阈值的第一dna样品(例如，来自植入胚胎的dna样品)中的mtdna的相对数量表示胚胎不利的植入潜力(即，胚胎不会植入)。
本文提供的方法可以包括提供从胚胎(例如，样品胚胎、植入胚胎或非植入胚胎)获得的dna样品。样品胚胎是具有未知植入潜力的胚胎(例如，准备用于体外受精的胚胎)。在一些方面，本文描述的方法是申请人用于研究或临床测定，以及胚胎干细胞系的产生。从胚胎获得的dna样品可以是从任何胚胎来源(例如，组织、细胞、培养胚胎的培养基、来自胚胎囊胚腔内的液体)获得的dna。从胚胎获得的dna样品包含来自胚胎的mtdna和染色体dna。从胚胎获得的dna样品可以从植入前胚胎来源获得。在一些实施例中，从植入前胚胎获得的dna样品从受精后1、2、3、4、5、6或7天或受精后1-2天、1-3天、3-5天或4-7或1-7天获得。dna的植入前胚胎来源包括例如滋养外胚层(te)、囊胚、卵裂球、培养胚胎的培养基、胚胎囊胚腔内的液体。在一些实施例中，从te样品获得dna样品。可以扩增从胚胎获得的dna样品(例如，在对mtdna进行定量之前)。扩增dna样品的方法包括，例如全基因组扩增方法，其包括但不限于多重置换扩增(mda)、多重退火以及基于循环的扩增(malbac)、基于接头连接pcr(例如sureplex、picoplex、genomeplex)、简并寡核苷酸引物pcr(dop-pcr)、多重pcr的方法。
胚胎(以及从胚胎获得的dna样品)可以是任何哺乳动物胚胎。哺乳动物的非限制性示例包括，例如人类、非人灵长类动物(例如猿和猴)、牛、马、绵羊、大鼠、小鼠、猪和山羊。在一些实施例中，样品可以从人类胚胎获得。
本文提供的方法可以包括确定从如本文所述的胚胎获得的dna样品中mtdna的量。从胚胎获得的dna样品中mtdna的量可以通过定量pcr(例如实时pcr)来确定。例如，确定从胚胎获得的dna样品中mtdna的量可以包括使用引物(例如seqidno：2-3)和任选地探针(例如，seqidno：4)确定转录16srna的mtdna序列的量。例如，确定从胚胎获得的dna样品中mtdna的量可以包括使用引物(例如seqidno：8-9)和任选地探针(例如，seqidno：10)确定编码mt-nd4的mtdna序列的量。
本文提供的方法可以包括确定从如本文所述的胚胎获得的dna样品中参考dna的量。从胚胎获得的dna样品中的参考dna的量可以通过定量pcr(例如实时pcr)来确定。例如，确定从胚胎获得的dna样品中参考dna的量可以包括使用引物和任选的探针确定参考dna中序列的量，例如使用引物，例如使用本文所述的引物(例如，seqidno：5-6)和任选的探针(例如seqidno：7)确定alu序列的量。
试剂盒
本文还提供了用于执行本文所述方法的试剂盒。在一些方面，本文提供的试剂盒包括指向第一线粒体dna序列的第一合成寡核甘酸引物对和指向参考染色体基因序列dna的第二合成寡核甘酸引物对。
第一合成寡核甘酸引物对可以指向本文所述的线粒体dna序列(例如编码12srna的线粒体dna序列、编码16srna的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基1(mt-ndl)的线粒体dna序列、线粒体dna序列nadh脱氢酶亚基1(mt-nd1)、编码nadh脱氢酶亚基2(mt-nd2)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基3(mt-nd3)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基4(mt-nd4)的线粒体dna序列、编码nadh脱氢酶亚基5(mt-nd5)的线粒体dna序列、编码编码细胞色素b的线粒体dna序列、编码线粒体细胞色素c氧化酶亚基1、2或3的线粒体dna序列、编码atp合酶的线粒体dna序列)。在一些实施例中，该试剂盒包括指向编码16srna基因序列的线粒体dna序列的合成寡核甘酸和任选地指向编码16srna的线粒体dna序列的探针。在一些实施例中，该试剂盒包括指向编码nadh-泛醌氧化还原酶链4(mt-nd4)的线粒体dna序列的合成寡核苷酸引物对，以及任选地指向编码mt-nd4的线粒体dna序列的探针。
参考合成寡核苷酸引物对可指向alu序列、l1序列、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)或β-肌动蛋白(actb)、白蛋白、β-球蛋白或18srrna。在一些实施例中，参考dna可以是人类核基因组中的多复制序列(例如alu或l1)。在一些实施例中，该试剂盒包括指向alu序列的合成寡核苷酸引物对，以及任选地指向alu序列的探针。
本发明的试剂盒可以呈现多种形式。通常，试剂盒将包括适用于确定样品中dna的存在或定量的试剂。任选地，试剂盒可以包含一个或多个对照样品。此外，在一些情况下，试剂盒将包括提供参考(例如，预定值)的书面信息(标记)，其中在胚胎中的核酸水平与参考(预定值)之间的比较表示临床状态。
在一些情况下，试剂盒包括用于比较dna水平或事件的参考(例如，预测模型)的软件。通常，软件将以计算机可读格式提供，例如光盘，但它也可以通过互联网下载。然而，试剂盒不限于此，其他变化对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。基于基因组(例如本文公开的那些)的表达水平，本发明的方法也可以用于选择治疗和/或确定受试者的治疗计划。
参考水平可以存储在合适的数据存储介质(例如数据库)中，并且因此也可用于将来的诊断。这也允许有效的分析，因为一旦确认(未来)从中获得相应参考样品的受试者确实成功植入，合适的参考结果可以在数据库中被识别。如本文所用，“数据库”包括在合适的存储介质上收集的数据(例如分析物和/或参考水平信息和/或患者信息)。此外，数据库还可以包括数据库管理系统。数据库管理系统优选地是基于网络、分层的或面向对象的数据库管理系统。更优选地，该数据库将被实施为分布式(联邦)系统，例如，作为客户端-服务器系统。更优选地，数据库被构造为允许搜索算法将测试数据集与由数据收集包括的数据集进行比较。具体而言，通过使用这样的算法，可以搜索数据库中表示mtdna水平的相似或相同的数据集。因此，如果在数据收集中可以识别相同或相似的数据集，则测试数据集将与植入潜力相关联。因此，从数据收集中获得的信息可用于基于从参考胚胎样品获得的测试数据集以预测胚胎植入潜力。
例如，本发明还提供试验结果或诊断或两者的通信给技术人员、医生或患者在某些实施例中，将使用计算机将试验结果或诊断或两者通信给感兴趣的各方，例如医师及其患者。
本文提供的试剂盒还可以包括标准pcr试剂。pcr试剂是本领域技术人员已知的并且可以包括例如脱氧核苷酸(dntp)、dna聚合酶(例如热稳定dna聚合酶，诸如taqdna聚合酶或
本文提供的试剂盒还可以包含阳性对照和/或阴性对照。在一些情况下，阳性和/或阴性对照可以为扩增测定提供质量对照。例如，阳性对照可以是已知具有待扩增序列的dna样品(例如纯化的载体)，并且可用于确认引物和/或探针正确地工作；阴性对照可以是缺乏任何扩增模板的样品(例如无核酸酶的水)。在一些情况下，阳性和/或阴性对照可以提供具有已知的定量和/或定性信息的dna序列。例如，阳性对照可以是从已知植入的胚胎获得的dna样品；阴性对照可以是从已知非植入的胚胎获得的dna样品。
本文提供的试剂盒中的一种或多种试剂可以容易包装和运输的形式提供。例如，可以浓缩形式提供缓冲液(例如10x缓冲液)，可以冻干形式等提供引物和/或探针。
该试剂盒可以包括任何适当的包装。例如，需要冷藏的试剂可以用冰袋包装。例如，需要冷冻的试剂可以用干冰包装。
该试剂盒可以包括安装手册。
将在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
示例
以下示例调查了379个胚胎中mtdna数量的生物学和临床相关性。通过微阵列比较基因组杂交(acgh)、定量pcr和下一代测序(ngs)的组合检查胚胎，提供关于染色体状态、mtdna数量和线粒体基因组中突变存在的信息。
材料和方法
道德声明
从西方irb(20060680和20131473)和nhs健康研究机构(nres委员会中南部)获得了道德批准。评估两种类型的胚胎样品：来自卵裂期胚胎的卵裂球(卵母细胞受精后3天)和来自囊胚的te细胞(受精后5-6天)。为了在植入前基因筛选(pgs)或植入前基因诊断(pgd)的背景下分析其染色体，本研究中包含的所有胚胎都根据产生它们的夫妇的要求进行了活组织检查。我们实验室用于此目的的标准过程涉及全基因组扩增(wga)，其次是acgh。本文描述的研究仅涉及扩增dna的分析，在pgd或pgs完成后遗留下来。由于这项研究，胚胎没有受到任何额外的干预，患者的临床治疗也没有改变。在批准的方案下(参见上文)获得用于分析放弃的扩增dna的知情患者同意书。
患者和样品
剩余的wga样品来自总共340个囊胚的te活检组织(通常由5-10个细胞组成)。囊胚由161对平均女性年龄为38岁(26-42岁)的夫妇生产。从总共39个卵裂期胚胎获得来自单一卵裂球的过量wga产物。这些胚胎是由32对夫妇产生的。该患者组的平均女性年龄为37.4岁(年龄29-42岁)。位于美国和英国的ivf诊所参与了此次调查。
胚胎取样和细胞遗传学分析制备
胚胎显微操作、活组织检查和用于染色体分析的活检材料的制备如前所述(fragoulietal，2013humgenet132：1001-1013；fragoulietal，2011humreprod26：480-490.所有样品均使用单个高度验证的微阵列比较基因组杂交(acgh)平台进行分析，(fragoulietal，2011humreprod26：480-490；wellsetal，2014jmedgenet51：553-562；maglietal，2011humreprod26：3181-3185；gutierrez-mateoetal，2011fertilsteril95：953-958；christopikouetal，2013humreprod28：1426-1434；mertzanidouetal，2013humreprod28：1716-1724).
微阵列cgh
使用24surecytochipv3微阵列进行染色体分析(illuminaltd.，cambridge，uk)。使用的方案如fragouli等人在(2013humgenet132：1001-1013)中所述。简言之，该过程涉及细胞裂解和wga(sureplex，rubicongenomics，annarbor，usa)。随后荧光标记扩增的dna样品和两个“参考”dna(46，xy和46，xx)，并与微阵列杂交。将微阵列洗涤，扫描(innoscan710，innopsys，carbonne，france)，并使用blue-fuse软件分析所得图像(illumina，cambridge，uk)。并使用blue-fuse软件(illumina，cambridge，uk)分析所得图像。使用这种方法，有可能确定卵裂球或te样品的染色体组成，允许将相应胚胎分类为正常或非整倍体。。
mtdna复制数的相对定量
mtdna复制数定量首先通过胚胎样品的荧光实时pcr评估进行。作为上述细胞遗传学分析的一部分，这些细胞先前进行过wga(sureplex，rubicon，usa)。使用定制设计的taqman试验(aatttaactgttagtccaaagag(seqidno：4)；生命技术，uk)来靶向并扩增特定的mtdna片段(线粒体16s核糖体rna序列(fregeletal，2011法医科学国际：遗传学补充系列3：e303-e304)。使用靶向多复制alu序列(yb8-alu-s68)(agctactcgggaggctgaggcagga(seqidno：7)；生命技术，uk)的额外taqman试验进行输入dna的标准化。相对于核dna序列的标准化的目的是确保与技术问题相关的mtdna水平的任何变化(例如，wga效率或活组织检查标本内细胞数量的差异)可以调节。多复制序列(即alu)被选择用于此目的，因为在单一细胞水平，单一复制序列可能由于诸如等位基因丢失(ado)等因素而产生虚假结果。每个实时pcr实验包括分析所有样品进行比较的参考dna。参考dna来源于核型正常的男性(46，xy)卵裂球或te样品，通过sureplex方法扩增(rubicon，usa)，并在整个研究过程中保持不变。两组扩增也包括阴性对照(不含核酸酶的h20和pcr主混合物)。为mtdna和alu序列建立三重扩增反应。每个反应含有1μl全基因组扩增(sureplex)胚胎dna，8μl无核酸酶h20，10μltaqmanuniversalmaster-mixii(2x)/无ung(生命技术，uk)和1μl20×taq-manmtdna或alu测定(生命技术，uk)，总体积为20μl。使用的热循环仪是stepone实时pcr系统(生命技术，uk)，采用以下条件：在50℃培养2分钟，在95℃培养10分钟，然后30个95℃培养15秒和60℃培养1分钟的循环。
通过下一代测序进行线粒体基因组分析
使用miseq和hiseq(illumina，usa)对来自具有不同水平的mtdna(先前通过实时pcr建立)的整倍体te样品的23种wga产物进行大规模平行dna测序。该协议是由制造商(illumina，usa)建议的。库制备包括使用zymodna清洁&浓缩器(zymo研究公司，irvine，ca，usa)对sureplex扩增产物进行初始纯化，然后通过qubitdsdnahs试验试剂盒(生命技术，usa)对dna浓度进行定量。随后根据制造商的协议(illumina，usa)使用nexteraxtdna样品制备和指数试剂盒将1纳克dna转化为双重索引测序库。
使用miseq试剂盒v3或2x100个循环，使用truseqpecluster试剂盒v3-cbot-hs和truseqsbs试剂盒v3-hs在illuminahiseq2000上进行双重索引，对库进行2x150个循环的双重索引测序，在illuminamiseq上进行测序，分别用于流式细胞聚类和测序(illumina，usa)。
使用bwa(lietal，2009bioinformatics25：1754-1760)或isaac(raczyetal，2013bioinformatics29：2041-2043)分别对miseq和hiseq测序运行，使读数与人基因组hg19进行对比。在比对后，使用bed工具(quinlanetal，2010bioinformatics26：841-842)和sam工具(lietal，2009bioinformatics25：2078-2079)去除未映射的读数、重复读数、具有低映射评分的读数和具有与参考基因组的多于一个错配的读数。将参考基因组分成不重叠的区域，使得每个区域包含100个独特地映射整个基因组的36mer(baslanetal，2012natprotoc7：1024-1041)并计算映射到每个区域的读取数目。基于gc含量和计算机模拟参考数据集对区域读取计数进行标准化，以消除偏差。根据以下公式计算每个区域的复制数量：
其中预计中位常染色体读数与第二复制相对应。使用13-区域滑动中位数来平滑每个染色体的区域复制数值。每条染色体的复制数值状态来源于整个染色体上平滑复制数值的中位数。
比对后，使用bed工具生成genomecoveragebed文件，并计算相对于核基因组与线粒体基因组进行比对的总测序碱基的比例。使用sam工具，从bam文件中提取线粒体读数并用在线工具mitobamannotator进行分析(zhidkovetal，2011mitochondrion11：924-928)。
通过ngs进行mtdna定量
另外38个te样品进行了ngs分析以便进行染色体结构评估和mtdna定量。使用不同类型的ngs技术来分析这38个te样品，涉及pgm(生命技术，uk)的应用。为此目的，采用了涉及使用多重置换扩增(mda)的不同初始wga方法。简而言之，通过加入2.5μl碱裂解缓冲液(0.75μlpcr级水[promega，usa]；1.25μldtt[0.1m][sigma，uk]；0.5μlnaoh[1.0m][sigma，uk])，然后在65℃下在热循环仪中培育它们10分钟。如制造商所建议的，使用repli-gmidi反应试剂盒(qiagen，uk)进行mda全基因组扩增。所有样品都在30℃的热循环仪中培养120分钟，65℃再培养5分钟。例如在wellsetal.(2014jmedgenet51：553-562)中描述了所使用的ngs程序。
统计分析
通过方程2-deltadeltact确定参考和测试样品的相对于alu序列的mtdna的相对数量。用于参考和测试样品的deltact是数据标准化过程的最终结果。这涉及计算参考和测试基因座(ct-mtdna减去ct-alu)的deltact，以及相对于参考dna样品(deltact相加标准化因子)的测试样品值的调节(schmittgenetal.，2008natprotoc3：1101-1108)。最终的mtdna值的统计分析使用了不成对的双尾t检验。在本研究中比较的参数包括女性年龄(年轻与年长)、胚胎染色体状况(正常与非整倍体)以及胚胎存活力/植入潜力(持续妊娠与植入失败)。
使用ngs对mtdna的相对定量涉及确定可归因于线粒体基因组的dna序列读数的数量作为读取总数的一部分。绝大多数测序的dna片段来源于核基因组，并提供对活组织检查标本中细胞数量的对照。
示例1：胚胎样品的细胞遗传学分析
在本次调查过程中共研究了39个卵裂期胚胎和340个经过细胞遗传学检测的囊胚。在微阵列比较基因组杂交(acgh)分析后将所有卵裂期胚胎定性为染色体正常并转移至子宫。在所检查的囊胚中，使用cgh分析302个囊胚，使用下一代测序(ngs)方法分析38个囊胚。其中123个被确定为非整倍体(99个通过cgh分析，24个通过ngs分析)，而其余217个被定性为染色体正常(203个通过cgh分析，14个通过ngs分析)。对131个正常囊胚和所有39个整倍体卵裂期胚胎进行子宫移植。胚胎分类为染色体正常或非整倍体是基于对单一卵裂球(卵裂期)或5-10个te细胞(囊胚)进行cgh或ngs分析后获得的结果。
示例2：女性年龄对mtdna数量的影响
根据女性年龄评估mtdna的相对数量。具体而言，由生殖年龄较小的一组女性(平均年龄34.8岁，范围26-37岁)产生的148个囊胚和生殖年龄较大组(平均年龄39.8岁，范围38-42岁)产生的154个囊胚的初始比较，其使用实时pcr进行。数据分析清楚地显示生殖年龄较大的妇女的囊胚中mtdna数量的统计学显着增加(p＝0.003)。这种现象在所有囊胚一起考虑时都很明显，如果分别考虑染色体正常和异常胚胎(分别为p＝0.018和p＝0.05)，这一现象也很明显。表1总结了正在研究的女性年龄组的染色体正常和异常囊胚中mtdna的相对数量，并在图2a中说明。
表1.与雌性和囊胚染色体状态相关的mtdna平均相对数量。
mtdna值是在实时pcr分析期间获得。
在卵裂期也观察到根据女性年龄的mtdna水平的显着差异(p＝0.01)。然而，与囊胚阶段不同，与从生育年龄大的女性产生的胚胎中移除的卵裂球相比较(平均年龄39.2岁，范围38-42岁)，从生殖年轻女性(平均年龄33.7岁，范围29-37岁)产生的胚胎中移除的卵裂球包含更高的mtdna量。这些结果在图2b和表2中所示出。
表2.在卵裂阶段观察到的与女性年龄相关的mtdna的平均相对数量。
mtdna值是在实时pcr分析期间获得。所有被检查的卵裂球均表现为染色体正常。
示例3：胚胎染色体结构与mtdna数量的关系
在胚胎发育的最早阶段，染色体异常是非常普遍的，其中植入后的速率降低(fragoulietal，2013humgenet132：1001-1013)。对203个正常和99个非整倍体囊胚阶段胚胎进行了与染色体状态相关的mtdna数量的实时pcr评估。使用cgh评估来自所有这些胚胎的te样品。很明显，与那些被定性为整倍体的囊胚相比，染色体异常的囊胚倾向于含有显着更大量的mtdna(p＝0.025)(图2c)。
为了使用不相关的方法来验证这些结果，本发明人应用了不同类型的全基因组扩增(wga)方法，然后将ngs应用于源自另外38个囊胚的te活组织检查。ngs技术的优势在于能够同时检测核和线粒体基因组。ngs分析显示，14个囊胚是整倍体，而剩下的24个被评分为染色体异常。这个发现通过使用每个wga产物的分开的等分试样进行的cgh证实。与实时pcr结果一样，ngs数据的统计分析显示，非整倍体囊胚中mtdna数量与染色体正常的囊胚相比显着增加(p＝0.006)。这提供了实时pcr发现的独立确认。ngsmtdna数据如图3所示。
应该指出的是，虽然mtdna的数量随着女性年龄的增长而增加，但与非整倍体的关系似乎是一个独立的因素。在任何给定的年龄组中，mtdna水平平均高于染色体异常的囊胚(表1)。
示例4：mtdna复制数和囊胚建立临床妊娠的能力
为了评估mtdna含量是否对胚胎植入和引发妊娠的能力有影响，发明人回顾性分析了从有或没有植入的单一胚胎转移(set)或双胚胎(导致双卵双生或不植入)转移(det)获得的数据。具体而言，本发明人检查了89个囊胚的mtdna含量，其中81个被转移到set中，其余8个被转移到det中。这部分研究纳入了85名患者，平均女性年龄为38.3岁。在转移到这些患者中的囊胚中，42例建立了正在进行的临床妊娠，而其余47例未能植入。
实时pcr分析清楚地表明，与不能开始临床妊娠的囊胚相比，能够植入的囊胚含有显着较低量的mtdna(p＝0.007)。这些结果总结在图4中示出。
从植入和非植入囊胚获得的实时pcr数据的分析允许建立mtdna数量阈值，在该阈值之上植入从未发生过。具体而言，导致临床妊娠的42/42(100％)囊胚包含的相对mtdna量低于0.003。另外，具有mtdna数量高于0.003的胚胎的14/14(100％)无法植入。这些代表30％(14/47)的非植入囊胚，而其余70％(33/47)含有低于阈值的mtdna(图5a)。值得注意的是，确定的mtdna数量阈值为0.003，独立于囊胚形态、年龄和产生胚胎的ivf临床。
为了进一步评估mtdna水平升高与植入失败之间的关系，我们使用ngs分析了23个te样品。所有的胚胎都是整倍体，并且之前已经通过实时pcr进行了分析。转移后的临床结果对于21个相应的囊胚已知。其中7例导致妊娠，而其余14例未能植入。在未植入的14个胚胎中，实时pcr鉴定出9个含有高于0.003的mtdna量的胚胎。ngs分析证实了实时pcr结果，清楚地表明非植入胚胎中的mtdna数量相比于那些被证明是可行的胚胎相比显着增加。另外3例临床结果未知的te样品也观察到mtdna的增加。这些结果如图5c和表3所示。
表3.通过实时pcr和ngs评估23个te样品的mtdna数量和临床结果。
对于实时pcr和ngs，它们考虑样本具有升高的mdna水平(与植入不相容)的阈值分别为0.003和为0.07。
示例5：基于mtdna定量的ivf结果的双盲前瞻性预测
在基于回顾性数据分析建立了囊胚中mtdna水平的活性能力阈值之后，发明人进行了一项双盲的前瞻性研究以评估其预测价值。在来自总共42个染色体(cgh)和形态学分析后选择用于转移至子宫的整倍体囊胚的te活检中进行mtdna的定量。产生这些胚胎的妇女的平均年龄为36.7岁(年龄范围26-42岁)，并且夫妇在6个不同的试管婴儿诊所接受治疗。已显示15个胚胎具有高于0.003阈值的mtdna水平，因此预测其与无法建立活性妊娠失败有关(图5b)。几周后对生物化学和超声数据的回顾证实，这些胚胎移植都没有导致活性妊娠。因此mtdna分析的阴性预测值为100％。其余27个胚胎的mtdna数量低于0.003，因此预测其可能会产生孩子。在对双盲结果进行解码后，发现其中16个胚胎最终建立了可行的临床妊娠。因此，通过mtdna分析将59％的胚胎分类为潜在活性的胚胎会导致正在进行的临床妊娠。这与此队列胚胎获得的38％(16/42)的妊娠率相反，不考虑mtdna结果。这些结果进一步证实了我们先前的发现，即具有高mtdna数量的胚胎不能形成临床妊娠。而且，已经证明mtdna定量可以用作协助在整倍体胚胎中选择的有效生物标志物。
示例6：非植入胚胎中mtdna水平升高的原因
为了阐明在非植入囊胚中看到的过量mtdna的起源是胚胎还是源自卵母细胞，本发明人检查了从39个卵裂期胚胎移出的卵裂球中的mtdna数量。线粒体dna复制直到囊胚阶段才被认为发生，因此在早期发育阶段检测到的mtdna水平预计会反映卵母细胞中的mtdna水平。在研究的这部分中考虑的所有卵裂阶段胚胎已经被定性为卵裂球acgh分析后的整倍体，并已被转移至子宫。就临床结果而言，17个胚胎能够植入，导致临床妊娠，而其余22个不能植入。
与te样品相比，卵裂球明显含有更高水平的mtdna。这不是一个意外的发现，考虑到与te活检相比，卵裂球的细胞质体积要大得多。
在这项分析过程中获得的数据评估表明，胚胎植入的卵裂球的mtdna数量与胚胎未能植入的mtdna数量相比没有显着差异(p＝0.7)。因此得出的结论是，来自非活性囊胚子集的细胞中看到的mtdna含量增加必须源自卵裂期之后。这一结论与线粒体基因组复制的第一个有意义波形在胚胎细胞分化为te并开始内细胞团之后才开始的观点相一致。
示例7：线粒体基因组分析
改变线粒体dna水平的一个潜在原因可能是线粒体的增殖，作为对具有关键基因突变的缺陷细胞器的存在的补偿应答。为了探索这种可能性，使用ngs对23个te样品的整个线粒体基因组进行测序。样品来源于染色体正常的囊胚，其中9个具有升高数量的mtdna(最初使用实时pcr确定)，以及14个具有正常范围内的mtdna水平(表3)。线粒体基因组测序平均深度为～150个读数，允许突变检测和异质程度的估计。在所有样品中均发现了通常呈异质形式的突变，但在mtdna水平较高的囊胚中不如mtdna数量较低的胚胎更普遍。
讨论
先前研究人类线粒体和mtdna与女性生殖老化相关的研究集中在对卵母细胞而不是胚胎的分析上。已公布的结果并不完全一致，但大多数报道mtdna水平要么保持不变或随着年龄增长而减少[16，21-22]。老年小鼠也被报道卵母细胞mtdna数量随年龄增长而减少[23]。其他研究表明，卵母细胞mtdna复制数的下降可能与卵巢病理有关[1，24]。在目前的研究中，与年轻患者相比，生殖年龄较大的女性产生的卵裂期胚胎的细胞中观察到显着(p＝0.01)的mtdna数量下降。考虑到主要的mtdna复制波形被认为是在囊胚形成后开始[3，8]，所以在植入前的早期阶段的这些观察可能代表存在于相应卵母细胞中的mtdna的数量。因此，我们的数据支持了随着女性年龄增长卵母细胞mtdna水平降低的观点。
有趣的是，仅在卵裂期两天后人类囊胚标本的分析揭示了相反方向的趋势，随着女性年龄的提高，mtdna水平显着增加。这种关联对于整倍体和非整倍体囊胚都是明显的。观察到的mtdna数量增加可能表明线粒体数量增加，尽管这两种因素之间的关系由于单一细胞器可能含有超过一个线粒体基因组复制的事实而变得复杂。
众所周知，产生活体胚胎的卵母细胞的可能性与母亲的年龄呈负相关。与使用年轻女性捐献的配子的患者相比，使用自己的卵母细胞的老年患者的ivf治疗成功率的显着差异清楚地证明了这一点。在当前研究期间，在囊胚阶段看到的mtdna随着年龄的增加提出了线粒体是否可能在随着年龄的女性生育力下降中起直接作用的问题。
可以想象的是，mtdna水平升高是补偿机制的结果，旨在面对越来越多的功能降低的受损细胞器时使atp产生标准化。事实上，从动物模型获得的数据表明老年线粒体的完整性下降，并因此导致atp产生效率的恶化[24，25]。已经表明老年仓鼠和小鼠的卵母细胞中的线粒体产生更高水平的活性氧类(ros)，产生更少的atp，因此可能具有减少的能力来充分支持动态过程，诸如植入前发育[26]。如果人类存在类似的情况，那么为了维持足够的atp水平，老年女性胚胎中线粒体数量的增加可能是必需的。
atp合成能力随着年龄的下降可能与线粒体基因组中突变的积累有关。先前已经记录了人类植入前胚胎对突变反应的mtdna含量的增加[27]。mtdna靠近呼吸链产生的ros的位置，加上缺乏组蛋白和较低的dna修复机制，使线粒体基因组特别容易发生突变[8，24]。理论上，卵母细胞在受精前保持的时间越长，发生mtdna突变的机会就越大。几项研究表明，卵母细胞中线粒体基因表达的减少，在精子接触后以及发育停滞的胚胎中不能受精。人类卵母细胞中也观察到线粒体4977bp缺失的发生率与各种组织的老化有关[24，28，29]。然而，在目前的研究中，使用ngs对整个线粒体基因组进行测序未能检测到具有高mtdna水平的胚胎中突变负荷的明显增加。这一发现反对线粒体突变驱动老年女性胚胎中细胞器复制的可能性。
mtdna水平高可以确实表明线粒体受损，但潜在的缺陷与dna序列的改变无关。或者，升高的mtdna数量可能与胚胎代谢需求增加，而不是次优功能的细胞器有关。老年卵母细胞产生的胚胎有可能处于某种形式的压力，因此需要更大的能量。功能实验将需要解决这些问题。无论基础是什么，目前的研究明确表明女性生殖老化与囊胚期mtdna含量的变化有关。
非整倍体影响超过一半所有人类植入前胚胎，并被认为是早期胚胎死亡的最重要原因[18]。大多数染色体异常来自卵子发生期间发生的错误(减数分裂、母系起源)，但在受精后(有丝分裂)后的最初几个胚胎细胞分裂中，染色体分离也是常见的。尽管其频率和临床重要性，高水平的减数分裂和有丝分裂错误的原因尚未完全了解。
除了进行mtdna定量分析之外，在本研究中分析的所有胚胎先前都使用经过充分验证的全面染色体筛选方法作为常规pgd或pgs的一部分进行了非整倍体检测[30，31]。产生的细胞遗传学(acgh)和线粒体(实时pcr)数据的比较表明，平均来说，来源于非整倍体囊胚的活组织检查标本含有比来自整倍体胚胎的样品显着更大量的mtdna(p＝0.025)。这些研究结果被使用替代方法(ngs)来评估一组独立的胚胎所证实。重要的是，在染色体异常胚胎中观察到的mtdna复制数的增加是与女性年龄相关的额外因素，例如与来自同一年龄的女性的染色体正常胚胎相比，非整倍体囊胚倾向于具有更高水平的mtdna。
mtdna/线粒体数量或功能的变化可能对染色体分离的准确性有直接影响，这似乎是合理的。线粒体代谢因素，包括atp和丙酮酸脱氢酶复合物对于正确的卵母细胞纺锤体装配和染色体排列是必不可少的[32-34]。此外，糖尿病小鼠的卵母细胞检查表明受损的线粒体与非整倍体相关。已知线粒体在细胞分裂过程中被重新分配到纺锤体和微管组织中心[35]，这可能是为了确保纺锤体形成和染色体运动的能量需求得到满足。已经提出了卵母细胞内线粒体分布与减数分裂纺锤体上的染色体组之间的联系[36]。此外，已经表明，具有高水平染色体镶嵌性的胚胎(在受精后的有丝分裂期间发生错误的结果)通常包含具有低膜电位的线粒体[37]。
目前尚不清楚是否胚胎中mtdna数量增加的非整倍体是影响细胞器的缺陷，干扰atp产生或其他关键功能的直接后果，或者改变的线粒体数目和非整倍体是否是另一个问题的独立下游结果，目前尚未确定，其影响胚胎或卵母细胞。值得注意的是，尽管与年龄和非整倍体相关的mtdna数量增加仅在囊胚中出现，但在受精前扩增的触发可能已经存在於卵母细胞中。囊胚中观察到的大部分非整倍体是雌性减数分裂过程中出现错误的结果[30，38]，表明在卵母细胞中易发生减数分裂非整倍体的因素也可能影响后期胚胎阶段的mtdna复制。
mtdna以及囊胚的植入潜力
为了提高辅助生殖治疗的效率，迫切需要优质的活体胚胎鉴定方法。在转移至子宫之前对胚胎进行细胞遗传学异常的筛选允许避免胚胎衰竭(即非整倍体)的主要原因。然而，即使转移形态学上“完美”的胚胎(在活检细胞分析后额外考虑为染色体正常)，也不能保证成功妊娠的开始(仅约三分之二的此类胚胎实际上产生了孩子)。很明显，额外元素在胚胎存活力中起作用。可能的重要因素包括线粒体数量/能力以及对atp含量和/或代谢活性的影响[17]。作为这项研究的一部分，在整倍体卵裂和囊胚阶段胚胎中对mtdna的水平进行了回顾性评估，这些胚胎已经在pgd或pgs后转移到子宫并且临床结果已知。
与那些转移后未能植入的囊胚相比(p＝0.007)，活检细胞中观察到的mtdna水平平均低于能够建立临床妊娠的囊胚。这种关系最初使用定量pcr进行鉴定，但随后使用ngs进行验证。在胚胎发育阶段采集的胚胎样品中只能清楚地观察到mtdna数量与产生怀孕能力之间的关联。mtdna含量与胚胎存活力丧失相关的增加比与年龄或非整倍体相关的mtdna含量增加更为显着。
对mtdna含量数据的分析允许建立阈值，在该阈值以上从未观察到染色体正常囊胚的植入。无论其他考虑事项如胚胎形态或患者接受治疗的临床情况如何，这一临界值仍然有效。大约三分之一的无活性囊胚mtdna水平高于阈值，表明这个因素代表致死性胚胎的一个指标，仅次于非整倍体的流行率和临床重要性。为了确认mtdna测量的预测能力，以前瞻性方式双盲评估独立系列的囊胚。再一次，所有mtdna水平高于阈值的整倍体囊胚都未能植入(100％)。那些线粒体dna数量在正常范围内的植入率为59％，而整个组的植入率为38％。
未能检测到mtdna水平与卵裂期胚胎植入潜力之间的明确关联，表明在无活性囊胚子集中看到的mtdna数量增加是受精后第3天发生的扩增的结果。已知mtdna复制因素在囊胚期的表达上调，这通常被认为与第一次有意义的mtdna合成波形一致[3]。这也可能是在一些非活体胚胎中mtdna水平过度增加的时候。
囊胚期异常高水平的mtdna可能是某种形式的压力的症状，导致能量需求升高。这种可能性与leese提出的“安静的胚胎假说”一致，这表明活体胚胎具有相对较低或“安静”的代谢，而那些处于压力下并且发育潜力降低的代谢倾向于更具代谢活性[39]。
值得注意的是，具有高mtdna数量的囊胚，不能产生活性妊娠，主要由38岁或以上的女性产生。考虑到观察到与提高女性年龄相关的线粒体dna增加，这一观察并不令人惊讶。女性年龄与胚胎生存能力降低之间的关系已经确立，并且主要是由于非整倍体[40]。然而，我们的研究结果表明线粒体是一个重要的附加因素。
总结
这些结果表明线粒体数量与人类胚胎植入子宫的能力之间存在明确的关联。具体而言，以上提供的结果表明，来自老年女性的胚胎中mtdna的数量显着较高(p＝0.003)。此外，mtdna水平在非整倍体胚胎中升高(p＝0.025)，与年龄无关。在将整倍体胚胎移植到子宫后评估临床结果显示，成功植入的囊胚比不植入的囊胚的mtdna数量更低(p＝0.007)。重要的是，建立了一个mtdna数量阈值，在此阈值之上从未观察到植入。随后，这一阈值的预测值在独立的双盲前瞻性研究中得到证实，表明30％的非植入性整倍体胚胎中存在异常mtdna水平，但在形成活性妊娠的胚胎中未见。ngs没有显示任何mtdna水平升高的囊胚突变的增加。这项研究的结果表明增加的mtdna可能与升高的代谢有关，并与存活力降低有关。重要的是，这些发现提示了线粒体在女性生殖老化和非整倍体发生中的潜在作用。具有临床意义，我们建议mtdna含量代表一种新的生物标志物，具有体外受精(ivf)治疗的潜在价值，揭示染色体正常的囊胚不能产生活性妊娠。
这些结果建立了一个mtdna阈值，在此阈值以上，植入失败率为100％。获得的数据表明胚胎缺陷与mtdna升高有关，可解释影响囊胚诊断为整倍体的植入失败达三分之一。定义的mtdna阈值似乎并不因不同生育诊所使用的过程变化而改变，表明对胚胎中mtdna的评估可形成简单，廉价且广泛适用的临床测试的基础。
还展示了mtdna含量，女性年龄和胚胎染色体状态之间的关系。线粒体dna含量可能直接影响胚胎存活力以及与非整倍体存在因果关系的可能性以及与生殖衰老有关的其他因素，这些都有待进一步研究。
示例8：通过实时pcr定量线粒体dna
参考dna制备
参考dna选自单一sureplex产物(来自滋养外胚层样品的扩增dna)或其可通过混合10-20μl的各种不同sureplex产物来制备。建议制备10-12等份的15μl参考dna并将它们储存在-80℃冰箱中。其中一个等分试样可用于每个实时pcr板。
表4.材料.
引物序列：
mtdna试验
mtdna_16s_fggtgatagctggttgtccaagat(seqidno：2)
mtdna_16s_rcctactatgggtgttaaattttttactctctc(seqidno：3)
mtdna_16s_maatttaactgttagtccaaagag(seqidno：4)
fam-mgbnfq培养基
alu试验
yb8-alu-s68_fgtcaggagatcgagaccatcct(seqidno：5)
yb8-alu-s68_ragtggcgcaatctcggc(seqidno：6)
yb8-alu-s68_magctactcgggaggctgaggcagga(seqidno：7)
fam-mgbnfq培养基
mtmajarc
mtmajarc_fctgttccccaaccttttcct(seqidno：8)
mtmajarc_rccatgattgtgaggggtagg(seqidno：9)
mtmajarc_mgaccccctaacaaccccc(seqidno：10)
ned-nfq培养基
用于实时pcr的样品制备
对于每个96孔板，分析阳性(参考dna)和阴性(无核酸酶水)对照以及与滋养外胚层(te)样品一起进行分析。所有反应一式三份进行。以下列方式制备水和样品，参考或阴性对照的试剂。
*阴性对照制备(仅有一个孔)-无核酸酶的水：32μl
由于实时pcr涉及3个taqman试验的分析，因此针对每个样品和3个taqman试验中的每一个分别制备上述主混合物。
一旦准备好这些等分试样，将它们进行涡旋、离心，并在4℃下储存直至它们被使用。
等分试样应在主实验室的pcr外壳中制备。理想情况下，所有等分试样、实时pcr和板上样品的制备的加载应使用相同的移液管。
实时pcr协议
评估三种taqman试验：线粒体(2种taqman试验：mtdna和majarc)和alu(1种taqman试验)。制备这些主混合物并分装在板的单一细胞室。
主混合1：alu
管数：34(这是96孔板)
将11μl等分试样加入到96孔板(a2-a11，b1-c9)的首33个孔中
主混合2：线粒体/mtdnataqman试验
管数：34(这是96孔板)
将11μl等分试样加入到96孔板(c10-f4)的下一组31个孔中
主混合3：线粒体/majarc
管数：34(这是96孔板)
将11μl等分试样加入96孔板(f5-g12、h2-h12)的下一组32个孔中
一旦所有主混合物都被置于平板的孔中，取主实验室的盖板并等分合适量的dna样品，即9μl，涡旋和旋转。
热循环条件如下：
结果分析
第一板
deltacts(δct)是针对参考dna和te样品以及线粒体taqman试验计算的。从每个mtdna和majarc线粒体taqman试验的平均ct值中减去alutaqman试验的平均ct值。每个分析样品的mtdna：
deltact(δct)＝mtdna平均ct-alu平均ct
deltact(δct)＝majarc平均ct-alu平均ct
通过等式2-deltact(2-δct)计算参考dna和每个te样品的相对线粒体dna值，并且对两种线粒体taqman试验中的每一种进行测定。
mtdna引物的阈值为0.00005，而majarc的阈值为0.000024。具有较高值的样品具有较低的植入潜力。为了将样品称为高，两个taqman测定所获得的值都超过设定的阈值。
所有其他板
计算参考dna和te样品以及线粒体taqman试验的deltacts(δct)。从每个mtdna和majarc线粒体taqman试验的平均ct值中减去alutaqman试验的平均ct值。
每个分析样品的mtdna计算如下：
deltact(δct)＝mtdna平均ct-alu平均ct
每个分析样品的majarc计算如下：
deltact(δct)＝majarc平均ct-alu平均ct
通过计算deltadeltact(δδct)将数值标准化以确保其余板中的样品与第一板中的样品表现相同。
为此，标准化因子通过从第一板中的参考dna的deltact(δct)值中减去当前板中获得的参考dnadeltact(δct)值来计算。结果值是标准化因子。这是针对线粒体taqman试验完成的。
为了计算deltadeltact(δδct)，将标准化因子值添加到用于分析的te样品获得的deltact(δct)值。这是针对线粒体taqman试验完成的。
如前所述，通过等式2-deltadeltact(2-δδct)计算相对mtdna值。
其他实施例
应该理解，虽然已经结合其详细描述描述了本公开，但是前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的本公开的范围。其他方面，优点和修改在以下权利要求的范围内。
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gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtatttt60
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acgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgc900
ggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccc960
tccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagac1020
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taccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaa1140
cactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctggcggtgcttcatatccctctagagg1200
agcctgttctgtaatcgataaaccccgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatata1260
ccgccatcttcagcaaaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaag1320
acgttaggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctaccccag1380
aaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatttagcagtaaactaag1440
agtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctc1500
aagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagt1560
cgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacaca1620
aagcacccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaaaccta1680
gccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaaccatttacccaaataa1740
agtataggcgatagaaattgaaacctggcgcaatagatatagtaccgcaagggaaagatg1800
aaaaattataaccaagcataatatagcaaggactaacccctataccttctgcataatgaa1860
ttaactagaaataactttgcaaggagagccaaagctaagacccccgaaaccagacgagct1920
acctaagaacagctaaaagagcacacccgtctatgtagcaaaatagtgggaagatttata1980
ggtagaggcgacaaacctaccgagcctggtgatagctggttgtccaagatagaatcttag2040
ttcaactttaaatttgcccacagaaccctctaaatccccttgtaaatttaactgttagtc2100
caaagaggaacagctctttggacactaggaaaaaaccttgtagagagagtaaaaaattta2160
acacccatagtaggcctaaaagcagccaccaattaagaaagcgttcaagctcaacaccca2220
ctacctaaaaaatcccaaacatataactgaactcctcacacccaattggaccaatctatc2280
accctatagaagaactaatgttagtataagtaacatgaaaacattctcctccgcataagc2340
ctgcgtcagattaaaacactgaactgacaattaacagcccaatatctacaatcaaccaac2400
aagtcattattaccctcactgtcaacccaacacaggcatgctcataaggaaaggttaaaa2460
aaagtaaaaggaactcggcaaatcttaccccgcctgtttaccaaaaacatcacctctagc2520
atcaccagtattagaggcaccgcctgcccagtgacacatgtttaacggccgcggtaccct2580
aaccgtgcaaaggtagcataatcacttgttccttaaatagggacctgtatgaatggctcc2640
acgagggttcagctgtctcttacttttaaccagtgaaattgacctgcccgtgaagaggcg2700
ggcataacacagcaagacgagaagaccctatggagctttaatttattaatgcaaacagta2760
cctaacaaacccacaggtcctaaactaccaaacctgcattaaaaatttcggttggggcga2820
cctcggagcagaacccaacctccgagcagtacatgctaagacttcaccagtcaaagcgaa2880
ctactatactcaattgatccaataacttgaccaacggaacaagttaccctagggataaca2940
gcgcaatcctattctagagtccatatcaacaatagggtttacgacctcgatgttggatca3000
ggacatcccgatggtgcagccgctattaaaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctac3060
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