一种六胜肽的制备方法及其产品与流程

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种通过片段法合成六胜肽的方法。

背景技术：

六胜肽是一种含有六个氨基酸的活性多肽，其序列为Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，具有皮肤除皱的生物活性，广泛应用于各种高级美容化妆品中。

目前，六胜肽的合成方法主要有固相合成法和液相合成法。固相合成法所使用的Fmoc-AM Resin和Fmoc-MBHA Resin价格昂贵，树脂取代度较小，造成了六胜肽固相合成成本较高。液相合成法虽然原材料价格大大降低，但液相合成法合成过程繁杂，周期长，效率低，纯化成本高。六胜肽作为化妆品原料，降低生产成本，提高生产效率，简化合成工艺的研究具有重要意义。

因此，开发一种高效率低成本合成六胜肽的方法成为本领域急需解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种合成成本低、合成效率高、合成方法简单的优点，可用于规模化合成六胜肽的方法，其克服了现有经典固相合成六胜肽树脂成本高、载量低的问题，也克服了液相合成六胜肽过程复杂、合成周期长、效率低的缺点。

具体来说，本发明公开了一种六胜肽的合成方法，通过2-Chlorotrityl Ch loride Resin合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH全保护片段肽，然后用全保护片段肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Ar g(pbf)-Arg(pbf)-OH和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，再将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2脱除保护基得到六胜肽。

更具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。

一种六胜肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(2)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(3)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(4)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；以及

(5)将步骤(4)得到产物进行切割、分离和纯化得到六胜肽产品。

其中所述步骤(1)是将2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

其中所述步骤(2)是将步骤(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；然后按照所述方法在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

其中所述步骤(3)是将步骤(2)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc-两次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺的混合液进行反应得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中所述反应是在在氮气保护下，常温搅拌0.5-2小时；所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中脱Fmoc是用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc；优选步骤(4)中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺体积比9:1:0.5的混合液。

其中所述步骤(4)是将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液进行切割反应经过分离、纯化、干燥得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；

其中步骤(4)所述分离、纯化、干燥步骤是将切割后的产物过滤，滤液用两倍饱和食盐水洗涤3次，然后再加入与切割液等体积的饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调pH为7.0，35℃减压蒸发蒸除有机溶剂并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。

其中所述步骤(5)是将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到反应液，进行处理、分离、纯化、烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；然后向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液进行切割，之后分离得到粗品，经纯化、干燥得到产品。

其中所述步骤(5)切割之后经过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到六胜肽粗品，六胜肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2产品。

其中所述步骤(4)所述切割液是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:0.75:7.25的混合液；优选步骤(5)所述切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的混合液。

其中步骤(1)中2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4。

所述的步骤(2)中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2:(2.5～3):(2.5～3):(2.5～3)。

所述的步骤(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH与六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:3:3:(3～5):(3～5)。

本发明还提供所述制备方法制备得到的六胜肽产品，其纯度高于95％。

更具体来说，本发明提供一种六胜肽的固相片段合成方法，包括下述步骤：

一种六胜肽的合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：

(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

将2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶胀15分钟后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

将Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ar g(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2小时，得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlor otrityl Chloride Resin

按照步骤②的方法向Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resi n上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(p bf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotr ityl Chloride Resin

将Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrit yl Chloride Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fm oc-两次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺体积比9:1:0.5的混合液，在氮气保护下，常温搅拌30分钟，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

⑤切割处理

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液，常温搅拌1.5小时，过滤，将滤液用饱和食盐水洗涤3次，然后再加入与切割液等体积的饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为7.0，旋转蒸发仪35℃蒸除有机溶剂并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；

上述的切割液是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:0.75:7.25的混合液；

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2

将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺，搅拌反应3小时，向反应液加入2倍体积的饱和食盐水并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；

(3)合成六胜肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液，每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2用切割液3～5mL，室温搅拌1.5～2.5小时，过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到六胜肽粗品，六胜肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2；

上述的切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的混合液。

其中，所述的步骤(1)的①中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4。

其中，所述的步骤(1)的②中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

其中，所述的步骤(1)的③中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩尔比均为1:2，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

其中，所述的步骤(1)的⑤中，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的方法是将切割液用2倍体积的饱和食盐水洗涤3次，然后再加入与切割液等体积的饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为7.0，旋转蒸发仪35℃蒸除有机溶剂并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干。

其中，所述的步骤(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH与六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:3:3:3～5:3～5。

其中，所述的步骤(2)中，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2的方法是向反应液加入2倍体积的饱和食盐水并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干。

本发明有益效果如下：

本发明采用较廉价的2-Chlorotrityl Chloride Resin首先合成了全保护的六胜肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，然后将全保护的六胜肽片段羧基端用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺在N,N-二甲基甲酰胺溶液中酰胺化得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，再将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2脱保护基得到六胜肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂。

本发明克服了传统六胜肽固相合成法所使用的Fmoc-AM Resin和Fmoc-MBHA Resin价格昂贵，树脂取代度较小，造成了六胜肽固相合成成本较高的问题，也克服了六胜肽液相合成法合成过程繁杂，周期长，效率低，纯化成本高的问题，为六胜肽规模化生产提供一种工艺方法简单、生产成本较低、易纯化、效率高的合成方法。

本发明方法既克服了现有经典固相合成六胜肽树脂成本高、载量低的问题，也克服了液相合成六胜肽过程复杂、合成周期长、效率低的缺点，具有合成成本低、合成效率高、合成方法简单的优点，可用于规模化合成六胜肽。

附图说明

图1是实施例1合成的六胜肽的质谱图。

图2是实施例1合成的六胜肽的液相色谱图，其中(a)是液相色谱图，(b)是处理通道。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

下面对说明书中的简写进行说明：

2-chlorotrityl chloride Resin，其名称为2-氯三苯甲基氯树脂

Fmoc：9-笏亚甲氧羰基

pbf、OtBu、Trt都是保护基，名称分别是2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、叔丁氧基、三苯甲基。

本发明提供一种六胜肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(2)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(3)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(4)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；以及(5)将步骤(4)得到产物进行切割、分离和纯化得到六胜肽产品。其中所述步骤(1)是将2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。所述合成方法是发明人创造性劳动的结果，步骤(1)中Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin的合成方案可以避免使用高成本的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基树脂的不利因素，有效降低成本；使用的原料是2-chlorotrityl chloride Resin，其价格相对低廉，从而在原料上降低了成本。所述2-chlorotrityl chloride Resin，其名称为2-氯三苯甲基氯树脂，本发明使用的是取代度为1.74mmol/g，但其他取代度的2-chlorotrityl chloride Resin也可以达到相同或类似的技术效果，也在本发明的保护范围内。2-chlorotrityl chloride Resin的取代度可以是现有商品化的所有取代度，本发明使用的取代度1.74mmol/g是从合成片段的产率、纯度、树脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

其中所述步骤(2)是将步骤(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；然后按照所述方法在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。该步骤是将氨基酸链延长的步骤，其中各个氨基酸侧链保护选择的保护基可以是与Fmoc有正交保护效果的任意保护基，只要能够达到所希望的可以保护的技术效果即可，但发明人经过优选上述取代基效果最好。

其中，所述步骤(3)是将步骤(2)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc-两次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺的混合液进行反应得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；其中，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中所述反应是在在氮气保护下，常温搅拌40分钟-2小时；所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中脱Fmoc是用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc；优选步骤(4)中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺体积比9:1:0.5的混合液；其中所述步骤(4)是将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液进行切割反应经过分离、纯化、干燥得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；其中步骤(4)所述分离、纯化、干燥步骤是将切割后的产物过滤，滤液用两倍饱和食盐水洗涤3次，然后再加入与切割液等体积的饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调pH为7.0，35℃减压蒸发蒸除有机溶剂并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。在制备过程中各个物质之间的比例可以进行适当调节，获得的产品仍旧能够满足要求，因此，对制备过程中的各个物质之间的比例以及反应条件的参数的数值进行适当调整也在本发明的保护范围内。在一般的固相多肽合成中，如果以树脂为基准取1，那么氨基酸和其它试剂的使用量都要过量，一般会取1.8-3倍，如出现难反应的步骤加量可能更高，1.8-3倍是一个经济的加量。

其中所述步骤(5)是将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到反应液，进行处理、分离、纯化、烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；然后向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液进行切割，之后分离得到粗品，经纯化、干燥得到产品。

其中，所述步骤(4)所述切割液是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:0.75:7.25的混合液；优选步骤(5)所述切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的混合液。上述各个切割步骤不同，切割的原料不同，因此选择的切割液不同。

其中，步骤(1)中2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4。

其中所述的步骤(2)中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2:(2.5～3):(2.5～3):(2.5～3)。所述的步骤(2)中，

Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH与六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:3:3:(3～5):(3～5)。

在制备步骤中控制各个物质之间的配料比在上述范围内，这是发明人对各个步骤的制备方法配料比经过多个因素的考虑得到的结果，在上述保护范围内进行上下10％的浮动依然可以达到所述的技术效果。优选技术方案如上。

本发明还提供所述制备方法制备得到的六胜肽产品，其纯度高于95％。

在一种具体实施方式中，六胜肽的合成方法包括如下步骤：(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

将2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶胀15分钟后，抽滤，按2-Chlorotrityl Chloride Resin:Fmoc-Arg(pbf)-OH:N,N′-二异丙基乙胺摩尔比为1:1:4，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL二氯甲烷为溶剂，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，得Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlori de Resin。

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

将Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，按2-Chlorotrityl Chloride Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺摩尔比为1:2:2.5～3:2.5～3:2.5～3，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mLN,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氮气保护下，常温搅拌2小时，得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlor ide Resin。

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-C hlorotrityl Chloride Resin

按照步骤(1)中②的方法向Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlor ide Resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chl orotrityl Chloride Resin

将Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlor otrityl Chloride Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，按二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二异丙基乙胺体积比为9:1:0.5(v:v:v)配制反应液，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL反应液，在氮气保护下，常温搅拌30分钟，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

⑤切割处理

按三氟乙醇、乙酸、二氯甲烷体积比为2:0.75:7.25(v:v:v)配制切割液，每克肽树脂Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL切割液，常温搅拌1.5小时，过滤，将滤液用2倍体积的饱和食盐水洗涤3次，然后再加入与切割液等体积的饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为7.0，旋转蒸发仪35℃蒸除有机溶剂并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2

将每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用10mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，按Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺摩尔比为1:3:3:3～5:3～5加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺，搅拌反应3小时，向反应液加入2倍体积的饱和食盐水并析出沉淀，过滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2。

(3)合成六胜肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2

按三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、水、三异丙基硅烷的比例为83mL:5g:4mL:3mL:5mL配制切割液，每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2加入3～5mL切割液，室温搅拌1.5～2.5小时，过滤，将滤液加入5～8倍冷无水乙醚中，析出沉淀，过滤，沉淀用无水乙醚洗3次，真空干燥，得到六胜肽粗品，六胜肽粗品经反相色谱纯化、冻干，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2。

实施例

下面对实施例中使用的各个物质的来源进行说明，如果没有特别说明，所使用的原料和仪器均是商购获得，是本领域常规使用仪器和原料，只要其能满足实验需要即可。

本发明的2-chlorotrityl chloride resin的取代度为1.74mmol/g，均由天津南开和成科技有限公司商购获得。

固相多肽合成反应器为通用的多肽合成反应器，可以购自成都斯诺进出口贸易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色谱仪为日立全自动L2000。

制备型高效液相色谱仪为创新恒通LC3000，C18分析色谱柱为大连物理化学研究所4.6mm×250mm，C18制备色谱柱为成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺购自上海吉尔生化有限公司。

LTQ-XL电喷雾电离质谱仪为美国Thermo Finnigan公司。

实验中使用的各个有机溶剂、有机试剂均为国产AR或CP。

实施例1

本实施例六胜肽的制备方法包括如下步骤：

(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

将50.0g2-Chlorotrityl Chloride Resin加入合成器中，加入500mL二氯甲烷浸泡、溶胀15分钟后，抽滤，向合成器中加入500mL二氯甲烷、56.45gFmoc-Arg(pbf)-OH、61.0mLN,N′-二异丙基乙胺，2-Chlorotrityl Chloride Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，得Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

向合成器中的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入500mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液反应10分钟，抽滤除去混合液，再加入500mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应20分钟，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，完成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc-两次，向合成器中加入500mL N,N-二甲基甲酰胺、112.89g Fmoc-Arg(pbf)-OH、35.26g 1-羟基苯丙三唑、83.81g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、45.6mL N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2小时，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，抽滤，得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

按照步骤(1)中②的方法，向合成器中的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次连接106.26gFmoc-Gln(Trt)-OH、64.64gFmoc-Met-OH、74.04gFmoc-Glu(OtBu)-OH、74.04gFmoc-Glu(OtBu)-OH，其他试剂的用量为：1-羟基苯丙三唑35.26g、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸83.81g、N,N′-二异丙基乙胺45.6mL，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，得Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

上述的Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为2:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

向合成器中的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入500mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液反应10分钟，抽滤除去混合液，再加入500mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应20分钟，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，完成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脱Fmoc-两次，向合成器中加入450mL二氯甲烷、50mL乙酸酐、25mLN,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌30分钟，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次500mL，抽滤，甲醇洗涤树脂3次，每次500mL，抽滤，干燥，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

⑤切割处理

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin加入500mL切割液，所用的切割液是三氟乙醇、乙酸、二氯甲烷体积比为2:0.75:7.25(v:v:v)的混合液，常温搅拌1.5小时，过滤，将滤液移入1000mL分液漏斗中，用1000mL饱和食盐水洗涤3次，再将滤液移入2000mL茄型瓶中，加入500mL饱和食盐水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为7.0，旋转蒸发仪35℃蒸除有机溶剂并析出沉淀，用4号砂芯漏斗抽滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干，得120.16gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，收率78.94％。

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH₂

将120.16g(68.68mmol)Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH加入5L烧杯中，加入1200mLN,N-二甲基甲酰胺、107.22g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、27.84g1-羟基苯丙三唑、18.37g氯化铵、59.8mLN,N′-二异丙基乙胺，搅拌反应3小时，向反应液加入2400mL饱和食盐水并析出沉淀，用4号砂芯漏斗抽滤，沉淀用纯水洗涤3次，40～45℃烘干,得113.11gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，收率94.13％。

(3)合成六胜肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂

向113.11gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH₂中加入300mL切割液，所用的切割液是三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、水、三异丙基硅烷比例为83mL:5g:4mL:3mL:5mL混合溶液，室温搅拌2小时，用3号砂芯漏斗抽滤，将滤液加入2400mL冷无水乙醚中，析出沉淀，用4号砂芯漏斗抽滤，沉淀用无水乙醚洗3次，真空干燥，得到六胜肽粗品，六胜肽粗品经反相色谱纯化、冻干，得63.35g六胜肽，收率81.79％。

采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1，由图可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与六胜肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为六胜肽。采用液相色谱仪对合成的六胜肽进行纯度测定，液相色谱图见图2(a)，结合图2(b)可见，六胜肽的纯度大于95％。

实施例2

本实施的步骤(1)中，Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH与2-Chlorotrityl Chloride Resin的摩尔比均为2:1，2-Chlorotrityl Chloride Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2.5:2.5:2.5，该步骤的其他步骤与实施例(1)相同。本实施例的步骤(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺摩尔比为1:3:3:3:3，该步骤的其他步骤与实施例(1)相同。本实施的步骤(3)与实施例(1)相同，得62.51g六胜肽，收率80.71％。采用实施例1相同的条件对产品采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，所合成的产物的分子量及分子离子峰与六胜肽的分子量及分子离子峰一致。采用液相色谱仪对合成的六胜肽进行纯度测定，纯度大于95％。

实施例3

本实施的步骤(1)与实施例(1)相同。本实施例的步骤(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑、氯化铵、N,N′-二异丙基乙胺摩尔比为1:3:3:4:4，该步骤的其他步骤与实施例(1)相同。本实施的步骤(3)与实施例(1)相同，得62.78g六胜肽，收率81.06％。采用实施例1相同的条件对产品采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，所合成的产物的分子量及分子离子峰与六胜肽的分子量及分子离子峰一致。采用液相色谱仪对合成的六胜肽进行纯度测定，纯度大于95％。