一种抗肥胖七肽NPVWKRK的制作方法

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。

背景技术：

生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段。相较于蛋白质而言，小分子肽片段的优越性主要体现在：更易被人体吸收利用；活性高，在较小浓度下即可发挥其特有的生理作用；分子量小，易于修饰和改造，能够通过人工化学合成等。而相较于单一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。已有研究证实，人体小肠存在专门的低聚肽吸收通道，人体摄入的蛋白质经过多种消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。许多研究表明，各种来源的生物活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降压、降血糖等多种作用，成为生物医药和保健品开发的热点。肥胖增加动脉粥样硬化，冠心病，高血压，糖尿病，痛风，脂肪肝等疾病的发病危险。因此，对具有减肥降脂作用而安全无害的生物活性肽的开发研究，变得尤为重要。目前，具有减肥降脂作用的多肽包括利拉鲁肽，鲈鱼活性肽，蚕蛹肽等。

技术实现要素：

本发明选取小鼠前脂肪细胞3T3-L1为研究对象，使用MTT法测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外抗肥胖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。

本发明合成的抗肥胖七肽缩写为NPVWKRK，分子量927.12，序列为：Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys。其中，

Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺酸的氨基酸的相应残基;

Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；

Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基;

Trp表示英文名称为Tryptophan ，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基;

Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基;

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基;

Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基。

本发明所述的氨基酸序列采用标准 Fmoc 方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N 端合成。

本发明将终浓度为0.125-2 mg/mL 的合成多肽与3T3-L1混匀，孵育48 h后，经MTT法检测，对脂肪细胞抑制率达到14.59%-45.38%,可在制备生物医药领域中应用。

所述七肽NPVWKRK在浓度为2 mg/mL 时，对3T3-L1的体外增殖抑制率为45.38%。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明首次合成了该肽，并且采用MTT方法检测了合成多肽的体外脂肪细胞增殖抑制活性，所述合成多肽具有一定的脂肪细胞抑制能力。

附图说明

图1a为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys 的HPLC图。

图1b为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys 的MS图。

图2为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys对脂肪细胞3T3-L1的抑制活性柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

多肽固相合成

选用高分子树脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys的特征，先将Lys的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Lys的氨基和Arg 的羧基缩水反应，处理后，再添加Lys，Arg的氨基和Lys的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Asn氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C₁₈，尺寸 4.6*150mm，流动相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流动相B:含有0.09%TFA 的溶液 (80%乙腈+20%水)；20 min内B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0 mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到98.95%以上，并经MS 鉴定结构（如图1 所示）。

合成多肽的体外抑制活性

通过 MTT 比色法分析肽组分对3T3-L1的生长抑制作用。具体操作步骤如下：

1）取对数生长期的细胞，经0.25%（体积）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×10⁴个/mL，加至96孔板中，每孔100 µL, 于37 ℃恒温CO2培养箱中培养；

2）培养24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的含有不同浓度待测样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养；

3）48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO₂培养箱中继续培养；

4）4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率:

脂肪细胞生长抑制率(%)=((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD ))/((对照组OD-空白组OD ) )×100。

应用实施例1

脂肪细胞3T3-L1 100 µL 细胞悬液(5×10⁴个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100 µL的125 µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，125 µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是14.59%。

应用实施例2

脂肪细胞3T3-L1 100 µL 细胞悬液(5×10⁴个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养， 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100 µL的250 µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO₂培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，250 µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是24.93%。

应用实施例3

脂肪细胞3T3-L1 100 µL 细胞悬液(5×10⁴个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养， 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100 µL的500 µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，500 µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是31.73%。

应用实施例4

脂肪细胞3T3-L1 100 µL 细胞悬液(5×10⁴个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养， 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100 µL的1000 µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO₂培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，1000 µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是33.57%。

应用实施例5

脂肪细胞3T3-L1 100 µL 细胞悬液(5×10⁴个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养，24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100 µL的2000 µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37 ℃恒温CO₂培养箱中培养， 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜完全培养基180 µL；于37 ℃恒温CO₂培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，2000 µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是45.38%。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 一种抗肥胖七肽NPVWKRK

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Pro Val Trp Lys Arg Lys

1 5