游离肌动蛋白的提取方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种游离肌动蛋白的提取方法。
背景技术：
：肌动蛋白在生物界中有广泛的分布，除肌肉组织外，还存在于几乎所有的真核细胞中。肌动蛋白，是微丝的结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体。单体的肌动蛋白是由一条多肽链构成的球形分子，又称球状肌动蛋白(globularactin,G-actin)，外形类似花生果。肌动蛋白的多聚体形成肌动蛋白丝，称为纤维状肌动蛋白。肌动蛋白具有多种功能，比如维持细胞形态、参与胞质环流、变形运动、吞噬活动等多种细胞活动、参与细胞分裂、肌肉收缩和信号转到等多种细胞活动，因此，对肌动蛋白的研究一直是生物学的热点问题。而在实验研究中，提取到的肌动蛋白的浓度一般较低，含有杂质，不易对其展开研究。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种游离肌动蛋白的提取方法。为此，本发明提供的技术方案为：一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、从动物肌肉中提取肌动球蛋白，获得肌动球蛋白溶液，提取过程中保持各样品处于0～4℃温度状态；步骤二、对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，超声频率为20kHz，超声功率为50～350W，超声工作时间为1～3s，停歇时间为2～6s，所述超声处理持续10～30min；步骤三、从超声处理后的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液，处理后得到游离肌动蛋白。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述步骤二中，在进行所述超声处理之前，还向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述步骤二中，所述超声处理在真空条件下进行，真空度为0.1～0.3kPa。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述步骤二中，进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，在所述步骤二之后和步骤三之前还包括如下步骤：步骤A、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为30～50V、电流为0.5～0.7A、频率为15～20Hz，每次刺激10～30s，停歇20～60s，持续10～15min；之后从经过电刺激的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，在所述步骤A之后和所述步骤三之前还包括如下步骤：步骤B、对经过电刺激之后的肌动球蛋白溶液进行红外辐照10～20min，红外辐照的发射波长为：2～5μm、功率为500～900W、温度为30～40℃和风速为2～3m/s。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述步骤一中，从动物肉样品中提取肌动球蛋白，形成肌动球蛋白溶液的具体方法包括：将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，所述步骤三中，从超声处理后的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液的具体方法包括：在超声处理后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到所述游离肌动蛋白溶液。优选的是，所述的游离肌动蛋白的提取方法中，在所述步骤三中，得到游离肌动蛋白溶液后的处理步骤包括：将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到所述游离肌动蛋白。本发明至少包括以下有益效果：本发明通过超声处理肌动球蛋白溶液，促进了肌动球蛋白溶液的解离，以提取到较高浓度的游离肌动蛋白，且游离肌动蛋白的纯度也提高，满足了实验需求。同时，本发明于真空、低氧和添加氨基酸的条件下进行超声处理，使得肌动球蛋白溶液中残留的肌肉机构破坏，释放出更多肌动球蛋白，从而提高了游离肌动蛋白的含量。本发明在超声处理之后对肌动球蛋白进行电刺激，使得肌动球蛋白紧密结构进一步遭到破坏，使其处于更易于解离的状态，肌动蛋白和肌球蛋白的结合能力减弱，从而提高肌动蛋白的含量，且电刺激在溶液中进行，使得肌动球蛋白受刺激均一稳定，避免了过度破坏其结构。本发明还通过红外辐照提供热能，促进肌动球蛋白的解离。本发明通过超声处理、电刺激和红外辐照处理联合对肌动球蛋白进行处理，获得的游离肌动蛋白含量高、纯度高，极大地满足了实验需求。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明其中一个实施例中超声波处理对肌动球蛋白溶解度的影响(*与未超声对比，p<0.05)；图2为本发明其中一个实施例中超声波处理对肌动球蛋白的解离作用的SDS-PAGE结果；图3为本发明其中一个实施例中超声波对肌动球蛋白粒径的作用效果图；图4为本发明其中一个实施例中超声波对肌动球蛋白表面形态的作用照片，其中图4A展示未超声处理的蛋白，图4B展示超声处理的蛋白。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、从动物肌肉中提取肌动球蛋白，获得肌动球蛋白溶液，提取过程中保持各样品处于0～4℃温度状态；步骤二、对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，超声频率为20kHz，超声功率为50～350W，超声工作时间为1～3s，停歇时间为2～6s，所述超声处理持续10～30min；步骤三、从超声处理后的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液，处理后得到游离肌动蛋白。本发明通过超声处理肌动球蛋白溶液，促进了肌动球蛋白溶液的解离，以提取到较高浓度的游离肌动蛋白，且肌动蛋白的纯度也提高，满足了实验需求。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述步骤二中，在进行所述超声处理之前，还向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸。加入脯氨酸、色氨酸和丙氨酸能够促进肌动球蛋白在超声条件下的解离，且三种氨基酸有疏水性。对溶液整体pH无影响，对游离肌动蛋白溶液分离无影响。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述步骤二中，所述超声处理在真空条件下进行，真空度为0.1～0.3kPa。真空条件使得肌动球蛋白的结构稳定性受到破坏，与超声联合，进一步促进了肌动球蛋白的解离。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述步骤二中，进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。溶氧量低的条件下更易于超声的传播，从而提高超声效率。本发明于真空、低氧和添加氨基酸的条件下进行超声处理，使得肌动球蛋白溶液中残留的肌肉机构破坏，释放出更多肌动球蛋白，从而提高了游离肌动蛋白的含量。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，在所述步骤二之后和步骤三之前还包括如下步骤：步骤A、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为30～50V、电流为0.5～0.7A、频率为15～20Hz，每次刺激10～30s，停歇20～60s，持续10～15min；之后从经过电刺激的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液。在超声处理之后对肌动球蛋白进行电刺激，使得肌动球蛋白紧密结构进一步遭到破坏，使其处于更易于解离的状态，肌动蛋白和肌球蛋白的结合能力减弱，从而提高肌动蛋白的含量，且电刺激在溶液中进行，使得肌动球蛋白受刺激均一稳定，避免了过度破坏其结构。在上述方案中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，在所述步骤A之后和所述步骤三之前还包括如下步骤：步骤B、对经过电刺激之后的肌动球蛋白溶液进行红外辐照10～20min，红外辐照的发射波长为：2～5μm、功率为500～900W、温度为30～40℃和风速为2～3m/s。通过红外辐照提供热能，促进肌动球蛋白的解离。本发明通过超声处理、电刺激和红外辐照处理联合对肌动球蛋白进行处理，获得的游离肌动蛋白含量高、纯度高，能够满足实验需求。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述步骤一中，从动物肉样品中提取肌动球蛋白，形成肌动球蛋白溶液的具体方法包括：将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于TrisHCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。在上述实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，所述步骤三中，从超声处理后的肌动球蛋白溶液中提取得到游离肌动蛋白溶液的具体方法包括：在超声处理后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到所述游离肌动蛋白溶液。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该游离肌动蛋白的提取方法，在所述步骤三中，得到游离肌动蛋白溶液后的处理步骤包括：将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到所述游离肌动蛋白。为使本领域技术人员更好地理解本发明，现提供如下实施例1至12的技术方案。实施例1一、方案组成1.肌动球蛋白的提取取鸭肉胸大肌，去除表面肌膜、结缔组织等，切碎成肉糜待用。取2g肉糜溶于20mLWeber-Edsall溶液(0.6mol/LKCl，0.04mol/LNaHCO3，0.01mol/LNa2CO3，蛋白酶抑制剂50mL/片，pH7.2)中，12000rmp/min冰浴匀浆2次，每次30s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内，4℃恒温振荡24h。加两倍体积的蒸馏水，振荡，离心(4℃、12000rmp)20min，取沉淀加入15mLTris-HCl溶液，搅拌均匀后用两层纱布过滤，调整溶液质量浓度为6mg/mL。2.超声处理取以上提取得到的肌动球蛋白溶液6mL，超声频率为20kHz，超声功率为50W，超声时间为15min，超声工作时间为2s，停歇时间为4s。3.制备游离肌动蛋白在超声处理后的肌动球蛋白溶液中再加入5倍超纯水稀释，使提取液中KCl的浓度至0.1mol/L，然后4℃摇床振荡60min，离心(4℃，15000rmp，20min)，上清液即为游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例2一、方案组成1.肌动球蛋白的提取取鸭肉胸大肌，去除表面肌膜、结缔组织等，切碎成肉糜待用。取2g肉糜溶于20mLWeber-Edsall溶液(0.6mol/LKCl，0.04mol/LNaHCO3，0.01mol/LNa2CO3，蛋白酶抑制剂50mL/片，pH7.2)中，12000rmp/min冰浴匀浆2次，每次30s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内，4℃恒温振荡24h。加两倍体积的蒸馏水，振荡，离心(4℃、12000rmp)20min，取沉淀加入15mLTris-HCl溶液，搅拌均匀后用两层纱布过滤，调整溶液质量浓度为6mg/mL。2.超声处理取以上提取得到的肌动球蛋白溶液6mL，超声频率为20kHz，超声功率为150W，超声时间为15min，超声工作时间为2s，停歇时间为4s。3.制备游离肌动蛋白在超声处理后的肌动球蛋白溶液中再加入5倍超纯水稀释，使提取液中KCl的浓度至0.1mol/L，然后4℃摇床振荡60min，离心(4℃，15000rmp，20min)，上清液即为游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例3一、方案组成1.肌动球蛋白的提取取鸭肉胸大肌，去除表面肌膜、结缔组织等，切碎成肉糜待用。取2g肉糜溶于20mLWeber-Edsall溶液(0.6mol/LKCl，0.04mol/LNaHCO3，0.01mol/LNa2CO3，蛋白酶抑制剂50mL/片，pH7.2)中，12000rmp/min冰浴匀浆2次，每次30s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内，4℃恒温振荡24h。加两倍体积的蒸馏水，振荡，离心(4℃、12000rmp)20min，取沉淀加入15mLTris-HCl溶液，搅拌均匀后用两层纱布过滤，调整溶液质量浓度为6mg/mL。2.超声处理取以上提取得到的肌动球蛋白溶液6mL，超声频率为20kHz，超声功率为250W，超声时间为15min，超声工作时间为2s，停歇时间为4s。3.制备游离肌动蛋白在超声处理后的肌动球蛋白溶液中再加入5倍超纯水稀释，使提取液中KCl的浓度至0.1mol/L，然后4℃摇床振荡60min，离心(4℃，15000rmp，20min)，上清液即为游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例4一、方案组成1.肌动球蛋白的提取取鸭肉胸大肌，去除表面肌膜、结缔组织等，切碎成肉糜待用。取2g肉糜溶于20mLWeber-Edsall溶液(0.6mol/LKCl，0.04mol/LNaHCO3，0.01mol/LNa2CO3，蛋白酶抑制剂50mL/片，pH7.2)中，12000rmp/min冰浴匀浆2次，每次30s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内，4℃恒温振荡24h。加两倍体积的蒸馏水，振荡，离心(4℃、12000rmp)20min，取沉淀加入15mLTris-HCl溶液，搅拌均匀后用两层纱布过滤，调整溶液质量浓度为6mg/mL。2.超声处理取以上提取得到的肌动球蛋白溶液6mL，超声频率为20kHz，超声功率为300W，超声时间为15min，超声工作时间为2s，停歇时间为4s。3.制备游离肌动蛋白在超声处理后的肌动球蛋白溶液中再加入5倍超纯水稀释，使提取液中KCl的浓度至0.1mol/L，然后4℃摇床振荡60min，离心(4℃，15000rmp，20min)，上清液即为游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例5一、方案组成1.肌动球蛋白的提取取鸭肉胸大肌，去除表面肌膜、结缔组织等，切碎成肉糜待用。取2g肉糜溶于20mLWeber-Edsall溶液(0.6mol/LKCl，0.04mol/LNaHCO3，0.01mol/LNa2CO3，蛋白酶抑制剂50mL/片，pH7.2)中，12000rmp/min冰浴匀浆2次，每次30s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内，4℃恒温振荡24h。加两倍体积的蒸馏水，振荡，离心(4℃、12000rmp)20min，取沉淀加入15mLTris-HCl溶液，搅拌均匀后用两层纱布过滤，调整溶液质量浓度为6mg/mL。2.超声处理取以上提取得到的肌动球蛋白溶液5-10mL，超声频率为20kHz，超声功率为350W，超声时间为15min，超声工作时间为2s，停歇时间为4s。3.制备游离肌动蛋白在超声处理后的肌动球蛋白溶液中再加入5倍超纯水稀释，使提取液中KCl的浓度至0.1mol/L，然后4℃摇床振荡60min，离心(4℃，15000rmp，20min)，上清液即为游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18～30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80～-70℃下进行预冻，最后在大气压力为10～100Pa、温度为-70～-55℃条件下冷冻干燥24～72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例6本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、从动物肌肉中提取肌动球蛋白，获得肌动球蛋白溶液，提取过程中保持各样品处于0℃温度状态；步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，超声频率为20kHz，超声功率为50W，超声工作时间为1s，停歇时间为2s，所述超声处理持续10min；步骤三、在超声处理后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80℃下进行预冻，最后在大气压力为10Pa、温度为-70℃条件下冷冻干燥24h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例7本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.1kPa，超声频率为20kHz，超声功率为300W，超声工作时间为3s，停歇时间为6s，所述超声处理持续30min；步骤三、在超声处理后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-70℃下进行预冻，最后在大气压力为100Pa、温度为-55℃条件下冷冻干燥72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例8本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.3kPa，超声频率为20kHz，超声功率为175W，超声工作时间为2s，停歇时间为4s，所述超声处理持续15min；进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。步骤三、在超声处理后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析18h，之后再次收集液体样品，然后于温度-80℃下进行预冻，最后在大气压力为10Pa、温度为-70℃条件下冷冻干燥24h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例9本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.25kPa，超声频率为20kHz，超声功率为100W，超声工作时间为2s，停歇时间为3s，所述超声处理持续20min；进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。步骤三、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为30V、电流为0.5A、频率为15Hz，每次刺激10s，停歇20s，持续10min；步骤四、在电刺激后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析30h，之后再次收集液体样品，然后于温度-70℃下进行预冻，最后在大气压力为100Pa、温度为-55℃条件下冷冻干燥72h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例10本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.25kPa，超声频率为20kHz，超声功率为200W，超声工作时间为2.5s，停歇时间为5s，所述超声处理持续25min；进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。步骤三、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为50V、电流为0.7A、频率为20Hz，每次刺激30s，停歇60s，持续15min。步骤四、对经过电刺激之后的肌动球蛋白溶液进行红外辐照10min，红外辐照的发射波长为：2μm、功率为500W、温度为30℃和风速为2m/s。步骤五、在红外辐照后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析24h，之后再次收集液体样品，然后于温度-75℃下进行预冻，最后在大气压力为55Pa、温度为-62℃条件下冷冻干燥48h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例11本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.15kPa，超声频率为20kHz，超声功率为150W，超声工作时间为1.3s，停歇时间为3.5s，所述超声处理持续25min；进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。步骤三、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为40V、电流为0.6A、频率为17Hz，每次刺激20s，停歇40s，持续12.5min。步骤四、对经过电刺激之后的肌动球蛋白溶液进行红外辐照20min，红外辐照的发射波长为：5μm、功率为900W、温度为40℃和风速为3m/s。步骤五、在红外辐照后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析28h，之后再次收集液体样品，然后于温度-72℃下进行预冻，最后在大气压力为80Pa、温度为-65℃条件下冷冻干燥60h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。实施例12本实施例提供一种游离肌动蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤一、将动物肌肉切碎成肉糜，之后将肉糜溶于Weber-Edsall溶液中，冰浴匀浆，并4℃恒温振荡24h，然后4℃条件下离心，取沉淀，将沉淀溶于Tris-HCl溶液中，过滤，得到肌动球蛋白溶液。所述肉糜与所述Weber-Edsall溶液的质量体积比为1:10，调节所述肌动球蛋白溶液中肌动球蛋白的浓度至6mg/mL。步骤二、首先向所述肌动球蛋白溶液中加入浓度为0.1％(w/v)的脯氨酸、0.1％(w/v)的色氨酸和0.1％(w/v)的丙氨酸，之后在真空条件下进行对所述肌动球蛋白溶液进行超声处理，真空度为0.3kPa，超声频率为20kHz，超声功率为250W，超声工作时间为2s，停歇时间为4.5s，所述超声处理持续22min；进行所述超声处理时，肌动球蛋白溶液中的溶氧量不大于3％(v/v)。步骤三、对超声处理后的肌动球蛋白溶液进行电刺激，所述电刺激的电压为35V、电流为0.65A、频率为18Hz，每次刺激25s，停歇55s，持续12min。步骤四、对经过电刺激之后的肌动球蛋白溶液进行红外辐照16min，红外辐照的发射波长为：3.5μm、功率为700W、温度为35℃和风速为2.5m/s。步骤五、在红外辐照后的肌动球蛋白溶液中加入5倍体积的超纯水，之后于温度4℃摇床振荡培养60min，然后离心取上清液，即得到游离肌动蛋白溶液。将游离肌动蛋白溶液在蒸馏水中透析28h，之后再次收集液体样品，然后于温度-70℃下进行预冻，最后在大气压力为20Pa、温度为-55℃条件下冷冻干燥50h，得到游离肌动蛋白干燥粉末。对比例采用常规方法，从动物肌肉中提取游离肌动蛋白。检测实验：1.溶解度测定取各实施例制备过程中的肌动球蛋白溶液，进行溶解度测定，方法如下：准确称取相同质量的各实施例中处理后的肌动球蛋白溶液于100mL的具塞三角瓶中，将各样品溶液置于水浴摇床中，室温下转速为200rmp条件下振荡30min，然后在3500rmp条件下离心30min，采用凯氏定氮法测定溶液中上清液中蛋白质的含量，计算氮溶解性指数NSI，实验重复三次，取平均值。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)采用变性不连续电泳，12％分离胶，5％浓缩胶(m(丙烯酰胺)∶m(甲叉双丙烯酰胺)＝36.5∶1)。每孔等体积上样20μL，200V恒压约50min。电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色30min，然后用20％乙醇与80％蒸馏水的混合溶液进行脱色，直至可以清楚的辨别条带为止。采用分子量蛋白Markers(11-135kDa)作为对照。3.扫描电镜用真空冷冻干燥机对各实施例中制备的游离肌动蛋白进行干燥，置于E-1045型离子溅射仪的样品舱中，在15mA的电流下喷金90s。样品取出后，装入S-3400N扫描电镜观察室，进行微观结构的观察。4.计算各实施例与对比例相比，游离肌动蛋白得率和纯度的提高率。结果见表1。结果：由图1可知，与未超声处理的游离肌动球蛋白相比，不同功率(50W、150W、250W、300W和350W)的超声波处理可显著增加肌动球蛋白在溶液中的溶解度，其中超声功率为250W时，溶解度最大，即体现出游离肌动蛋白的含量增加。图2中，SDS-PAGE结果显示经超声波处理后，游离的肌动蛋白、肌球蛋白重链和轻链、肌钙蛋白和原肌球蛋白降解物的浓度也得到增加，且在超声功率为250W时，游离的肌动蛋白量最大。随后采用激光粒度仪观察超声波对肌动球蛋白颗粒直径的影响，结果显示，与未超声处理的相比较，经超声波处理的肌动球蛋白的颗粒直径显著减小(图3)。扫描电子显微镜结果表明，肌动球蛋白表面形貌从紧实的棒状颗粒变成蓬松的椭圆颗粒(图4A和图4B)。表1游离肌动蛋白得率和纯度的提高率实施例游离肌动蛋白得率提高率(％)游离肌动蛋白纯度提高率(％)110.2010215.312.1318.915417.213.7516.913.4618.90117201282112.592314.3102414.81123.814.11223.214.5综上所述，本发明通过超声处理肌动球蛋白溶液，促进了肌动球蛋白溶液的解离，以提取到较高浓度的游离肌动蛋白，且游离肌动蛋白的纯度也提高，满足了实验需求。本发明在探索超声处理能够满足实验中对游离肌动蛋白的需求后，进一步探索了氨基酸、真空和溶氧量等在超声处理肌动球蛋白中的作用，证实上述因素可促进超声对肌动球蛋白的解离。进一步地，本发明也探索了电刺激、红外辐照等与超声处理联合作用，具有进一步提高游离肌动蛋白的得率和纯度的效果。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页1 2 3