珍珠蛋白的制备方法、由该方法制备的珍珠蛋白及其应用与流程

本发明涉及医药和化妆品技术领域，具体而言，本发明涉及珍珠蛋白的制备方法、由该方法制备的珍珠蛋白及其应用。

背景技术：

珍珠收载于中国药典(2015年版)，为珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii(Dunker)、蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)或褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)等双壳类动物受刺激形成的，其性味甘、咸、寒；入心、肝经，珍珠为我国传统中药，具有安神定惊，明目消翳，解毒生肌，润肤祛斑等功效。现代药理学研究表明珍珠具有镇静安神、抗氧化、抗炎、促进伤口愈合作用、降血压等作用。珍珠为贝壳类海洋药物，含有90％以上的碳酸钙，除此之外，还含有少量水溶性蛋白、角壳蛋白、肽类、微量元素等。

我国是珍珠大国，以三角帆蚌为主要资源，主产于我国华南、华东等地，以江苏渭塘和浙江诸暨两主产地为代表。早期人们对于珍珠的使用大多在装饰品、宝石等，随着科技的发展和人们生活水平的提高，珍珠多方面的药用功效逐渐被认可，如因其美白、润肤的功效广泛用于化妆品添加剂、面膜等护肤类产品。美白祛斑的原理一般认为是抑制了黑色素的生成。黑色素是以酪氨酸为基质，在酪氨酸酶的作用下转化为多巴、多巴醌、吲哚醌、多巴色素等，各种中间氧化物质聚合，最终形成了黑色素。在这个过程中，酪氨酸酶是黑色素合成过程中的主要限速酶，因此抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的生成，可以达到美白的目的。

但是，目前以珍珠为原料的美白产品多是以全粉使用，包括普通珍珠粉，粒度200目以上，可以达到国家基本要求；超细珍珠粉，细度1000目以上(或粒径15微米以下)；纳米珍珠粉，细度15万目以上(或100纳米以下)。一般认为，珍珠粉越细，其粉质越细腻，吸收率更高，功效更好。但是对于珍珠美白活性的药效物质基础尚不明确，缺乏系统研究，关于相关产品的开发基本空白，导致了珍珠使用的盲目性和活性成分利用效率低下。

技术实现要素：

为了克服以上不足，本申请的发明人在前期研究基础上，按照珍珠中蛋白的性质进行分类，并开展抗酪氨酸酶活性的筛选，以确定珍珠美白活性的药效物质基础，并作为开发珍珠美白祛斑产品的原料，大大提高了珍珠的利用价值，增加经济效益。

因此，本发明的一个目的是提供一种制备珍珠角壳蛋白的方法，该方法具有工艺简单，成本低，重复性好，易于工业化生产等特点。

本发明的另一个目的是提供珍珠角壳蛋白，其由上述制备珍珠角壳蛋白的方法制备。

本发明的又一个目的是提供上述珍珠角壳蛋白在制备美白产品中的用途。

本发明的再一个目的是提供一种制备珍珠蛋白的方法，所述珍珠蛋白包括水溶蛋白、酸溶蛋白和角壳蛋白，该方法具有工艺简单，成本低，重复性好，易于工业化生产等特点。

本发明的再一个目的是提供珍珠水溶蛋白、珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白，其由上述制备珍珠蛋白的方法制备。

本发明的再一个目的是提供上述珍珠水溶蛋白、珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白在制备美白产品中的用途。

根据本发明的一个方面，提供了一种制备珍珠角壳蛋白的方法，其包括：

在适量珍珠粉末中加入5-100倍体积(优选10-50倍体积，更优选10-20倍体积，最优选10倍体积)的酸(优选5％-30％盐酸或醋酸，更优选10％盐酸或醋酸)，在搅拌下，在0℃-8℃(优选2℃-6℃，更优选4℃)下处理8-24小时(优选12-20小时，更优选12小时)，离心(优选4000rev/min-12000rev/min，更优选8000rev/min-12000rev/min，最优选12000rev/min)得到沉淀，所得沉淀冻干即为角壳蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种珍珠角壳蛋白，其由上述制备珍珠角壳蛋白的方法制备。

本发明中，通过上述方法得到的珍珠角壳蛋白中的氨基酸含量很高，主要含甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等，并经实验验证具有很高的抑制酪氨酸酶的活性。

根据本发明的又一个方面，提供了上述珍珠角壳蛋白在制备美白产品中的用途。

本发明中，优选地，上述美白产品为食品、药品、化妆品或保健品等。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备珍珠水溶蛋白的方法，其包括：

在适量珍珠粉末中加入5-100倍体积(优选10-50倍体积，更优选10-20倍体积，最优选10倍体积)的水，在0℃-8℃(优选2℃-6℃，更优选4℃)下冷浸16-48小时(优选20-48小时，更优选24小时)后将提取液过滤，滤液采用硫酸铵沉淀法或直接冻干法制得珍珠水溶蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种珍珠水溶蛋白，其由上述制备水溶蛋白的方法制备。

根据本发明的另一个方面，提供了上述珍珠水溶蛋白在制备美白产品中的用途。

本发明中，优选地，上述美白产品为食品、药品、化妆品或保健品等。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白的方法，其包括：

在上述制备珍珠水溶蛋白的方法中将提取液过滤后，取滤渣，加入5-100倍体积(优选10-50倍体积，更优选10-20倍体积，最优选10倍体积)的酸(优选5％-30％盐酸或醋酸，更优选10％盐酸或醋酸)，在搅拌下，在0℃-8℃(优选2℃-6℃，更优选4℃)下处理8-24小时(优选12-20小时，更优选12小时)，离心(优选4000rev/min-12000rev/min，更优选8000rev/min-12000rev/min，最优选12000rev/min)得到上清液和沉淀，将所得上清液用截留分子量小于3000的透析袋透析40-80小时(优选40-50小时，更优选48小时)，将透析袋内所得物质冻干即为酸溶蛋白；将所得沉淀冻干即得珍珠角壳蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白，其由上述制备酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白的方法制备。

根据本发明的另一个方面，提供了上述珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白在制备美白产品中的用途。

本发明中，优选地，上述美白产品为食品、药品、化妆品或保健品等。

根据本发明的再一个方面，提供了一种制备珍珠蛋白的方法，其包括：

步骤1)在适量珍珠粉末中加入5-100倍体积(优选10-50倍体积，更优选10-20倍体积，最优选10倍体积)的水，在0℃-8℃(优选2℃-6℃，更优选4℃)下冷浸16-48小时(优选20-48小时，更优选24小时)后将提取液过滤，滤液采用硫酸铵沉淀法或直接冻干法制得珍珠水溶蛋白；

步骤2)在步骤1)中将提取液过滤后，取滤渣，加入5-100倍体积(优选10-50倍体积，更优选10-20倍体积，最优选10倍体积)的酸(优选5％-30％盐酸或醋酸，更优选10％盐酸或醋酸)，在搅拌下，在0℃-8℃(优选2℃-6℃，更优选4℃)下处理8-24小时(优选12-20小时，更优选12小时)，离心(优选4000rev/min-12000rev/min，更优选8000rev/min-12000rev/min，最优选12000rev/min)得到上清液和沉淀，将所得上清液用截留分子量小于3000的透析袋透析40-80小时(优选40-50小时，更优选48小时)，将透析袋内所得物质冻干即为酸溶蛋白，所得沉淀冻干即为角壳蛋白。

根据本发明的再一个方面，提供了珍珠水溶蛋白、珍珠酸溶蛋白或珍珠角壳蛋白，其由上述制备珍珠蛋白的方法制备。

经实验验证，通过上述珍珠蛋白的制备方法制备的珍珠蛋白中，角壳蛋白中氨基酸含量最高，不同部位氨基酸含量差异较大，角壳蛋白主要含甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸，水溶蛋白主要包括甘氨酸和丙氨酸，其中天冬氨酸、亮氨酸、丝氨酸含量也相对较高，酸溶蛋白中氨基酸含量较少。

根据本发明的还一个方面，提供了上述珍珠蛋白在制备美白产品中的用途。

本发明中，优选地，上述美白产品为食品、药品、化妆品或保健品等。

本发明所获得的珍珠蛋白为纯天然产品，经活性筛选均具有抑制酪氨酸酶的活性，特别是，角壳蛋白具有较高的抑制酪氨酸酶的活性。本发明采用的提取分离方法工艺简单，成本低，重复性好，易于工业化生产。通过该方法得到的产品可以作为美白产品的原料，可用于医药和化妆品。

附图说明

图1为根据本发明实施例1的提取工艺的工艺流程图。

图2为按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，对实施例1中提取的水溶蛋白、酸溶蛋白和角壳蛋白的氨基酸进行测定的结果的图。

图3为按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，对实施例2中提取的角壳蛋白的氨基酸进行测定的结果的图。

图4为根据本发明的实施例1提取的珍珠中水溶蛋白、酸溶蛋白和角壳蛋白的酪氨酸酶抑制率曲线。

图5为根据本发明的实施例2提取的角壳蛋白的酪氨酸酶抑制率曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。

实施例

材料、仪器和试剂：

本实施例中所用珍珠产地为浙江诸暨，经中国科学院上海药物研究所果德安研究员鉴定来源为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)。

盐酸、氢氧化钠、甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、透析袋(截留分子量3000)、冰醋酸、硫酸铵、L-酪氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸酶购自Sigma公司；维生素C购自上海源叶生物；水：Mili-Q超纯水仪制备。

BRANSON B3500S-DTH超声波清洗仪：荷兰必能信有限公司；涡旋混合器：SCIENTIFIC INDUSTTRIES，INC；冷冻干燥机：德国Alpha。酶标仪：BioTek SYNFRGY4(BioTek，Winooski，USA)。

实施例1：珍珠蛋白的提取

1、水溶蛋白的提取：

水溶蛋白的提取采用冷浸法，具体方法为：取药材粉末(按照《中国药典》2010年版要求，珍珠粉碎成最细粉)100g，加入10倍体积水，在4℃下冷浸24小时后将提取液过滤，滤液分别采用硫酸铵沉淀或直接冻干的方法进行处理，取上述制得的产物，按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，测定两种方法所得蛋白中氨基酸的含量，结果见表1，可以看出，直接冻干法所得蛋白中氨基酸含量高于硫酸铵沉淀，且操作相对简便。

表1不同制备方法所得水溶蛋白中氨基酸含量

2、酸溶蛋白、角壳蛋白的提取：

酸溶蛋白和角壳蛋白来源于水不溶的部分，具体制备方法为：在上述部分1中水溶蛋白提取完成后，过滤，取滤渣，加入10倍体积的10％的酸(盐酸或醋酸)，在搅拌下于4℃处理12h，通过在12000rev/min下高速离心得到上清液和沉淀，所得上清液用透析袋(截留分子量小于3000)透析48h，除去离子，透析袋内所得物质冻干即为酸溶蛋白，所得沉淀冻干即为角壳蛋白。

考察了10％的盐酸和10％醋酸，分别取上述制得的酸溶蛋白和角壳蛋白，按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，分别测定所得蛋白中氨基酸的含量，结果见表2和表3，从结果可以看出无论是酸溶蛋白还是角壳蛋白，使用盐酸时所得蛋白中氨基酸的含量都高于醋酸。

表2不同酸处理所得酸溶蛋白中氨基酸含量

表3不同酸处理所得角壳蛋白中氨基酸含量

结论

经过提取条件的优化，最终确定珍珠和珍珠母中三类蛋白(即，水溶蛋白、酸溶蛋白、角壳蛋白、)的提取工艺，工艺流程如图1所示。

3、三类蛋白的含量测定：

按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，对三类蛋白的氨基酸进行了测定，结果如表4所示。提取的角壳蛋白中氨基酸含量最高，不同部位氨基酸含量差异较大，角壳蛋白主要含甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸，水溶蛋白主要包括甘氨酸和丙氨酸，其中天冬氨酸、亮氨酸、丝氨酸含量也相对较高，酸溶蛋白中氨基酸含量都较少，色谱图如图2所示。珍珠中三种蛋白的得率分别为：角壳蛋白1.30％，酸溶蛋白0.40％，水溶蛋白0.16％。

表4珍珠中三类蛋白中氨基酸的含量比较(％)

实施例2：珍珠中角壳蛋白的制备

角壳蛋白的制备，具体方法为：取药材粉末(按照《中国药典》2010年版要求，珍珠粉碎成最细粉)100g，加入10倍体积的10％的酸(盐酸或醋酸)，在搅拌下于4℃处理12h，通过在12000rev/min下高速离心，所得沉淀冻干即为角壳蛋白。

考察了10％的盐酸和10％醋酸，取上述制得的角壳蛋白，按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，分别测定所得蛋白中氨基酸的含量，结果见表5，从结果可以看出，使用盐酸时蛋白中氨基酸的含量都高于醋酸。

表5不同酸处理所得角壳蛋白中氨基酸的含量

角壳蛋白的含量测定

按照文献中报道的氨基酸的含量测定方法[Journal of Separation Science.2015,38:1552-1560.]，对组成角壳蛋白的氨基酸进行测定，结果如表6所示。组成蛋白的氨基酸主要有甘氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，色谱图如图3所示。珍珠中角壳蛋白的得率为1.30％。

表6珍珠中角壳蛋白氨基酸含量(％)

实施例3：实施例1制备的珍珠蛋白的美白活性的测定

磷酸缓冲溶液的配制：

取磷酸氢二钠13.40g于250mL量瓶中，加去离子水溶解，定容至刻度，摇匀；取磷酸二氢钠6.90g于250mL量瓶中，加去离子水溶解，定容至刻度，摇匀；精密移取上述两溶液各50mL于250mL量瓶中，加去离子水稀释至刻度，即得pH 6.8的磷酸缓冲溶液。

L-酪氨酸溶液的配制：

取L-酪氨酸3.7mg精密称定，于50mL量瓶中，加磷酸缓冲溶液溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为74μg/mL的L-酪氨酸溶液。

酪氨酸酶溶液的配制：

本实验用酪氨酸酶规格为5771U/mg，称取酪氨酸酶0.6065mg于10mL量瓶中，在冰水浴中加磷酸缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得350U/mL酪氨酸酶溶液。

样品和对照品的配制：

精密称取实施例1中制得的珍珠水溶蛋白、酸溶蛋白和角壳蛋白适量，分别配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg/ml六个浓度的溶液，阳性对照Vc配成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg/ml六个浓度的溶液，其中水溶性蛋白和Vc溶于水，酸溶蛋白和角壳蛋白溶于DMSO。

珍珠中三种蛋白美白活性的测定：

将各浓度样品溶液和阳性对照分别按照表7所示的体积，将样品、缓冲液和L-酪氨酸加入96孔板中，反应10min后，加入酪氨酸酶，继续反应10min，迅速放入酶标仪中，读取475nm下的各反应体系的吸光度值，并按照如下公式计算各部位蛋白的酪氨酸酶抑制率。

抑制率％＝(C-D)/A×100％

A：酪氨酸酶在空白溶剂中的吸光度

C：酪氨酸酶在样品溶液中的吸光度

D：空白溶剂的吸光度

表7酪氨酸酶抑制反应体系所加溶剂

实验结果：

根据测定的吸光度值计算，绘制珍珠三类蛋白的酪氨酸酶抑制率曲线，如图4所示，可以看出，酸溶蛋白浓度大于0.8mg/ml时抑制率下降，因此考虑蛋白的主要美白活性成分为水溶蛋白和角壳蛋白两部分，但水溶蛋白抑制率较低，二者比较可知，角壳蛋白的酪氨酸酶抑制活性较高。

结论：

对珍珠中三类蛋白进行了酪氨酸酶活性的测定，以期确定珍珠中美白活性的药效物质基础，通过研究发现珍珠中角壳蛋白是美白的主要活性成分。

实施例4：实施例2制备的角壳蛋白的美白活性的测定

磷酸缓冲溶液的配制：

取磷酸氢二钠13.40g于250mL量瓶中，加去离子水溶解，定容至刻度，摇匀；取磷酸二氢钠6.90g于250mL量瓶中，加去离子水溶解，定容至刻度，摇匀；精密移取上述两溶液各50mL于250mL量瓶中，加去离子水稀释至刻度，即得pH 6.8的磷酸缓冲溶液。

L-酪氨酸溶液的配制：

取L-酪氨酸3.7mg精密称定，于50mL量瓶中，加磷酸缓冲溶液溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为74μg/mL的L-酪氨酸溶液。

酪氨酸酶溶液的配制：

本实验用酪氨酸酶规格为5771U/mg，称取酪氨酸酶0.6065mg于10mL量瓶中，在冰水浴中加磷酸缓冲溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得350U/mL酪氨酸酶溶液。

样品和对照品的配制：

精密称取实施例2中制得的珍珠角壳蛋白适量，用DMSO分别配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg/ml六个浓度的溶液，阳性对照Vc用水配成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg/ml六个浓度的溶液。

角壳蛋白抗酪氨酸酶活性的测定：

将各浓度样品溶液和阳性对照分别按照表8所示的体积，将样品、缓冲液和L-酪氨酸加入96孔板中，反应10min后，加入酪氨酸酶，继续反应10min，迅速放入酶标仪中，读取475nm下的各反应体系的吸光度值，并按照如下公式计算各部位蛋白的酪氨酸酶抑制率。

抑制率％＝(C-D)/A×100％

A：酪氨酸酶在空白溶剂中的吸光度

C：酪氨酸酶在样品溶液中的吸光度

D：空白溶剂的吸光度

表8酪氨酸酶抑制反应体系所加溶剂

实验结果：

根据测定的吸光度值计算，绘制酪氨酸酶抑制率曲线，如图5所示，可以看出，角壳蛋白对酪氨酸酶具有中等强度的抑制活性。