本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体是一种棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法。
背景技术：
棉籽提取了油脂之后的棉籽粕中含有大量的蛋白质，其含量约为 50% 左右，是一种极为丰富的植物性蛋白质资源。棉籽蛋白的性质与大豆蛋白类似，也是一种营养价值高、品质优良的蛋白质食物或饲用蛋白源。
棉籽粕中的蛋白质主要分为三种，2S 蛋白质游离在细胞壁之外，占 15% 左右，剩下的85% 左右的 7S、12S 蛋白质存在于细胞壁内，由于棉籽蛋白的细胞壁十分坚韧，采用类似于大豆粕提取大豆蛋白的碱溶酸沉工艺，棉籽蛋白的提取率不高。如果采用强碱、弱酸、高温的办法打破其细胞壁，由于反应条件强烈，组成蛋白质的氨基酸序列会被破坏，蛋白质将失去其功能和活性。采用酶解工艺，通过生物作用打破细胞壁并水解蛋白质，是一种较为理想的提取棉籽蛋白的方法，但是由于市售蛋白酶制剂价格较高，造成生产成本难以下降。
另外，棉铃虫属鳞翅目夜蛾科， 广泛分布在中国及世界各地，中国棉区和蔬菜种植区均有存在。棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。棉铃虫肠道中含有降解棉籽蛋白的酶，可将棉籽中的大分子蛋白转化为小分子的蛋白和氨基酸以利于自身的吸收。因棉铃虫病毒是一种昆虫杀虫剂，其防治效果好、药效持久，对其他生物无任何毒副作用，是世界上第一个登记注册的昆虫病毒生物农药，所以棉铃虫的养殖问题受到国内外研究人员广泛关注，目前已经解决棉铃虫群养技术难题，实现了规模化饲养。
现有技术如授权公告号为CN102550794B的中国发明专利，公开了一种提取棉籽蛋白的方法，包括：(1) 将棉籽粕粉碎；(2)超声波处理棉籽粕；(3)提取棉铃虫活性酶；(4)棉籽粕酶解；(5)升温灭酶，然后离心分离，得到上清液和滤渣；(6)将滤渣再加水洗，水洗液与步骤(5)中得到的上清液合并；(7)将合并后的上清液经微滤膜除杂、纳滤膜浓缩、干燥后即得到粉状棉籽蛋白。该方法使得棉籽蛋白的生产具有较高的提取率，而且产品具有较强的功能活性，同时解决了现有生物酶解工艺方案需高价购买蛋白酶，造成生产成本偏高的问题。该方法酶解前只采用超声波处理棉籽粕，对棉籽粕细胞壁的破坏不充分，使得棉籽蛋白的提取率不理想；在微滤之前没有对棉籽蛋白进行纯化分离，微滤速度慢，且容易堵塞滤孔。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取率高，提取的棉籽蛋白纯度高、活性强、蛋白提取率高，无溶剂残留的棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，具体步骤：
1）预处理：将棉籽粕粉碎，加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮体积比为1:0.9~1:1.5，棉籽粕粉末：混合液体积比为1:12~16，回流提取，脱脂温度为50~60℃，每次脱脂40~50min，重复1~3次。旋蒸浓缩干燥，得到脱脂棉籽粕粉末。棉籽粕中残留的油脂在酶解过程中会被氧化，降低酶解液的品质，还会与蛋白质乳化，造成蛋白质的损失，所以酶解前需要对棉籽粕进行脱脂。上述脱脂剂对棉籽粕粉末的脱脂率高，脱脂剂用量少；
2）木质素酶酶解：在脱脂棉籽粕粉末中加入蒸馏水、木质素酶和助溶剂，固体：蒸馏水质量体积比为1g：（40~60）mL，木质素酶加入量为0.05~0.07%，酶解温度为36~42℃，pH为3.3~4.0，酶解时间为10~14h。超声波助溶，超声波功率为380~420W，超声波作用时间为30~40min，过滤。木质素酶能将棉籽粕中的木质素水解，使棉籽细胞失去支持而分散开来，增大棉籽细胞与溶剂的接触面积；超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，能够穿透棉籽细胞壁，让蒸馏水以最快的速度进入到棉籽细胞中；超声波联合木质素酶酶解对棉籽细胞细胞壁的破坏彻底，棉籽细胞的细胞质流出量大，从而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉铃虫活性酶液制备：将棉铃虫洗净、匀浆，加入蒸馏水，匀浆：蒸馏水体积比为1:8~13，温度为56~60℃，pH为7.6~7.9。超声波助溶，超声波功率为240~280W，超声时间为22~30min。离心取上清液即为棉铃虫活性酶液；
4）棉铃虫酶液酶解：在步骤2得到的滤液中加入步骤3得到的棉铃虫活性酶液，棉铃虫酶液：滤液体积比为1:400~420酶解温度为56~60℃，pH为5.4~5.9，酶解时间为1.2~1.8h。酶解结束后灭酶，过滤。棉铃虫活性酶液能够酶解棉籽蛋白，将大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉铃虫活性酶液酶解后的棉籽蛋白会具有较强的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等电点沉淀：调节步骤4得到的滤液的pH为4.4~4.6，搅拌，静置，离心，沉淀即为棉籽蛋白，在pH为4.4~4.6时，棉籽蛋白呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，变为沉淀从水溶液中脱离出来；
6）滤膜除杂、浓缩：在步骤5得到的棉籽蛋白中加入蒸馏水，通过微滤膜装置进行除杂，滤过液在经过纳滤膜装置进行浓缩并去盐，微滤膜装置的工作条件为：压力0.2~0.24Mpa，温度为42~49℃，流量为86~92L/min，微滤膜过滤孔径为0.8~1.0nm；纳滤膜装置的工作条件为：压力1.6~1.9Mpa，温度42~49℃，流量为18~20L/min，纳滤膜孔径为0.1~0.4nm。干燥得粉状棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人体吸收，纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全。
优选的，助溶剂成份及其重量份为：12~16份单月桂酸丙二醇酯、0.002~0.004份柴胡皂苷、5~9份壬基酚聚氧乙烯醚、0.005~0.007份烟酸和8~13份大豆卵磷脂，加入量为0.00003~0.00007%。上述助溶剂既能将棉籽蛋白的疏水段包裹起来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，又能增强蛋白质-水之间的离子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用石油醚-丙酮混合液对棉籽粕粉末进行脱脂，脱脂率高，脱脂剂用量少；超声波联合木质素酶酶解对棉籽细胞细胞壁的破坏彻底，棉籽细胞细胞质流出量大，从而使棉籽蛋白的提取率提高；棉铃虫活性酶液能够酶解棉籽蛋白，将大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉铃虫活性酶液酶解后的棉籽蛋白会具有较强的功能活性，如抗氧化性、抑菌；最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人体吸收，纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，具体步骤：
1）预处理：将棉籽粕粉碎，加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮体积比为1:0.9~1:1.5，棉籽粕粉末：混合液体积比为1:12~16，回流提取，脱脂温度为50~60℃，每次脱脂40~50min，重复1~3次。旋蒸浓缩干燥，得到脱脂棉籽粕粉末。棉籽粕中残留的油脂在酶解过程中会被氧化，降低酶解液的品质，还会与蛋白质乳化，造成蛋白质的损失，所以酶解前需要对棉籽粕进行脱脂。上述脱脂剂对棉籽粕粉末的脱脂率高，脱脂剂用量少；
2）木质素酶酶解：在脱脂棉籽粕粉末中加入蒸馏水、木质素酶和助溶剂，固体：蒸馏水质量体积比为1g：（40~60）mL，木质素酶加入量为0.05~0.07%，酶解温度为36~42℃，pH为3.3~4.0，酶解时间为10~14h。超声波助溶，超声波功率为380~420W，超声波作用时间为30~40min，过滤。木质素酶能将棉籽粕中的木质素水解，使棉籽细胞失去支持而分散开来，增大棉籽细胞与溶剂的接触面积；超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，能够穿透棉籽细胞壁，让蒸馏水以最快的速度进入到棉籽细胞中；超声波联合木质素酶酶解对棉籽细胞细胞壁的破坏彻底，棉籽细胞的细胞质流出量大，从而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉铃虫活性酶液制备：将棉铃虫洗净、匀浆，加入蒸馏水，匀浆：蒸馏水体积比为1:8~13，温度为56~60℃，pH为7.6~7.9。超声波助溶，超声波功率为240~280W，超声时间为22~30min。离心取上清液即为棉铃虫活性酶液；
4）棉铃虫酶液酶解：在步骤2得到的滤液中加入步骤3得到的棉铃虫活性酶液，棉铃虫酶液：滤液体积比为1:400~420酶解温度为56~60℃，pH为5.4~5.9，酶解时间为1.2~1.8h。酶解结束后灭酶，过滤。棉铃虫活性酶液能够酶解棉籽蛋白，将大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉铃虫活性酶液酶解后的棉籽蛋白会具有较强的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等电点沉淀：调节步骤4得到的滤液的pH为4.4~4.6，搅拌，静置，离心，沉淀即为棉籽蛋白，在pH为4.4~4.6时，棉籽蛋白呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，变为沉淀从水溶液中脱离出来；
6）滤膜除杂、浓缩：在步骤5得到的棉籽蛋白中加入蒸馏水，通过微滤膜装置进行除杂，滤过液在经过纳滤膜装置进行浓缩并去盐，微滤膜装置的工作条件为：压力0.2~0.24Mpa，温度为42~49℃，流量为86~92L/min，微滤膜过滤孔径为0.8~1.0nm；纳滤膜装置的工作条件为：压力1.6~1.9Mpa，温度42~49℃，流量为18~20L/min，纳滤膜孔径为0.1~0.4nm。干燥得粉状棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人体吸收，纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全。
助溶剂成份及其重量份为：12~16份单月桂酸丙二醇酯、0.002~0.004份柴胡皂苷、5~9份壬基酚聚氧乙烯醚、0.005~0.007份烟酸和8~13份大豆卵磷脂，加入量为0.00003~0.00007%。上述助溶剂既能将棉籽蛋白的疏水段包裹起来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，可能是叠加产生了意想不到的有益成分或协同交互作用，柴胡皂苷和烟酸通过单月桂酸丙二醇酯、壬基酚聚氧乙烯醚又能增强蛋白质-水之间的离子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。
实施例2：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，最优选步骤：
1）预处理：将10kg棉籽粕粉碎，加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮体积比为1:1.5，棉籽粕粉末：混合液体积比为1:12，回流提取，脱脂温度为54℃，每次脱脂45min，重复2次。旋蒸浓缩干燥，得到脱脂棉籽粕粉末。棉籽粕中残留的油脂在酶解过程中会被氧化，降低酶解液的品质，还会与蛋白质乳化，造成蛋白质的损失，所以酶解前需要对棉籽粕进行脱脂。上述脱脂剂对棉籽粕粉末的脱脂率高，脱脂剂用量少；
2）木质素酶酶解：在脱脂棉籽粕粉末中加入蒸馏水、木质素酶和助溶剂，固体：蒸馏水质量体积比为1g：52mL，木质素酶加入量为0.06%，酶解温度为39℃，pH为3.7，酶解时间为13h。超声波助溶，超声波功率为400W，超声波作用时间为30min，过滤。助溶剂成份及其最优选重量份为：14份单月桂酸丙二醇酯、0.003份柴胡皂苷、8份壬基酚聚氧乙烯醚、0.006份烟酸和10份大豆卵磷脂，加入量为0.00005%。上述助溶剂既能将棉籽蛋白的疏水段包裹起来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，又能增强蛋白质-水之间的离子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。木质素酶能将棉籽粕中的木质素水解，使棉籽细胞失去支持而分散开来，增大棉籽细胞与溶剂的接触面积；超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，能够穿透棉籽细胞壁，让蒸馏水以最快的速度进入到棉籽细胞中；超声波联合木质素酶酶解对棉籽细胞细胞壁的破坏彻底，棉籽细胞的细胞质流出量大，从而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉铃虫活性酶液制备：将棉铃虫洗净、匀浆，加入蒸馏水，匀浆：蒸馏水体积比为1:11，温度为58℃，pH为7.8。超声波助溶，超声波功率为260W，超声时间为28min。离心取上清液即为棉铃虫活性酶液；
4）棉铃虫酶液酶解：在步骤2得到的滤液中加入步骤3得到的棉铃虫活性酶液，棉铃虫酶液：滤液体积比为1:420酶解温度为58℃，pH为5.6，酶解时间为1.7h。酶解结束后沸水浴7min灭酶，过滤。棉铃虫活性酶液能够酶解棉籽蛋白，将大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉铃虫活性酶液酶解后的棉籽蛋白会具有较强的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等电点沉淀：调节步骤4得到的滤液的pH为4.5，搅拌，静置，离心，沉淀即为棉籽蛋白，在pH为4.5时，棉籽蛋白呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，变为沉淀从水溶液中脱离出来；
6）滤膜除杂、浓缩：在步骤5得到的棉籽蛋白中加入蒸馏水，通过微滤膜装置进行除杂，滤过液在经过纳滤膜装置进行浓缩并去盐，微滤膜装置的工作条件为：压力0.22Mpa，温度为45℃，流量为89L/min，微滤膜过滤孔径为0.9nm；纳滤膜装置的工作条件为：压力1.8Mpa，温度45℃，流量为19L/min，纳滤膜孔径为0.2nm。干燥得粉状棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人体吸收，纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。