本发明涉及生物活性肽制备技术领域，尤其是涉及一种双酶分步酶解螃蟹壳制备抗氧化活性肽的方法。
背景技术：
海洋甲壳动物资源丰富，据世界粮农组织FAO渔业部统计，1996年世界海洋甲壳动物总产量达到510.7万吨，其中蟹类占总产量的23.88％。蟹类经加工后会产生大量的下脚料，如蟹脚、蟹背壳等，由于技术及认识等方面原因，这些虾蟹壳大多数往往被随意丢弃，造成了极大的污染和资源浪费。而国内生产企业对蟹壳加工利用尚处于初级阶段，现有的加工利用方法除了少部分粗粉碎作为鱼粉加工原料外，多数被用于生产甲壳素，而甲壳素生产企业大多面临环保压力而停止生产。因此如何把这一资源进行最大化利用，开发新产品已成为水产品加工业急需解决的问题。
近年来，对水产品加工下脚料综合利用的研究渐成热点，主要是利用蛋白酶来提取蛋白水解物，用于调味料或食品添加剂的开发。虾蟹壳中富含丰富的蛋白质，以及众多对人体有益的营养素及铁、锌、铜等微量元素，利用生物酶解技术，将蟹壳资源有效的加以开发利用，制备成为具有抗氧化功能，且营养丰富的产品，将大大提高其应用价值，有效增加了螃蟹的经济价值。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种工艺步骤简单，过程稳定可控，节能、高效、绿色环保的双酶分步酶解螃蟹壳制备抗氧化活性肽的方法，利用蟹壳制备抗氧化钛，实现螃蟹加工废弃物资源的综合利用，提高其应用价值，有效增加了螃蟹的经济价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种双酶分步酶解螃蟹壳制备抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将蟹壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎，得蟹壳粉，待用。
(2)双酶酶解：将蟹壳粉与水按质量比1：(5～10)混合后，调节pH为2.0～3.0，在30～40℃保温10～20min，加入为蟹壳粉质量0.1～0.3％的酸性蛋白酶，保温酶解6～8h，升至95～100℃灭酶15～20min，冷却至50～60℃，调节pH至6.5～7.5，加入为蟹壳粉质量0.1～0.3％的风味蛋白酶，于50～60℃保温酶解2～4h，升温至95～100℃灭酶10～20min，得酶解液。本发明的关键点在于酶解过程，不同的蛋白酶对蛋白质的作用位点不同，单酶水解作用位点较单一，导致蛋白质的水解度较低，本发明采用双酶酶解技术，由于酸性蛋白酶和风味蛋白酶的作用位点差异较大，因此可以有效提高蟹壳蛋白的水解度，从而获得小分子的活性肽。所述的酸性蛋白酶为由黑曲霉培养发酵后采用现代生物技术精制而成的安全、高效生物食品级酶制剂，其分子量35kDa左右，酶活力为20000～50000U/g；所述的风味蛋白酶为由米曲霉菌株发酵，经提纯、复配而成的食品级复合风味蛋白酶，酶活力为≥30000U/g。
(3)离心分离：将酶解液进行高速离心分离，取上层清液，得抗氧化肽粗提液。
(4)膜分离：将抗氧化肽粗提液利用超滤膜进行分离提纯，得到蟹壳抗氧化肽溶液。膜分离去除无抗氧化活性或抗氧化活性较低的成分，在进一步提高蟹壳抗氧化肽的纯度的同时，对抗氧化肽的结构和活性的影响较小。
(5)真空冷冻干燥：将抗氧化肽溶液真空冷冻干燥，即得固体的蟹壳抗氧化活性肽。
作为优选，步骤(2)中，高速离心的工艺参数为：离心转速6000～10000rpm/min，时间10～30min。
作为优选，步骤(2)中，所述酸性蛋白酶酶活力为20000～50000U/g，所述风味蛋白酶酶活力≥30000U/g。
作为优选，步骤(2)中，酶解过程在搅拌条件下进行。
因此，本发明具有如下有益效果：本发明以蟹壳为原料，蟹壳粉碎后经双酶分步酶解、离心分离、膜分离、真空冷冻干燥得到固体的蟹壳抗氧化肽，工艺步骤简单，过程稳定可控，节能、高效、绿色环保，实现了螃蟹加工废弃物资源的综合利用，提高其应用价值，有效增加了螃蟹的经济价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
(1)原料预处理：将蟹壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎，得蟹壳粉，待用；
(2)双酶酶解：将蟹壳粉与水按质量比1：5混合后，调节pH为2.0，在30℃保温10min，加入为蟹壳粉质量0.1％、酶活力为20000U/g的酸性蛋白酶，在搅拌条件下保温酶解6h，升至95℃灭酶15min，冷却至50℃，调节pH至6.5，加入为蟹壳粉质量0.1％、酶活力≥30000U/g的风味蛋白酶，在搅拌条件下于50℃保温酶解2h，升温至95℃灭酶10min，得酶解液；
(3)离心分离：将酶解液进行高速离心分离，取上层清液，得抗氧化肽粗提液，高速离心的工艺参数为：离心转速6000rpm/min，时间10min；
(4)膜分离：将抗氧化肽粗提液利用超滤膜进行分离提纯，得到蟹壳抗氧化肽溶液；
(5)真空冷冻干燥：将抗氧化肽溶液真空冷冻干燥，即得固体的蟹壳抗氧化活性肽。
将得到的蟹壳抗氧化肽经抗氧化活性测定，以抗坏血酸当量表示，蟹壳抗氧化肽对DPPH的清除效果为10.5mg AAE/g样品，抗氧化肽的产量为240mg/g原料；感官评价为4。
实施例2
(1)原料预处理：将蟹壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎，得蟹壳粉，待用；
(2)双酶酶解：将蟹壳粉与水按质量比1：10混合后，调节pH为3.0，在40℃保温20min，加入为蟹壳粉质量0.3％、酶活力为50000U/g的酸性蛋白酶，在搅拌条件下保温酶解8h，升至100℃灭酶20min，冷却至60℃，调节pH至7.5，加入为蟹壳粉质量0.3％、酶活力≥30000U/g的风味蛋白酶，在搅拌条件下于60℃保温酶解4h，升温至100℃灭酶20min，得酶解液；
(3)离心分离：将酶解液进行高速离心分离，取上层清液，得抗氧化肽粗提液，高速离心的工艺参数为：离心转速10000rpm/min，时间30min；
(4)膜分离：将抗氧化肽粗提液利用超滤膜进行分离提纯，得到蟹壳抗氧化肽溶液；
(5)真空冷冻干燥：将抗氧化肽溶液真空冷冻干燥，即得固体的蟹壳抗氧化活性肽。
将得到的蟹壳抗氧化肽经抗氧化活性测定，以抗坏血酸当量表示，蟹壳抗氧化肽对DPPH的清除效果为10.2mg AAE/g样品，抗氧化肽的产量为180mg/g原料；感官评价为4。
实施例3
(1)原料预处理：将蟹壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎，得蟹壳粉，待用；
(2)双酶酶解：将蟹壳粉与水按质量比1：7混合后，调节pH为2.5，在35℃保温15min，加入为蟹壳粉质量0.2％、酶活力为30000U/g的酸性蛋白酶，在搅拌条件下保温酶解7h，升至98℃灭酶17min，冷却至55℃，调节pH至7.2，加入为蟹壳粉质量0.2％、酶活力≥30000U/g的风味蛋白酶，在搅拌条件下于55℃保温酶解3h，升温至97℃灭酶15min，得酶解液；
(3)离心分离：将酶解液进行高速离心分离，取上层清液，得抗氧化肽粗提液，高速离心的工艺参数为：离心转速8000rpm/min，时间20min；
(4)膜分离：将抗氧化肽粗提液利用超滤膜进行分离提纯，得到蟹壳抗氧化肽溶液；
(5)真空冷冻干燥：将抗氧化肽溶液真空冷冻干燥，即得固体的蟹壳抗氧化活性肽。
将得到的蟹壳抗氧化肽经抗氧化活性测定，以抗坏血酸当量表示，蟹壳抗氧化肽对DPPH的清除效果为9.8mg AAE/g样品，抗氧化肽的产量为249mg/g原料；感官评价为4。
本发明所用的DPPH清除率测定方法具体步骤为：
取1.5mL适当稀释的蟹壳抗氧化肽溶液，加入3.0mL 0.09mg/mL DPPH(95％乙醇溶液)，混合均匀室温避光放置5min，以95％乙醇为调零管，测定样品在517nm处吸光值。其中空白对照用95％乙醇溶液替代样品，标准品为抗坏血酸(AAE)溶液，浓度为0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL。
结果以每g蟹壳抗氧化肽相当于抗坏血酸的mg数表示，即mg AAE/g样品。
本发明采用的感官评价方法为：由8名经过训练的感官评价小组成员按照表1所示的评分标准，对蟹壳抗氧化肽进行感官评分。
表1 感官评价评分标准
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。