一种发酵生产去甲万古霉素的方法与流程

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产去甲万古霉素的方法。

背景技术：

盐酸去甲万古霉素是我国唯一一个自主研制并成功应用于临床的糖肽类抗生素，由链霉菌发酵产生，用于治疗革兰氏阳性菌感染。去甲万古霉素具有和万古霉素类似的化学结构、药理性质、抗菌活性和抗菌谱，其作用机制为抑制细菌细胞壁的合成，是临床上治疗由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌引起的严重感染的首选药物。

去甲万古霉素分子由两个基本结构组成，即糖基部分α-o-vancosamine-β-o- glucosyl和肽基部分的中心七肽核，在临床上使用的是去甲万古霉素盐酸盐，分子式为C₆₅H₇₃Cl₂N₉O₂₄·HCl，分子量为1471.71。盐酸去甲万古霉素为白色或类白色无定形粉末，极易溶于水，可溶于含水甲醇，不溶于高级醇类、丙酮或乙醚，低浓度尿素可增加其水溶解度。

去甲万古霉素为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中，去甲万古霉素不仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用，即抗生素对产生菌自身存在着毒害作用。随着去甲万古霉素在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成去甲万古霉素的产率难以提高，从而成为制约提高去甲万古霉素发酵水平的瓶颈。向发酵液中添加大孔吸附树脂可降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，但存在大孔吸附树脂和菌丝混在一起，无法有效分离的问题，将菌丝体和大孔吸附树脂用有机溶媒浸泡提取，有机溶媒用量大，且大孔吸附树脂无法回收。

酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年发展起来的有机氮源。其中棉籽蛋白粉是一种以特定地区的优质棉籽为原料，采用先进的技术生产的高蛋白、低酚、低纤维、微生物利用效果好的有机氮源，产品的蛋白含量在50%以上，氨基酸组成占总氮的90%以上，游离棉酚的含量控制在600ppm以下，产品质量稳定。酵母粉为标准化有机氮源，蛋白质含量高（蛋白质占干菌体总重50%以上），含有18种氨基酸，种类齐全，维生素和矿物质等含量丰富。但未见有报道将两种有机氮源配合应用。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备去甲万古霉素存在的高浓度产物对产生菌的反馈抑制及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，并在发酵过程中添加超顺磁性微球，以吸附发酵液中去甲万古霉素，降低对产生菌的反馈抑制，促进去甲万古霉素的生物合成，来提高去甲万古霉素产量的方法。

本发明的关键构思为：采用河北拟无枝酸菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产去甲万古霉素的过程中，优化发酵配方，添加超顺磁性微球，优化超顺磁性微球的加入时间、加入量、预处理方式等条件，吸附发酵液中去甲万古霉素，降低对产生菌的反馈抑制，提高去甲万古霉素产量。

本发明所提供的一种发酵生产去甲万古霉素的方法，包括以下步骤：

a、制备河北拟无枝酸菌菌种的种子液

将河北拟无枝酸菌菌种的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养48-72 h获得种子液。

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉2.0-4.0克、葡萄糖10.0-40.0克、热榨黄豆饼粉2.0-10.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠0.5-2.0克、七水硫酸镁0.5-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

本发明所述的菌种为华北制药1996年从正定菜园采集，经鉴定为河北拟无枝酸菌菌株（Amycolatopsis hebeiensis） NCPC 1023菌株，该菌株已于2003年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:203099）。

b、制备河北拟无枝酸菌菌种的发酵液

将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵48-72小时之间添加超顺磁性微球，继续发酵，总发酵时间168-192 h，发酵温度27-29 ℃，得到发酵液。

其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-30.0克、玉米粉20.0-40.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-10.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-10.0克、磷酸二氢钾3.0-5.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

优选的，其中所述超顺磁性微球的粒径为5-30μm，粒径分布为单分散，孔径为20-30nm，表面的功能基团为羧酸基团，羧基含量为200μmol/g；所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。

优选的，其中步骤b中所述超顺磁性微球添加量为每升发酵液添加5-15g。

优选的，超顺磁性微球添加量为每升发酵液添加8-12g。

优选的，超顺磁性微球的粒径为10-20μm。

优选的，所述步骤b中发酵压力为0.05±0.01Mpa、通气比为1：0.8-1.2，搅拌速度为300-400rpm。

优选的，其中所述步骤b中超顺磁性微球的添加时间为发酵54-64小时之间加入。

超顺磁性微球预处理方式为每克超顺磁性微球加入3-5ml的2moL/L的HCl，静态浸泡2-4小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值4.0-5.0。

去甲万古霉素发酵单位的测定方法为用乙醇酸水缓冲液洗脱，酸性水溶液为磷酸-磷酸盐缓冲液，pH值为4.0，乙醇在溶液中的体积百分比为15%。

本发明所述超顺磁性微球是一种内核含磁性的Fe3O4，外层包被多孔的高分子聚合物的微球。本发明中MagneStar® MP-02系列磁珠，商购于苏州纳微科技有限公司，该微球的内核具有超顺磁性，饱和磁化强度为30-40emu/g；微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散；高分子聚合物层呈现多孔性质，孔径为20-30nm,该多孔聚合物表面键合了羧基基团，羧基含量为200μmol/g；微球比表面积为150-240m2/g。所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。所述超顺磁性微球由于表面具有高密度的羧基基团，能够与含有氨基等碱性基团的物质键合，因此对发酵液中带有碱性基团的物质，包括去甲万古霉素，具有一定的吸附能力。

本发明的有益效果:

（1）上述优选条件，去甲万古霉素的产量从11658 μg/ml提高到22593μg/ml，为去甲万古霉素的工业化生产提供了一种新的方法。

（2）与添加大孔树脂相比，去甲万古霉素产量提高了15%以上，克服了加入到发酵液中的大孔吸附树脂无法回收，环境污染大的缺点，超顺磁性微球用外加磁场易于回收，再生后可重复使用，工艺过程绿色环保。

（3）本发明通过优化发酵条件，保证了不同发酵批次间代谢产物及发酵水平的一致性；通过在发酵过程中加入超顺磁性微球，吸附发酵液中去甲万古霉素，降低了发酵产物对产生菌的反馈抑制，显著促进去甲万古霉素生成，在其他培养条件相同的条件下，与不添加超顺磁性微球相比，去甲万古霉素产量提高了35%以上，提高了产能和设备利用率，降低了废水和废渣的排放。

附图说明

图1为菌株发酵培养48小时的菌丝形态。

图2为菌株发酵培养72小时的菌丝形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；所用的超顺磁性微球MagneStar® MP-02系列磁珠由苏州纳微科技有限公司提供，所用的大孔吸附树脂由上海华震科技有限公司提供，其它试剂均为市售产品。发酵液、洗脱液中去甲万古霉素的发酵单位使用高效液相色谱方法进行测定，其具体步骤是本领域技术人员所公知的。

实施例1、 500mL摇瓶发酵制备去甲万古霉素（黄豆饼粉，超顺磁性微球）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220 rpm、培养72 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉0.2克、葡萄糖4.0克、热榨黄豆饼粉0.2克、酵母粉1.0克、玉米浆0.8克、氯化钠0.05克、七水硫酸镁0.05克、碳酸钙0.3克，加自来水定容至100mL，pH6.5，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖20.0克、玉米粉40.0克、热榨黄豆饼粉20.0克、玉米浆10.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min，500mL摇瓶发酵培养。

发酵条件：500 ml装量的三角瓶6瓶，每瓶装50ml培养基，种子培养72小时后接种，接种量为10%，培养温度为28 ℃、摇床转速220 rpm，在培养至48小时后，（菌株发酵培养48小时的菌丝形态见图1），每瓶加入粒径为5μm 的超顺纳米微球介质0.75g，发酵培养168 h（菌株发酵培养72小时的菌丝形态见图2）。

发酵结束后，将6瓶发酵液合并后，磁性分离回收发酵液中的超顺磁性微球。回收后在超顺磁性微球中加入23ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位，计算去甲万古霉素的发酵单位为15738μg/ml，具体结果见表1、表2。（表1为有机氮源及添加物对微生物制备去甲万古霉素对比，表2为发酵液单位计算）

实施例2、5L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和黄豆饼粉，超顺磁性微球）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养64 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉5.0克、玉米浆5.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克、碳酸钙4.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、热榨黄豆饼粉45.0克、棉籽蛋白粉15.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾15.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁4.5克，加自来水定容至3000mL，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1：0.8vvm，装料量为3L，种子培养64小时后接种，接种量为8%，培养温度为29 ℃，转速为400 r/min。在发酵培养开始56小时后，加入粒径为30μm 的超顺纳米微球介质15g，发酵培养192小时。

发酵结束后，磁性分离回收发酵液中的超顺磁性微球。回收后在超顺磁性微球中加入75ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位。计算去甲万古霉素的发酵单位为18703μg/ml，具体结果见表1、表2。

实施例3、10L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和酵母粉，超顺磁性微球）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基， 30℃、220 rpm、培养48h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖10.0克、热榨黄豆饼粉8.0克、酵母粉8.0克、玉米浆2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁2.0克、碳酸钙6.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖150.0克、玉米粉100.0克、棉籽蛋白粉50.0克、酵母粉50.0克、玉米浆40.0克、磷酸二氢钾20.0克、氯化钠5.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1:1.2vvm，装料量为5L，种子培养48小时后接种，接种量为6%，培养温度为27 ℃，转速为300 r/min。在发酵培养开始72小时，加入粒径为10μm 的超顺纳米微球介质50g，发酵培养180小时。

发酵结束后，磁性分离回收发酵液中的超顺磁性微球。回收后在超顺磁性微球中加入250ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位，计算去甲万古霉素的发酵单位为22593μg/ml，具体结果见表1、表2。

对比例1、 500mL摇瓶发酵制备去甲万古霉素（黄豆饼粉）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220 rpm、培养72 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉0.2克、葡萄糖4.0克、热榨黄豆饼粉0.2克、酵母粉1.0克、玉米浆0.8克、氯化钠0.05克、七水硫酸镁0.05克、碳酸钙0.3克，加自来水定容至100mL，pH6.5，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖20.0克、玉米粉40.0克、热榨黄豆饼粉20.0克、玉米浆10.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min，500mL摇瓶发酵培养。

发酵条件：500 ml装量的三角瓶6瓶，每瓶装50ml培养基，种子培养72小时后接种，接种量为10%，培养温度为28 ℃、转速220 rpm，发酵培养168 h，去甲万古霉素的发酵单位为11658μg/ml，具体结果见表1。

对比例2、5L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和黄豆饼粉）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养64 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉5.0克、玉米浆5.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克、碳酸钙4.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、热榨黄豆饼粉45.0克、棉籽蛋白粉15.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾15.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁4.5克，加自来水定容至3000mL，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1：0.8，装料量为3L，种子培养64小时后接种，接种量为8%，培养温度为29 ℃，转速为400 r/min，发酵培养192小时，去甲万古霉素的发酵单位为13752μg/ml，具体结果见表1。

对比例3、10L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和酵母粉）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基， 30℃、220 rpm、培养48 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖10.0克、热榨黄豆饼粉8.0克、酵母粉8.0克、玉米浆2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁2.0克、碳酸钙6.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖150.0克、玉米粉100.0克、棉籽蛋白粉50.0克、酵母粉50.0克、玉米浆40.0克、磷酸二氢钾20.0克、氯化钠5.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.2，装料量为5L，种子培养48小时后接种，接种量为6%，培养温度为27 ℃，转速为300 r/min，发酵培养180小时，去甲万古霉素的发酵单位为16254μg/ml，具体结果见表1。

对比例4、 500mL摇瓶加入大孔吸附树脂发酵制备去甲万古霉素（黄豆饼粉，大孔吸附树脂）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220 rpm、培养72 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉0.2克、葡萄糖4.0克、热榨黄豆饼粉0.2克、酵母粉1.0克、玉米浆0.8克、氯化钠0.05克、七水硫酸镁0.05克、碳酸钙0.3克，加自来水定容至100mL，pH6.5，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖20.0克、玉米粉40.0克、热榨黄豆饼粉20.0克、玉米浆10.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min，500mL摇瓶发酵培养。

发酵条件：500 ml装量的三角瓶6瓶，每瓶装50ml培养基，种子培养72小时后接种，接种量为10%，培养温度为28 ℃、摇床转速220 rpm，在培养至48小时每瓶加入HZ816大孔吸附树脂4.5g，发酵培养168 h。

发酵结束后，过滤，得到菌丝体和大孔树脂混合物。在混合物中加入150ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位，计算去甲万古霉素单位为13623μg/ml，具体结果见表1、表2。

对比例5、5L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和黄豆饼粉，大孔吸附树脂）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养64 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉5.0克、玉米浆5.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克、碳酸钙4.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、热榨黄豆饼粉45.0克、棉籽蛋白粉15.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾15.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁4.5克，加自来水定容至3000mL，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1：0.8vvm，装料量为3L，种子培养64小时后接种，接种量为8%，培养温度为29 ℃，转速为400 r/min。在发酵培养开始56小时，加入HZ816大孔吸附树脂90g，发酵培养192小时。

发酵结束后，过滤，得到菌丝体和大孔树脂混合物。在混合物中加入1500ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位。计算去甲万古霉素的发酵单位为15934μg/ml。具体结果见表1、表2。

对比例6、10L自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素（棉籽蛋白粉和酵母粉，大孔吸附树脂）

河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备

将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基， 30℃、220 rpm、培养48 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖10.0克、热榨黄豆饼粉8.0克、酵母粉8.0克、玉米浆2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁2.0克、碳酸钙6.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min

本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。

发酵培养基组成：

葡萄糖150.0克、玉米粉100.0克、棉籽蛋白粉50.0克、酵母粉50.0克、玉米浆40.0克、磷酸二氢钾20.0克、氯化钠5.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。

发酵条件：罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.2，装料量为5L，种子培养48小时后接种，接种量为6%，培养温度为27 ℃，转速为300 r/min，在发酵培养开始72小时，加入HZ816大孔吸附树脂100g，发酵培养180小时。

发酵结束后，过滤，得到菌丝体和大孔树脂混合物。在混合物中加入2500ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，分别测定洗脱液与发酵液清液中的去甲万古霉素单位。计算去甲万古霉素的发酵单位为19230μg/ml。具体结果见表1、表2。

将表1中结果比较计算可知，添加超顺磁性微球与不添加相比，各种配方下均使发酵单位提高35%以上，分别为，黄豆饼粉：（15738-11658）/11658=35%，棉籽蛋白粉和黄豆饼粉：（18703-13752）/13752=36%，棉籽蛋白粉和酵母粉：（22593-16254）/16254=39；添加超顺磁性微球与添加大孔吸附树脂相比， 各种配方下均使发酵单位提高15%以上，分别为，黄豆饼粉：（15738-13623）/13623=16%，棉籽蛋白粉和黄豆饼粉：（18703-15934）/15934=17%，棉籽蛋白粉和酵母粉：（22593-19230）/19230=17%

注：E=（A* B +C*D）/A