一种纳米硒及其制备方法与流程

本发明涉及硒制备技术领域，尤其是一种纳米硒及其制备方法。

背景技术：

在啤酒酿造行业中，每生产10000t啤酒，将会产生100t发酵废液，其中富含大量蛋白及维生素，直接处理必将造成大量的资源浪费和环境污染，开发出一种能重复利用啤酒发酵废液的方法，使其变废为宝具有重大的意义。

硒是饲料添加剂中一种重要添加元素，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能。硒在自然界中常以+6，+4，0，-2四种价态为主，目前，我国饲料行业中，由于亚硒酸钠毒性高，安全使用范围较小，大部分地区已被禁止使用；而以-2价的硒代氨基酸为主的酵母硒，由于营养价值高、生物活性好被广泛应用，但在生产过程中其周期长，废液多，仪器设备成本高，大部分小企业难以维持，生产困难。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种纳米硒的制备方法，所述制备方法具有成本低，周期短，单位硒含量高，废水少。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种纳米硒的制备方法，包括如下步骤：

(1)在糖蜜水解液中加入亚硒酸钠、营养盐，灭菌，得到糖蜜培养基，其中，糖蜜培养基中亚硒酸钠的浓度为0.1～1.5mg/mL；

(2)离心啤酒发酵废液，得到酵母泥；

(3)将步骤(2)所得酵母泥和步骤(1)所得糖蜜培养基按1：3～1：2g/mL的质量体积比进行混合，在温度为25～32℃下发酵2小时以上，得到发酵液；

(4)将步骤(3)所得发酵液进行离心分离，得到酵母菌体，将酵母菌体进行干燥、粉碎，即得所述纳米硒。

本发明所述纳米硒的制备方法，利用啤酒发酵废液浓缩发酵制备纳米硒，成本低、制备效率高，具有较大的经济效益和环境效益。

优选地，所述步骤(1)所得糖蜜培养基中，糖度为3～7°Be′。

糖是提供酵母生长代谢主要能源物质之一，在酶的作用下，被氧化释放出电子和氢离子，在还原亚硒酸钠为纳米硒中起到重要作用。发明人经过大量尝试发现，糖浓度越高，转化的硒含量越高，但单位酵母量逐渐降低，当糖分选择上述含量时，可以保证单位酵母量和转化的硒含量的统一。

优选地，所述步骤(1)所得糖蜜培养基中，糖度为5°Be′，亚硒酸钠的浓度为1mg/mL。

当糖度为上述含量时，可以进一步保证单位酵母量和转化的硒含量的统一，使单位酵母量和转化的硒含量都达到最高。

亚硒酸钠的添加浓度是影响硒转化率的最主要因素，添加浓度越高，被吸收转化的纳米硒越多，但酵母细胞适应能力和其中的还原物质有限，过高的硒浓度会导致酵母细胞自溶死亡，而导致硒含量下降。发明人经过大量尝试，发现上述浓度的亚硒酸钠可保证硒含量较高。当亚硒酸钠为上述浓度时，转化的纳米硒含量最高，最高可达到11470ppm。

优选地，所述步骤(1)所得糖蜜培养基中，营养盐包含硫酸铵、维生素营养液，所述硫酸铵在所述糖蜜培养基中的质量百分比为0.5～2.5％，所述维生素营养液在所述糖蜜培养基中的质量百分比为0.1～1％。所述营养盐补充发酵过程中酵母菌生长所需要的氮源、维生素等营养物质，所述维生素营养液中包含多种酵母菌生长所需要的维生素。

优选地，所述步骤(3)中，发酵时间为3～12小时。

发明人在对发酵时间的研究中，发现在前3小时内，单位硒含量急剧上升，在3～12小时缓慢上升至平稳状态，这可能是酵母细胞中本身存在大量的某一还原性物质，在迅速的将有毒亚硒酸钠还原为单质硒吸附在细胞内，而后由于还原性物质的缺乏，通过酵母细胞的生长代谢作用缓慢的将亚硒酸钠富集到细胞中。

优选地，所述步骤(3)中，酵母泥和糖蜜培养基的质量体积比为1：2.5g/mL。

酵母泥添加量越多，单位消耗的培养基成本越低，但是酵母泥添加量太高，会使酵母在培养基中缺氧，导致厌氧发酵，进而产生酒精，影响产率。

优选地，所述步骤(3)中，在pH值为4～8的条件下进行发酵。

发明人经过大量尝试，发现在不同pH下处理后，硒浓度变化不明显，酵母细胞包裹效果好，在作为饲料添加剂中稳定，但是发现随着pH的增大硒含量先增加后下降，pH在4～8时硒含量总体变化不大，在实际发酵过程中要求低，便于生产。

优选地，所述步骤(3)中，在pH值为7、温度为30℃的条件下发酵3小时。

温度是影响酵母中各类酶活性的重要因素之一，酶在生长代谢中起关键性作用，不同温度下酶的活性表现不同，发明人经过大量尝试，发现随着温度的升高，在30℃以后酵母的产量急速下降，而硒含量在30℃时达到最高值，因此，选用30℃作为发酵温度；考虑到发酵成本，故选择3小时最佳；同时在pH为7时，硒含量最高，因此选择pH为7。

值得注意的是，所述步骤(4)中离心分离出的上清液，可以回收，继续应用到糖蜜培养基的制备中，以进一步降低成本，提高原料利用率。

同时，本发明还提供一种上述制备方法制备得到的纳米硒。所述纳米硒为由酵母细胞包裹的活性纳米硒，在高温下仍能表现具有活性的红色纳米硒，稳定性好。

优选地，所述纳米硒颗粒大小为30～40nm。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明所述制备方法利用啤酒发酵废液浓缩发酵制备纳米硒，发酵周期极短，一定程度上可以省去灭菌这一环节，大幅度降低了设备要求及成本投入，同时资源再利用，为环境减轻了压力，变废为宝、成本低、制备效率高，亚硒酸钠转化率高达90％以上，最高单位硒含量11470ppm，具有较大的经济效益和环境效益。

本发明所制备得到的纳米硒在高温下仍能表现具有活性的红色纳米硒，稳定性好，适于工业生产与应用。

附图说明

图1为本发明所述纳米硒实拍图；

图2为破碎提取得到的纳米硒扫描电镜图；

图3为酵母细胞透射电镜图；

图4为糖浓度对纳米硒转化的影响图；

图5为亚硒酸钠添加量对纳米硒转化的影响图；

图6为发酵时间对纳米硒转化的影响图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所述纳米硒的制备方法的一种实施例，本实施例所述纳米硒的制备方法，包括如下步骤：

(1)在糖蜜质量百分比为10％的糖蜜水解液中加入亚硒酸钠、硫酸铵、维生素营养液，121℃高温灭菌，得到糖蜜培养基；所述培养基中，糖度为5°Be′，亚硒酸钠的浓度为1mg/mL，硫酸铵的质量百分比为2.5％，维生素营养液的质量百分比为0.5％；

(2)将啤酒发酵废液在低速离心机下进行分离，得到沉淀酵母泥；

(3)将步骤(2)所得酵母泥和步骤(1)所得糖蜜培养基按(1：2.5)g/mL的质量体积比进行混合，使用1mol/L盐酸调节pH至7，逐渐升温至30℃，持续发酵3h；得到发酵液；

(4)以3000r/min离心5min得到菌体，重复清洗3次洗去表面硒盐，高温下干燥，粉碎，即得所述纳米硒。

由本实施例所述制备方法制备得到的纳米硒，为由酵母细胞包裹的活性纳米硒，颗粒大小为30nm。

实施例2

本发明所述纳米硒的制备方法的一种实施例，本实施例所述纳米硒的制备方法，包括如下步骤：

(1)在糖蜜质量百分比为10％的糖蜜水解液中加入亚硒酸钠、硫酸铵、维生素营养液，121℃高温灭菌，得到糖蜜培养基；所述培养基中，糖度为3°Be′，亚硒酸钠的浓度为0.1mg/mL，硫酸铵的质量百分比为2％，维生素营养液的质量百分比为0.1％；

(2)将啤酒发酵废液在低速离心机下进行分离，得到沉淀酵母泥；

(3)将步骤(2)所得酵母泥和步骤(1)所得糖蜜培养基按(1：2)g/mL的质量体积比进行混合，使用1mol/L盐酸调节pH至4，逐渐升温至25℃，持续发酵2h；得到发酵液；

(4)以3000r/min离心5min得到菌体，重复清洗3次洗去表面硒盐，高温下干燥，粉碎，即得所述纳米硒。

由本实施例所述制备方法制备得到的纳米硒，为由酵母细胞包裹的活性纳米硒，颗粒大小为40nm。

实施例3

本发明所述纳米硒的制备方法的一种实施例，本实施例所述纳米硒的制备方法，包括如下步骤：

(1)在糖蜜质量百分比为10％的糖蜜水解液中加入亚硒酸钠、硫酸铵、维生素营养液，121℃高温灭菌，得到糖蜜培养基；所述培养基中，糖度为7°Be′，亚硒酸钠的浓度为1.5mg/mL，硫酸铵的质量百分比为0.5％，维生素营养液的质量百分比为1％；

(2)将啤酒发酵废液在低速离心机下进行分离，得到沉淀酵母泥；

(3)将步骤(2)所得酵母泥和步骤(1)所得糖蜜培养基按(1：0.5)g/mL的质量体积比进行混合，使用1mol/L盐酸调节pH至8，逐渐升温至32℃，持续发酵4h；得到发酵液；

(4)以3000r/min离心5min得到菌体，重复清洗3次洗去表面硒盐，高温下干燥，粉碎，即得所述纳米硒。

由本实施例所述制备方法制备得到的纳米硒，为由酵母细胞包裹的活性纳米硒，颗粒大小为35nm。

实施例4

本实施例利用透射电镜和扫描电镜对实施例1～3所制备得到的纳米硒的结构、形态及粒径进行进一步的观察、表征、分析。

通过表征观察图3中酵母细胞周围及胞质中存在大量的密集颗粒，其酵母细胞大小约为3～4um，其中颗粒大小约为30～40nm颗粒，通过破碎提取得到纳米硒沉淀通过扫描电镜观察，如图2所示，其颗粒大约为40nm左右颗粒，与图3中的判断一致，通过对产品烘干粉碎得到产品置于空气中放置1月后(效果图如图1)为鲜红色，是红色活性纳米硒的特征颜色，由此判断通过该种方法制备的纳米硒为活性纳米硒。

实施例5

本实施例对本发明所述纳米硒制备方法中糖度、硒添加量、发酵时间的选择进行研究，研究采用控制单一变量的方法，具体研究数据如图4～6所示。

由图4可以看出，糖度越高，转化的硒含量越高，但酵母量随着糖度的增加，呈现先增后减的趋势，当糖度为5°Be′时，单位酵母量最大。

由图5可知，随着亚硒酸钠浓度的增加，转化的硒含量呈现先增后减的趋势，酵母量随着亚硒酸钠浓度的增加缓慢下降，当亚硒酸钠的添加量为1mg/mL时，转化的纳米硒含量最高，最高可达到11470ppm，酵母量又下降的不明显。

由图6可知，发明人在对发酵时间的研究中，发现在前3小时内，单位硒含量急剧上升，在3～12小时缓慢上升至平稳状态，这可能是酵母细胞中本身存在大量的某一还原性物质，在迅速的将有毒亚硒酸钠还原为单质硒吸附在细胞内，而后由于还原性物质的缺乏，通过酵母细胞的生长代谢作用缓慢的将亚硒酸钠富集到细胞中。同时，干酵母的量随着发酵时间的增加有缓慢下降的趋势，因此发酵时间选择3～12小时，此时单位硒含量基本达到最大值，而酵母含量又下降的不明显，同时图6也进一步说明本发明所述方法的发酵时间短的优势。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。