本发明涉及一种基于ACACB基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是催化脂肪酸合成代谢第一步反应的限速酶，在ATP供能、Mg2+存在下，以HCO3-为羧基供体，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰单酰辅酶A，属于生物素依赖性酶。ACC广泛存在于多种生物中，在人类和其它哺乳动物中该酶属于组织特异性酶，存在两种变构体ACC1(或称ACCα，265kDa)和ACC2(或称ACCβ，275-280kDa)，分别由ACACA和ACACB基因编码。在人类上，ACACA基因位于染色体17q12上，ACACB基因位于染色体12q23上，二者具有高度的相似性，总的氨基酸序列相似性达76％，主要区别在于ACACB比ACACA在第一个功能区的N端多出约140个氨基酸，这些氨基酸序列有助于ACC2结合并固定在线粒体外膜上(Abu-Elheiga et al.,2000)。
ACC是一个多亚基酶，其功能区可分为催化功能区和非催化功能区。催化功能区占据不到ACC分子的一半，包括生物素羧化酶(Biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(Biotin carboxyl carrier protein，BCCP)和羧基转移酶(Carboxyl transferase，CT)3个部分，其中CT又由α-CT和β-CT两种亚基组成。非催化功能区可细分为5个部分：1)N末端。这部分在ACC1和ACC2分别有75和139-218个残基，是ACC1和ACC2差异最大的一部分。氨基末端包括了ACC1的磷酸化位点和ACC2潜在的磷酸化位点。2)被AMP-激活蛋白激酶(AMPK)磷酸化作用的调控位点。3)BC和BCCP区之间的大约110个氨基酸的保守性较高的区域。4)BCCP和CT区之间的大约800个氨基酸的高度保守区域。5)C末端。在ACC1和ACC2中该末端的残基和长度高度保守(韩春春等，2006)。
目前已有研究证实，ACC2定位于线粒体膜上，其主要功能是调节脂肪酸的氧化。研究发现，ACC2催化反应生成的丙二酸单酰辅酶A是脂肪酸β氧化反应关键酶——肉毒碱脂酰辅酶A转移酶I(CPT-I)的重要抑制剂(McGarry et al.,1977；Munday,2002)，ACC2通过抑制CRT-I的活性，进而抑制脂肪酸β氧化反应的进行；而当机体处于能量消耗状态时，AMPK活性上升并与ACC2作用使其磷酸化，进而解除ACC2对脂肪酸β氧化反应的抑制(Chen et al.,2003)。ACC2在哺乳动物体内主要在骨骼肌、心肌和肾脏等组织中表达。其中，在骨骼肌和心肌中脂肪酸的β氧化是主要的能量来源(Abu-Elheiga et al.,2000；Tong,2005)，而在肾脏中，ACC2则与糖尿病肾病中的脂毒性密切相关(Murea et al.,2010)。Abu-Elheiga等(2003)发现，缺失ACACB基因的小鼠体内脂肪氧化加速而严重减少，进而导致体重急剧下降，表明可有效地抵制食物诱导性肥胖；同时，这些小鼠也能抵制由高糖食物引起的糖尿病。因此，ACACB可作为治疗肥胖症和糖尿病的参考靶点。
牛的ACACB基因位于第17号染色体上，全长116.36kb，包含58个外显子和57个内含子。其mRNA全长7007bp(另有剪接变构体6种，长度8384-10027bp不等)，共编码2331个氨基酸，mRNA序列与人的同源性为86％，氨基酸序列与人的同源性为88％。
聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状中的应用。
本发明还提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状的产品中的应用。
上述应用中，所述产奶性状为305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率。
本发明还提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在牛育种中的应用。
本发明还提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备牛育种的产品中的应用。
本发明还提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛中的应用。
本发明还提供了检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛的产品中的应用。
上述应用中，所述检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66218117位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66199005位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66167817位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列J所示的单链DNA分子组成的引物对J；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；
所述序列J为将序列10删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法为如下(1)和/或(2)和/或(3)和/或(4)和/或(5)：
(1)是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：
CC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体；TT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳脂率高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳脂率高于CC基因型的牛个体；
TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于TC基因型的牛个体；TT基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂率和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂率和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；
所述TT基因型为牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型为牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述TC基因型为牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基为T和C的杂合体；
(2)是检测牛个体的基因型是GG基因型还是AA基因型还是GA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：
AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于GA基因型的牛个体；GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量高于GA基因型的牛个体；GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于AA基因型的牛个体；
GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述GA基因型为牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基为G和A的杂合体；
(3)是检测牛个体的基因型是GG基因型还是AA基因型还是GA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：
GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳脂率高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳脂率高于AA基因型的牛个体；
GA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂量高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂量高于AA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述GA基因型为牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基为G和A的杂合体；
(4)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；
GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(5)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：
AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于GG基因型的牛个体；GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于AA基因型的牛个体；AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；
GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体；GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳脂量高于AA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体。
上述方法中，
所述(1)中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型的方法为如下A)或B)：
A)直接测序；
B)测序含有牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(2)中，所述检测牛个体的基因型是GG基因型还是AA基因型还是GA基因型的方法为如下C)或D)：
C)直接测序；
D)测序含有牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(3)中，所述检测牛个体的基因型是GG基因型还是AA基因型还是GA基因型的方法为如下E)或F)：
E)直接测序；
F)测序含有牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(4)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为如下G)或H)：
G)直接测序；
H)测序含有牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(5)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为如下I)或J)：
I)直接测序；
J)测序含有牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸的PCR扩增产物。
上述方法中，
所述B)中的PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
所述D)中的PCR扩增产物所用的引物为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
所述F)中的PCR扩增产物所用的引物为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸。
所述H)中的PCR扩增产物所用的引物为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
所述J)中的PCR扩增产物所用的引物为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列J所示的单链DNA分子组成的引物对J；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；
所述序列J为将序列10删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品为检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸和/或第66218117位脱氧核糖核苷酸和/或第66199005位脱氧核糖核苷酸和/或第66167817位脱氧核糖核苷酸和/或第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。
上述产品中，所述检测牛基因组17号染色体上第66218726位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66218117位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66199005位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66167817位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组17号染色体上第66102564位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列J所示的单链DNA分子组成的引物对J；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；
所述序列J为将序列10删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸。
上述应用或方法或产品中，
所述牛为奶牛；
所述305天产奶量为从产犊到第305个泌乳日的总产奶量；
所述乳脂率为乳中所含的脂肪的百分率；
所述乳脂量为乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积；
所述乳蛋白率为乳中所含的蛋白的百分率；
所述乳蛋白量为乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积；
所述第一泌乳期为母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天；
所述第二泌乳期为母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
上述应用或方法或产品中，
所述牛基因组序列为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列。
通过试验证明：本发明的方法简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，并可用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，适合实验室大群体规模检测的需要。不仅可对待选牛进行早期筛选，而且降低了育种花费，能有效提高实际生产中的牛的产奶量，在牛的育种工作中将发挥巨大作用。
附图说明
图1为g.66218726T>C、g.66218117G>A、g.66199005G>A、c.781A>G和g.66102564A>G的突变位置。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的中国荷斯坦公牛管制冻精样品和女儿群体的母牛血样分别来源于北京三元绿荷奶牛养殖中心和北京市畜牧兽医总站。
下述实施例中的305天产奶量：从产犊到第305个泌乳日的总产奶量。
下述实施例中的乳脂率：乳中所含的脂肪的百分率。
下述实施例中的乳脂量：乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积。
下述实施例中的乳蛋白率：乳中所含的蛋白的百分率。
下述实施例中的乳蛋白量：乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积。
下述实施例中的第一泌乳期：母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
下述实施例中的第二泌乳期：母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
实施例1、奶牛产奶性状相关的分子标记及鉴定奶牛产奶性状的方法
一、奶牛ACACB基因多态位点的确定
1、DNA池的制备
选择北京地区共40头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，将40头中国荷斯坦公牛随机均分为两组，利用核酸分析仪准确测定其冻精基因组DNA的浓度，并将这些DNA均稀释成浓度为50ng/μL，等量混合成两个DNA池，作为PCR扩增的模板。
2、引物的设计
根据牛ACACB基因序列(位于GenBank登录号为AC_000174.1的序列中，更新日为2014年12月31日)，设计如表1的54对引物。
表1、ACACB基因PCR扩增引物序列信息
3、PCR扩增
以步骤1得到的DNA池为模板，分别采用表1中的各组引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
表1中引物9F和9R采用常规PCR方法，其余引物采用了降落PCR的方法(touchdown PCR)。降落PCR的原理大致如下：首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有；随着反应循环数的增加，退火温度的逐步降低，非特异扩增也会逐步增多；但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。表1中部分引物的退火温度表示为“a-b touchdown”(a>b)的形式即为降落PCR中所用的退火温度范围，表示在反应过程中退火温度逐步由a℃降落到b℃。
PCR反应体系如表2所示(表2中的正向引物F和反向引物R分别表示1F和1R、2F和2R等)。常规PCR和降落PCR反应条件如表3所示。
表2、PCR反应体系
表3、PCR反应条件
4、PCR扩增产物的测序及序列分析
对PCR扩增产物进行测序，结果发现公牛群体ACACB基因上游2000bp的侧翼序列中存在2个SNP标记、5’UTR区存在1个SNP标记、第13外显子中存在1个SNP标记，3’UTR区存在1个SNP标记，如表4所示，突变位置如图1所示。
表4、ACACB基因发现的5个SNPs
上述发现的ACACB基因的5个SNP中，
g.66218726T>C是以牛的基因组DNA为模板，以1F和1R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列11所示)自3’末端起第193位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基均为T的个体的基因型命名为纯合TT基因型，将牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组17号染色体上第66218726个核苷酸位点的碱基为T和C的个体的基因型命名为杂合TC基因型。
g.66218117G>A是以牛的基因组DNA为模板，以2F和2R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列12所示)的自5’末端起第501位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组17号染色体上第66218117个核苷酸位点的碱基为T和C的个体的基因型命名为杂合GA基因型。
g.66199005G>A是以牛的基因组DNA为模板，以7F和7R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列13所示)的自5’末端起第387位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组17号染色体上第66199005个核苷酸位点的碱基为G和A的个体的基因型命名为杂合GA基因型。
c.781A>G是以牛的基因组DNA为模板，以13F和13R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列14所示)的自5’末端起第186位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组17号染色体上第66167817个核苷酸位点的碱基为A和G的个体的基因型命名为杂合AG基因型。
g.66102564A>G是以牛的基因组DNA为模板，以50F和50R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列15所示)的自3’末端起第204位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组17号染色体上第66102564个核苷酸位点的碱基为A和G的个体的基因型命名为杂合AG基因型。
二、奶牛ACACB基因多态位点与产奶性状的相关性分析
1、基因型检测
根据步骤一中获得的ACACB基因5个SNPs情况，分别采用5个SNPs对应的SNP引物对40头荷斯坦公牛家系共1093头女儿群体进行群体基因型分型。具体步骤如下：提取女儿群体的母牛血样(为非抗凝血)的基因组DNA，基因组样品交由博淼生物科技(北京)有限公司使用“用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法”，即MALDI-TOF-MS检测技术对步骤一获得的5个SNPs位点的基因型进行检测。基因型检测结果如表5所示。
2、产奶性状检测
分别检测上述1093头试验母牛的305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5个产奶性状。每个个体的测定日的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、外祖父号、出生日期、泌乳期、产犊日期、测定日期、测定日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率、测定日体细胞数、估计的305天产奶量、估计的305天乳脂量和305天乳蛋白量15项信息。
3、单个SNP位点与性状的关联分析模型
采用SAS 9.13软件中的MIXED过程对奶牛305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5个产奶性状和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：Y＝μ+hys+b×M+G+a+e。其中，Y：产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应。关联分析方法参见文献“东天，基于GWAS后分析策略研究EEF1D基因与奶牛产奶性状遗传效应[D].北京：中国农业大学，2013.”。
5个产奶性状和基因型关联分析结果如表5所示。从表5中可以看出：
在第一泌乳期时，
g.66218726T>C与305天产奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量达到显著或极显著关联水平(P＝0.0367-P＝0.0029)，优势等位基因为T。CC基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体。TT基因型的牛个体的乳脂量和乳脂率高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体的乳脂量和乳脂率高于CC基因型的牛个体。
g.66218117G>A与305天产奶量、乳脂量和乳脂率达到显著或极显著关联水平(P＝0.0386-P＝0.0071)，优势等位基因为G。AA基因型的牛个体的305天产奶量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的305天产奶量高于GA基因型的牛个体。GG基因型的牛个体的乳脂量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的乳脂量高于GA基因型的牛个体。GG基因型的牛个体的乳脂率高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体的乳脂率高于AA基因型的牛个体。
g.66199005G>A与乳脂量和乳脂率分别达到极显著关联水平(P＝0.0047)和显著关联水平(P＝0.0412)，优势等位基因为G。GG基因型的牛个体的乳脂量和乳脂率高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体的乳脂量和乳脂率高于AA基因型的牛个体。
c.781A>G与乳脂量(P＝0.0483)和乳蛋白量(P＝0.0289)达到显著关联水平。AG基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体。
g.66102564A>G与305天产奶量、乳脂率和乳蛋白量达到显著或极显著关联水平(P＝0.0448-P＝0.0012)，优势等位基因为G。AG基因型的牛个体的305天产奶量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量高于GG基因型的牛个体。GG基因型的牛个体的乳脂率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的乳脂率高于AA基因型的牛个体。AG基因型的牛个体的乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的乳蛋白量高于AA基因型的牛个体。
在第二泌乳期时，
g.66218726T>C与305天产奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量达到显著或极显著关联水平(P＝0.0249-P＜0.0001)，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体。
g.66218117G>A与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著关联水平(P＜0.0001)，优势等位基因为G。GG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GA基因型的牛个体。
g.66199005G>A与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到显著或极显著关联水平(P＝0.0235-P＝0.0003)优势等位基因为G。GA基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体。GG基因型的牛个体的乳脂量高于GA基因型的牛个体，GA基因型的牛个体的乳脂量高于AA基因型的牛个体。
c.781A>G与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著关联水平(P＝0.0163-P＜0.0001)，优势等位基因为G。GG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AA基因型的牛个体。
g.66102564A>G与305天产奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量达到显著或极显著关联水平(P＝0.015-P＜0.0001)，优势等位基因为G。GG基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体。GG基因型的牛个体的乳脂量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的乳脂量高于AA基因型的牛个体。
表5、ACACB基因与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)
注：SNP1代表g.66218726T>C，SNP2代表g.66218117G>A，SNP3代表g.66199005G>A，SNP4代表c.781A>G，SNP5代表g.66102564A>G；*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著。a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种基于ACACB基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用
<160>15
<210>1
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tttctcacct gccctgta 18
<210>2
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tgaagactct ggctcctcta 20
<210>3
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
acgccaggaa ggcagtg 17
<210>4
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
gatttcagcg gtgggtat 18
<210>5
<211>19bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
agccaggtaa gatgattgc 19
<210>6
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
aggagggaag gaaggtg 17
<210>7
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
gggaaactga aggactg 17
<210>8
<211>16bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
gaccgaagaa gcacaa 16
<210>9
<211>19bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
aggagggtcc actgttgtt 19
<210>10
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
ggaagctgga gtgtttgg 18
<210>11
<211>904bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
tttctcacct gccctgtagc tatcagtgga ggagaataga cccttcccag gctggcactg 60
atgacaaaaa gctacaactc cctgctgacc catgggccaa acagggaaac tcggaatcaa 120
tcctatgtaa cgatcagatc agatcagatc agatcaatcg ctcagttgtg tctgactctt 180
tgcgacccca tgaatcgcag cacaccagac ctccctgtcc atcaccaact cccggagttc 240
actgggacgt ccatcgagtc agtgatgcca tccagccatc tcatcctctg tcatcccctt 300
ctcctcttgc ccccaatccc tcccagcatg agtgttttcc aatgagtcaa ctcttcgcat 360
gaggtggcca aagtactgga gtttcagttt tagtatcatt ccttccaagg aaatcccagg 420
gctgatctcc ttcaggatgg actggttgga tctccttgca gtccaaggga ctctcaagag 480
ttttctccaa caccacagtt caaaagcatc aattctttgg cgctcagcct tcttcacagt 540
ccaactctca catccataca tgaacaatca gatactctgt gccatagggg gattttggta 600
aatggaactc ttagaactgg ggcaccctgg ggacaaagct ggtatgggcc tcagtgggtg 660
gaatcatctg ctccccggga gaagggtttg ggctgcagca tccagggtgg gaccctgctc 720
tggaattcag ttgggcaaaa agccacatgt gagctgggct tggcgatggg ccgactctgc 780
agcttgggcc ttgggtggcc accagggggc gctgaggcca cgccaggaag gcagtgacgt 840
cccgaggggt gtcagggtgg ctgggaggta ggaagaattc agggtagagg agccagagtc 900
ttca 904
<210>12
<211>1187bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
cgccaggaag gcagtgacgt cccgaggggt gtcagggtgg ctgggaggta ggaagaattc 60
agggtagagg agccagagtc ttcaaggttg agcagggcaa atgcccttgc gaggcgactc 120
gctgtacctg caggaactct ctgtgctttg gctccatctc ctcccccttg ggcagctgga 180
gttcagagct gcgtcggtat cacctgggac ccccggagtc gggggttaca ccatgcaggg 240
tgggggtgct ggaggtggca ggtcttggcc acttgaggat ttctgttact cctcctctgc 300
ttacagatca tgtgacccac caaccccagt tcaagccacg gtttccccat ctgtacgata 360
agagggtagg ctggaggatc cttcaggtct tcgttgcacc acacgggatc tccgttgcat 420
cgtgaggaat cttgctttgc agcacatgga attctctagt tgtgtccctt gggctccaga 480
atgcgagggc tcagttgccc cgcggcatgt gggattcggt tccctgacca gggatcgcac 540
cctctttccc tgcgttgcaa ggtggactca caagcattgg actactaagg aagtttgtag 600
tgtttcattt attcttctca accatgcggt gaagtcttta gatgaaaaaa caggcttggc 660
cgtttgccca aagccacagg tgacagagca aggattcaga gtcagatcaa tctgatttca 720
aagcccagta gtcctgccac tattgaccct ctgcccagat cataattttt tggagtcatt 780
agggagagat tttcaatgga gtgttaaaaa aatttccctg agttacgaat ggctccccct 840
ggagacatcg gaggacacgt ctgcgtttag agagatggct cttccacagg cttgtgtgag 900
ctcttctgga gtgaagtagg ctgggcaaac aacctaagcc ccaccattga ctgagtcctt 960
gacctgcatt tttttcattc cccaactcca ggctcccgct gatgatatcc aggcttcagg 1020
agaacccggg cagcaggcaa gaaatacgct tcctctttgt aagtccactg gagaaaatcc 1080
catgagattc actatttgct aactcttcct tcttgaaaaa cgtgcccaga aatgaagtcg 1140
ctctggcagg gtgaagctgt acctggcata cccaccgctg aaatcat 1187
<210>13
<211>872bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
gccaggtaac atgattgcat agatcctaaa atggctctct tgttctcctt acagattttc 60
tgaatgatcc tgcttctttt tctatcttgt ctgattttct cctgcctgac cttttcccaa 120
ttaaaaagct gagggaaaat gtcagactcc aagcaagtca ccaagagtaa acggaaagtg 180
agcttcaccc cgagtcagga gccgattcca gcctcagagg gatcccagga gccaccgcag 240
gaagactgca acagcagccc tctgccaaag acccctagcc aggctgagct ggcctcccac 300
aaaggacccc aagacacctg ccagcagagg ccctcccaat cacctctgcc acagaatccc 360
caaggaaacc ccctctcgtc tgatgacgcc tccccagcac gccaagccaa cgggtcagag 420
actgaaggcc cggagatccc aaataccaat gacctgtccg cgccagccag gccccagggc 480
cagcgagcca gaaccctctc cagagaagac aggaagcagg cacacatcaa gagacagctg 540
atgaccaact tcatcctggg ctcttttgat gacaactcct ccgatgaaga tgctggtgct 600
gccctgttcc gacagtcttc ccggaagggc agccgggcca gcctggggac cctgtccctg 660
gagactgctc atgccgcagg cgagactgag acctgtgccc ccgttataag gtaactcaga 720
ctttgtcccc gtaaccagga ggtgcagcgt tgcggtgggg tctacaccct tccctgtgca 780
gccaagcaac cggctatgcc agtgctttga aggtggctat gtggcaagca ggagacatga 840
ggctcccccc ccccaccttc cttccctcct ct 872
<210>14
<211>538bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
ggaaactgaa ggactgtgtc tgaattctgt tggcccagag gccaggtcta gagccgctgt 60
gctgggaaga ggcactgtat ttccgtgtcg tgtccaggct gttttgggga ggattctgtt 120
tcctctgtga ccctgcaggt ctgacggtgg agtgggcgga acacagtcta caggaggggc 180
aaaggatcag catcccagag tccgtctaca acaatggttg cgtgaaagat gtagatgaag 240
gcttggaggt aaatacagat ccttggaggg gtgtgggggg gccaggagcc agaaccttct 300
cataagcctg gtagcagcag aaactgtcta aacctctaaa gaagtctgtt tgtccattgc 360
cctcaggcag cagaaaaaat tggttttccc ttgatgatca aagcttctga aggcggtgga 420
gggaaaggaa tccggaaggc ggagactgct gaggacttcc ccatcctgtt cagacaagtg 480
agctcctcgc gccgcatgtt tttccccgtg tctttgggaa ttgtgcttct tcggtcgg 538
<210>15
<211>637bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
ggagggtcca ctgttgttcc ttgagattgt gctgtggccc ttcctgcccc acaggaccat 60
tacccccact gtgactgcga caggaagagg gttgggcgct ccgggtggct ggttgcccac 120
ccaggagtgg gacaggccct ggggctctgg ggctacaggg gggcgggggc ccactgaact 180
cagcgggaga aatgacctcg ccctcctccc ccgactcctg cagcctggtt caagaaaacc 240
ccgagctggc catggactca ctggtgtacg tcagccagca catcagcccg gccgagcggg 300
cccaggtcat tcacctcctg tccaccacgg acggcccggc ctctacctga cccccggtcc 360
tcctggtcgt tcgcaggacc tcgggcaaga gaaaccacac cgatccactg actgcaggcc 420
cttgccagaa ccgtgggggt ttgcttttta aaactcctgg gcgttgccgc aaggctgctg 480
acccccagct cactcctgtt taataaaagg ctcgggagcg cccccttcca agcagaaacc 540
gcccccttct ccgttgctgg gaagtctggt ttttagctct ttaagacact ttgctccatc 600
gttgaatcga attgaaccca aacactccag cttccat 637