本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物。
背景技术：
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，亦是临床上常见的条件致病菌，在机体免疫功能降低时可引起肺部和尿道感染以及败血症。
磷脂酶A1是一类水解磷脂sn-1位酰基的酶类，广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发现。含有磷脂酶A1的微生物主要包括耶和森菌、灰色链霉菌、曲霉菌、假单胞杆菌和沙雷氏菌等。磷脂酶A1主要应用于食品、制药和生物燃料产业。磷脂酶A1在工业上得到广泛应用，目前研究材料多来自于沙雷氏菌属。磷脂酶A1基因(plaA)编码产生磷脂酶，plaS在plaA的下游，也参与磷脂酶基因的表达，plaS编码一段为224个氨基酸的蛋白，该蛋白没有酶活性，可能对于磷脂酶A1基因的表达有辅助作用。因此，为了后续plaA和plaS的研究，建立plaA和plaS全序列扩增和测序方法是十分必要的。
技术实现要素：
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物，目的是能够快速、简便的扩增粘质沙雷氏菌plaA和plaS的全序列。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种用于扩增粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因的引物，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的KLSERF3和序列号为SEQ ID NO.2的KLSERR3；所述第二引物对包括序列号为SEQ ID NO.3的KLPERF4和序列号为SEQ ID NO.4的KLSERR4。
引物序列如下：
KLSERF3(SEQ ID NO.1)：5′-TTCCGCATCTCCAACAACCT-3′
KLSERR3(SEQ ID NO.1)：5′-GCCGCGATCTTCACCTATT-3′
KLPERF4(SEQ ID NO.1)：5′-TCGCTTGCTCACACTCACC-3′
KLSERR4(SEQ ID NO.1)：5′-TTGCCGTTGCTCTTCTCGTTC-3′
本发明还提供所述引物在粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因测序中的应用。
所述粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因的测序方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的全基因组DNA；
(2)采用所述引物对全基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)扩增后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，并经过纯化后进行测序，得到两个基因片段；
(4)对测序结果进行拼接，得到两个基因的全序列。
步骤(1)采用天根生化科技(北京)有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌全基因组，并通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
步骤(2)首先根据plaA和plaS在粘质沙雷氏菌菌株Db11全基因组序列中的相对位置，在其上下游保守区域利用Oligo7软件设计两对专用性引物，之后采用plaA和plaS两对专用引物对奶粘质沙雷氏菌全基因组DNA进行扩增，分别得到两个扩增片段。
所述测序方法还包括采用不同菌株的粘质沙雷氏菌扩增测序并验证引物的专用性。
步骤(3)中PCR扩增后产物的两种条带所含有的DNA片段的长度分别为963bp和756bp。
为了得到更好的扩增效果，步骤(2)中PCR扩增是以25μl的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为2.2μl,模板的用量为2μl。步骤(2)所述PCR扩增的过程中退火温度为50～60℃。
PCR扩增采用25μl反应体系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO(二甲基亚砜)0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,灭菌水13.47μl。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
本发明有益效果是:本发明的引物有着很好的扩增性能，在退火温度梯度为50℃～60℃范围内均能获得明亮的条带。用本发明的专用引物来扩增不同菌株的粘质沙雷氏菌plaA和plaS基因均能得到全序列，且本发明提供的粘质沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列可以应用到系统进化、磷脂酶功能、工业产磷脂酶等多个方面研究。本发明方法技术具有速度快，实用性强，成本低，重复性好，能快速有效地获得plaA、plaS全基因序列。
附图说明
下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：
图1是本发明的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
其中，泳道1～7是第一对引物KLSERF3和KLSERR3扩增的条带；泳道8～14是第二对引物KLPERF4和KLSERR4扩增的条带；泳道M为分子量标记。
具体实施方式
下通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
一种粘质沙雷氏菌plaA和plaS全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：
(1)采用天根生化科技(北京)有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌全基因组，并通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
(2)根据plaA和plaS在粘质沙雷氏菌菌株Db11全基因组序列中的相对位置，在其上下游保守区域利用Oligo7软件设计两对专用性引物，如下表1所示，
表1引物
第一对上游引物序列是KLSERF3有20个碱基TTCCGCATCTCCAACAACCT，下游引物序列是KLSERR3有19个碱基GCCGCGATCTTCACCTATT；
第二对上游引物是KLPERF4有19个碱TCGCTTGCTCACACTCACC，下游引物是KLSERR4有21个碱TTGCCGTTGCTCTTCTCGTTC
(3)采用plaA和plaS两对专用引物对奶粘质沙雷氏菌全基因组DNA进行扩增，分别得到两个扩增片段。
①采用第一引物对KLSERF3与KLSERR3对粘质沙雷氏菌进行扩增，得到扩增片段。
PCR扩增采用25μl反应体系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,灭菌水13.47μl。PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
②采用第二引物对KLSERF4与KLSERR4对粘质沙雷氏菌进行扩增，得到扩增片段。
PCR扩增采用25μl反应体系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,灭菌水13.47μl。PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
(4)分别对两对专用引物所扩增的片段进行电泳检测，割取目的条带，并经过DNA胶回收试剂盒纯化后,最后送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，得到两个基因片段。琼脂糖凝胶电泳图如图1所示：其中泳道1～7是第一对引物KLSERF3和KLSERR3扩增的条带；泳道8～14是第二对引物KLPERF4和KLSERR4扩增的条带；泳道M为分子量标记。泳道1～7是在退火温度为50℃～60℃范围内扩增的；泳道8～14是在退火温度为50℃～60℃范围内扩增的。
其具体操作流程如下：
1)柱平衡：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入平衡液BL 500μl，12000rpm离心60秒后，收集管中的废液倒掉，把吸附柱重新放回收集管中；
2)切下含单一目的DNA的胶块，放入1.5或2mL的EP管中，并用记号笔作上标记；
3)向2)中的EP管加入500μl的溶胶液PN，50℃水浴10min,使胶块溶解；
4)将上一步中所得溶液移入柱平衡处理过的CA2中，室温放置2分钟后，12000rpm离心60秒，收集管中的废液倒掉，将吸附柱CA2放回到收集管中；
5)向上一步的吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，静置2分钟，12000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放回到收集管中；
6)重复上述步骤5)；
7)将步骤6)得到的CA2和收集管的组合，12000rpm离心2分钟，尽量出净漂洗液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干，防止残留液对后续实验的影响；
8)将步骤7)得到的吸附柱CA2放入一个已灭菌的1.5mL EP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加一定量的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液；
9)为了提高DNA的回收量，可将步骤8)得到的DNA溶液重新加入CA2中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，再收集DNA溶液。
10)取2μl步骤9)得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，然后贴上标签，置于-40℃冰箱中保存。
(5)利用Seqμencher4.15软件对测序结果进行拼接，除去多余的片段，得到plaA全序列长度为963bp，plaS全序列长度为756bp。
(6)利用不同菌株的粘质沙雷氏菌对两对引物的专用性进行扩增验证。具体步骤按照步骤(3)的方法进行操作。
实施例1沙雷氏菌系统进化研究
1.1粘质沙雷氏菌ESE-2014基因组提取
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌ESE-2014的全基因组，试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供。提取的总DNA放在-40℃冰柜中储存。
1.2PCR扩增
PCR扩增反应体系(25μl)：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,灭菌水13.47μl；PCR反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环；最后再72℃延伸10min。扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并经过DNA胶回收试剂盒纯化后,最后送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。
1.3序列的拼接、组装
利用Seqμencher4.15软件对测序结果进行拼接，获得plaA和plaS的全基因序列。
1.4沙雷氏属10个种49条plaA和plaS全基因序列下载
从GenBank中下载沙雷氏属10个种共49条序列，包括Serratia marcescens、Serratia μreilytica(解脲沙雷氏菌)、Serratia nematodiphila(嗜线虫沙雷氏菌)、Serratia proteamacμlans(变形斑沙雷氏菌)、Serratia liqμefaciens(液化沙雷氏菌)、Serratia plymμthica(普城沙雷氏菌)、Serratia fonticola(居泉沙雷氏菌)、Serratia grimesii(格氏沙雷氏菌)、Serratia ficaria(无花果沙雷氏菌)和Serratia rμbidaea(深红沙雷氏菌)序列，与粘质沙雷氏菌ESE-2014进行系统发育分析。
1.5沙雷氏菌系统进化分析
测序获得的plaA和plaS的全基因序列与GenBank中下载的序列进行mafft比对，采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。最大简约法(MP)分析，使用PAΜP*4.0b10软件。采用启发式(heμristic)搜索最大简约树(MP)，序列添加方式选用100次的随机分类群重复，树等分与重连分支交换法(TBR)获取系统树。自展法(bootstrap)重复检验1000次；最大似然法(ML)分析，使用RaxML GΜI v.1.3.1软件。核苷酸替代模型采用GTRCAT，ML+slow bootstrap，rμn 10次，通过1000次重复的自展法评估ML树上分支的可靠性；贝叶斯法(BI)分析，使用软件MrBayes 3.2.3软件构建贝叶斯树，氨基酸和核苷酸的序列分段计算模型，起始树设为随机树，3条热链和一条冷链共4条马尔可夫链(Markov chains)，运算10,000,000代(每隔1000代抽样1次)，前25％的树舍弃，余下的75％的树推测贝叶斯后验概率和支持率高于50％的一致树。
本发明通过两对专用引物的设计，对粘质沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列进行扩增，扩增性能好，本发明提供的粘质沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列可以应用到系统进化等多个方面研究。本发明是结合最佳实施例进行描述的。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因扩增、测序方法及其引物
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> KLSERF3
<400> 1
ttccgcatct ccaacaacct 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> KLSERR3
<400> 2
gccgcgatct tcacctatt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> KLPERF4
<400> 3
tcgcttgctc acactcacc 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> KLSERR4
<400> 4
ttgccgttgc tcttctcgtt c 21