一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产d-乳酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法。首次以粘质沙雷氏菌为出发菌株，开发出一种可生产高纯度D-乳酸的基因工程菌，该基因工程菌不表达乙酰乳酸合成酶。本发明的基因工程菌可高效地生产D-乳酸，产物中L-乳酸含量极低。本发明还提供了该基因工程菌的构建方法，以及优化的生产D-乳酸的方法。
【专利说明】一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法。
【背景技术】
[0002]乳酸(Lacticacid, LA),又称 2_ 羟基丙酸(2-Hydroxy propionic acid)、α-轻基丙酸、丙醇酸，是无氧条件下糖酵解的最终产物，由乳酸脱氢酶作用于丙酮酸和NADH而生成。
[0003]乳酸是世界三大有机酸之一(其它两个为乙酸和丙酮酸)，其用途极为广泛。在食品、医药、化妆品、化工等领域都有运用。乳酸的一些衍生物如乳酸酯和乳酸盐等也经常在不同的行业中被用到。光学纯度在97%以上的D-乳酸即可被视为高光学纯度的D-乳酸，它是多个手性物质的前体，是一个重要的有机合成原料。在农药领域中被用于合成高效低毒的杀虫剂和除草剂，医药和化妆品上也用D-乳酸来合成某些手性物质，具有良好的经济和社会价值。
[0004]乳酸的工业化生产已有100多年的历史了，自从1886年德国学者Leichmann分离得到德氏乳杆菌(Ltobacillusdetbruckii)后，极大的推动了乳酸的工业生产由化学合成法向微生物发酵法的转变。德氏乳杆菌是一株极为优秀的乳酸菌，它可以在50°C下将麦芽汁发酵转化为乳酸。实际上由发酵法得到的乳酸种类主要是由菌种决定的，因菌种不同，发酵后可获得L-乳酸、D-乳酸或消旋体乳酸。L-乳酸的研究步伐开始的较早，目前发酵生产L-乳酸的工艺条件已研究的十分清楚。与L-乳酸相比，D-乳酸除旋光性不同之外其它理化性质都和L-乳酸没有明显差别。因此，现在工业上D-乳酸的生产主要是借鉴L-乳酸已成熟的工艺，其关键则是在于筛选培育高纯度D-乳酸生产菌种。
[0005]因此，本领域有必要培育高纯度D-乳酸生产菌种，以应用于工业化生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法。
[0007]在本发明的第一方面，提供一种应用重组粘质沙雷氏菌生产D-乳酸的方法，包括:
[0008](I)提供重组粘质沙雷氏菌，该菌株中乙酰乳酸合成酶不表达(包括低表达)；
[0009](2)培养⑴的重组粘质沙雷氏菌，从而生产D-乳酸。
[0010]在一个优选例中，步骤(1)中，所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。
[0011]在另一优选例中，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备:
[0012](I)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp_534位序列；
[0013](2)将(I)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；
[0014](3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。
[0015]在另一优选例中，所述的同源交换方法是:将α-乙酰乳酸合成酶基因全长1686bp，将位于该基因43bp-534bp之间的片段克隆到pUTKm上，该质粒转入到粘质沙雷氏菌中之后，上面的α -乙酰乳酸合成酶基因片段会与粘质沙雷氏菌基因组上的α-乙酰乳酸合成酶基因的同源部分发生交换，从而截断该基因，不能正常表达有活性的酶，从而粘质沙雷氏菌失去了合成2，3- 丁二醇的能力。
[0016]在另一优选例中，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤:
[0017]将步骤(1)的重组粘质沙雷氏菌进行驯化培养。
[0018]在另一优选例中，所述的驯化培养方法如下:将重组粘质沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的液体培养基(较佳地为LB培养基)中，在起始pH值 6.0±0.5、28±2°C、200±50rpm 摇床上培养 12±3 小时；
[0019]将经过前述培养的菌液涂布到含50± 10g/L葡萄糖和50± 10g/L乳酸钠的固体培养基(较佳地为LB培养基)上，在37±1°C下培养24~36小时(较佳地12~15小时)，选择平板上体积较大的单个菌落。
[0020]在另一优选例中，步骤(2)中，所述的培养重组粘质沙雷氏菌包括:
[0021](a)在有氧、28±2°C (较佳地，28土 1°C )、pH 值为 7.0±0.3 (较佳地，7.0±0.2)的条件下培养重组粘质沙雷 氏菌，至菌体浓度0D_值达到25-40 (较佳地，28-35)；
[0022](b)向发酵培养基中添加葡萄糖使之终浓度为100±20g/L(较佳地，100±10g/U，在无氧、44±2°C (较佳地，44±1°C )、pH值为6.0±0.3(较佳地，6.0±0.2)的条件下，继续培养36-60小时(较佳地，42-54小时)。
[0023]在另一优选例中，步骤(a)中，在转速700±200rpm(较佳地，700±100rpm)，通气量 200 ± 40vvm (较佳地，200 土 20vvm)下培养；
[0024]步骤(b)中，在转速300± IOOrpm(较佳地，300±50rpm)下培养。
[0025]在另一优选例中，步骤(a)中，发酵培养基成分为:葡萄糖60±10g/L，酵母粉20±4g/L，NaCl 5± lg/L，KH2PO4 5±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。
[0026]在本发明的另一方面，提供一种重组粘质沙雷氏菌，该菌株的基因组中所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。
[0027]在一个优选例中，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备:
[0028](I)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp_534位序列；
[0029](2)将⑴所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；
[0030](3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。
[0031]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】[0032]图1、氧对D-乳酸产量和OD6tltl值的影响。
[0033]图2、温度对D-乳酸产量和OD6tltl值的影响。
[0034]图3、pH值对D-乳酸产量和0D_值的影响。
[0035] 图4、经驯化的菌株与驯化前的菌株的活力比较。
【具体实施方式】
[0036]本发明经过深入的研究，首次以粘质沙雷氏菌为出发菌株，开发出一种可生产高纯度D-乳酸的基因工程菌，该基因工程菌的基因组中含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶，因而不表达乙酰乳酸合成酶。本发明的基因工程菌的可高效地生产D-乳酸，产物中L-乳酸含量极低。本发明还提供了该基因工程菌的构建方法，以及优化的生产D-乳酸的方法。
[0037]术语
[0038]如本文所用，所述的“粘质沙雷氏菌”，又称灵杆菌，属于肠道杆菌科沙雷氏菌属，为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌。粘质沙雷氏菌为非苛求性微生物，可利用多种碳源，如壳聚糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、纤维二糖、柠檬酸甘油等，如此广泛的碳源谱为其发酵生产提供了有利的条件。
[0039]除非另外说明，本发明中所述的“乙酰乳酸合成酶”是指“ α -乙酰乳酸合成酶”。
[0040]除非另外说明，本发明中所述的“基因工程菌”是指“重组粘质沙雷氏菌”。
[0041]如本文所用，所述的“同源交换”是指由两条具有同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片断交换(crossing over)的过程。
[0042]如本文所用，所述的“接合转移”是细菌的基因转移的一种方式，在细菌的细胞相互接触时遗传信息由一个细胞转移到另一个细胞。
[0043]如本文所用，所述的“不表达乙酰乳酸合成酶的菌株”是指一种菌株，其与相应的野生型菌株(即未突变乙酰乳酸合成酶基因的相同菌株)相比，乙酰乳酸合成酶的表达量(或酶活)降低了 90%以上，更优选地降低了 95%以上，最优选地降低了 97%以上，如降低了98%、99%或100% (即完全不表达乙酰乳酸合成酶)。
[0044]基因工程菌
[0045]本发明人深入研究后发现，通过将粘质沙雷氏菌中乙酰乳酸合成酶失活，可阻断乙偶姻和2，3- 丁二醇代谢途径，使碳源主要流向D-乳酸，从而可培育出高产D-乳酸的菌株。
[0046]本发明提供了一种高产D-乳酸的重组粘质沙雷氏菌，所述的重组粘质沙雷氏菌不表达乙酰乳酸合成酶。更特别地，所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，乙酰乳酸合成酶基因插入失活而不表达。
[0047]乙酰乳酸合成酶是乙偶姻和2，3- 丁二醇代谢途径相关的一种酶。粘质沙雷氏菌中的乙酰乳酸合成酶GenBank登录号为JF519737。目前本领域技术人员对于在粘质沙雷氏菌中乙酰乳酸合成酶的表达情况与D-乳酸生产的关系还不清楚。
[0048]阻止乙酰乳酸合成酶表达或活性的方法是多种多样的，例如可通过特异性结合乙酰乳酸合成酶的抗体或配体来抑制其活性；或利用小RNA分子或反义核苷酸从转录水平上抑制乙酰乳酸合成酶表达等等。而本发明人发现，对乙酰乳酸合成酶的编码基因进行突变是最优选的方式。
[0049]对于乙酰乳酸合成酶的编码基因进行突变的方法是多种多样的，如存在于一个或多个关键位点(发挥酶活性的关键位点或关键结构域)上的点突变，或存在于一个或多个位置的插入突变，或存在于一个或多个位置的缺失突变等；此外，近期sigma公司推出了一种基于二类内含子的基因敲除系统TargeTron? Gene Knockout System,可用于进行基因敲除。上述这些方式均可用于本发明。作为本发明的特别优选的方式，对乙酰乳酸合成酶的编码基因(乙酰乳酸合成酶基因)进行插入突变。本发明人发现，插入突变可以最彻底地阻止乙酰乳酸合成酶基因的表达，使得所述的基因工程菌不表达乙酰乳酸合成酶。因此，本发明人尝试了多种乙酰乳酸合成酶基因突变方式后，优选采用插入突变的方式。
[0050]能够使得乙酰乳酸合成酶基因不表达的基因突变方式均是可用的，例如可以在乙酰乳酸合成酶基因内部插入至少一种其它基因(如乙酰乳酸合成酶基因片段、氯霉素抗性基因)，破坏其原有的编码方式，从而使得乙酰乳酸合成酶表达量下降。作为本发明的更优选方式，所述的基因工程菌的基因组中，乙酰乳酸合成酶基因序列的内部插入了 500bp的乙酰乳酸合成酶基因片段。更优选地，本发明采用的是乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534bp位的片段。该长度既适合于基因操作，且突变效果良好，其在插入乙酰乳酸合成酶基因序列的内部后，完全地阻止了乙酰乳酸合成酶基因的表达。
[0051]本发明构建的重组粘质沙雷氏菌株易于培养，能够利用的碳源广泛，抗污染能力强，产物D-乳酸构型单一，为光学纯，对于工业生产具有重要意义。
[0052]重组粘质沙雷氏菌的构建
[0053]本发明还提供了一种制备所述的重组粘质沙雷氏菌的方法，包括:构建用以插入失活乙酰乳酸合成酶基因的打靶质粒，将打靶质粒转入受体粘质沙雷氏菌，筛选发生同源交换的基因工程菌。`较佳地，该方法包括:(I)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因片段序列，其不编码乙酰乳酸合成酶；(2)将(I)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得突变的乙酰乳酸合成酶基因序列整合到粘质沙雷氏菌的基因组；和(3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。
[0054]作为本发明的优选方式，用于构建打靶质粒的质粒选自:pUTKm、pSUP202、PSUP203、pLOl、pPHU281、pSZ21 ;更优选的，所述的打靶质粒是pUTKm。
[0055]外源DNA转入粘质沙雷氏菌的方法主要有接合转移、转化或噬菌体转染，这些方式均可用于本发明。转化的方法在1982年就被C.S.F0RNARI和S.KAPLAN建立，最高可以达到每个存活细胞5X 10_6的转化效率(Fornari CS, Kaplan S.1982.Genetic-Transformation of Rhodopseudomonas-Sphaeroides by Plasmid DNA.Journalof Bacteriology 152 (I):89-97)?
[0056]本发明人发现，接合转移的方法是较为有效的。通过接合转移的方法将打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内。所述的质粒为一种自杀质粒(suicide plasmid),其具有接合转移基因。在构建基因缺失工程菌时，需要选择适当的自杀质粒。自杀质粒的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。[0057]作为本发明的优选方式，在进行接合转移时，先将打靶质粒转化到具有接合转移功能的大肠杆菌中，混合培养带有打靶质粒的大肠杆菌和粘质沙雷氏菌，从而打靶质粒通过接合转移进入粘质沙雷氏菌中。所述的大肠杆菌优选的是大肠杆菌E.coli S17-1 λ Pir0
[0058]为了确认所选择获得的基因工程菌为发生了同源交换的基因工程菌(即乙酰乳酸合成酶基因被插入失活的细菌)，还可对其进行鉴定。鉴定的方法包括但不限于=PCR方法、Southern杂交方法或乳酸合成酶酶活测定方法。
[0059]生产D-乳酸的方法
[0060]现有技术中，通常应用粘质沙雷氏菌生产2，3- 丁二醇，而D-乳酸一般被作为粘质沙雷氏菌发酵生产2，3- 丁二醇过程中的一个副产物。而本发明中，通过改变菌株代谢途径中的酶，实现了 D-乳酸的高产。
[0061]因此，本发明还提供了一种生产D-乳酸的方法，包括:(I)提供重组粘质沙雷氏菌，该菌株中乙酰乳酸合成酶不表达(包括低表达)；(2)培养(I)的重组粘质沙雷氏菌，从而生产D-乳酸。更具体地，本发明的方法利用自杀载体将粘质沙雷氏菌染色体上的乙酰乳酸合成酶基因插入失活，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到D-乳酸。
[0062]为了尽可能地提高D-乳酸的产量，对于应用本发明的重组粘质沙雷氏菌生产D-乳酸的方法，本发明人还针对各项发酵条件进行了改进。
[0063]作为本发明的优选方式，将所述的重组粘质沙雷氏菌进行驯化，使之在含有葡萄糖和乳酸盐的培养基中生长活力显著增加。所述的驯化培养方法如下:将重组粘质沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的液体培养基(较佳地为LB培养基)中，在起始pH值6.0 ± 0.5、28 ± 2 °C、200 土 50rpm摇床上培养12 ± 3小时；将经过前述培养的菌液涂布到含50± 10g/L葡萄糖和50± 10g/L乳酸钠的固体培养基(较佳地为LB培养基)上，在37±1°C下培养24~36小时，选择平板上体积较大的单个菌落。经验证，驯化后获得的菌体在葡萄糖培养基中的生长活力和乳酸盐耐受性均得到了很大提升。
[0064]通过单因素实验探索了发酵工艺条件中最主要的三项:氧、温度、pH值对菌体生长代谢的影响。经过反复实验比较，发现:菌体在有氧条件下，温度为28°C，pH值为7.0时生长相对活跃；在无氧条件下，温度为44°C，pH值为6.0时比较适合D-乳酸的生产积累。因此，本发明人将发酵的调控策略确定为两步法，即前期菌体的生长阶段和后期D-乳酸的生产积累阶段。
[0065]作为本发明的优选方式，菌体生长阶段的培养条件如下:在有氧、28±2°C (较佳地，28 土 1°C )、pH值为7.0±0.3 (较佳地，7.0±0.2)的条件下培养重组粘质沙雷氏菌，至菌体浓度0D_值达到25-40 (较佳地，28-35)。作为本发明的优选方式。更优选地，在转速700 土 200rpm (较 佳地，700 土 IOOrpm)，通气量 200 土 40vvm (较佳地，200 土 20vvm)下培养。
[0066]作为本发明的优选方式，D-乳酸的生产积累阶段的培养条件如下:向发酵培养基中添加葡萄糖使之终浓度100±20g/L(较佳地，100±10g/L)，在无氧、44±2°C (较佳地，44± 1°C )、pH值为6.0±0.3 (较佳地，6.0±0.2)的条件下，继续培养36-60小时(较佳地，42-54小时)。更优选地，在转速300± IOOrpm(较佳地，300±50rpm)下培养。
[0067]培养基成分的优化主要集中于氮源和碳源的选择以及培养基各组分浓度的初步优化上。使用的优化实验方案包括单因素实验、PB实验设计、响应面分析等。作为本发明地优选方式，发酵培养基成分为:葡萄糖60±10g/L，酵母粉20±4g/L，NaCl 5 ± lg/L, KH2PO45±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。优化后的种子培养基和发酵培养基在降低原先成本的基础上提高了 D-乳酸的表达量。
[0068]本发明的主要优点在于:
[0069](I)使用本发明的重组粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸，充分利用了该菌体在发酵生产环境友好型产物方面的潜力。利用粘质沙雷氏菌还有以下特点:重组粘质沙雷氏菌株易于培养，能够利用的碳源广泛，抗污染能力强，产物D-乳酸构型单一，为光学纯。
[0070](2)本发明构建的重组粘质沙雷氏菌能够稳定传代和生产D-乳酸，具有利用多种碳源的能力，生长迅速和不容易污染，非常适合于作为工业化菌种。
[0071]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0072]实施例1、乙酰乳酸合成酶基因阻断载体pUTKm-ALS的构建
[0073]用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取粘质沙雷氏菌MGl (购自Omega)的基因组DNA。[0074]以粘质沙雷氏菌MGl基因组DNA为模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示序列为PCR引物，扩增α-乙酰乳酸合成酶基因内约500bp的序列(为GenBank登录号JF519737的α -乙酰乳酸合成酶基因序列中第43-534位)，称为ALS。
[0075]SEQ ID NO:1:attggtaccCCGTCAACCCGCAGCCAGAGTA ；
[0076]SEQ ID NO:2:attagtactCCTTCTGTTCGCCGATGCGGAG ；
[0077]将扩增到的α -乙酰乳酸合成酶基因部分序列用限制性内切酶KpnI和ScaI进行酶切，酶切产物插入到PUTKm载体(GenBank:AF102233.1)的相应位点中，转化大肠杆菌E.coli S17-1 λ pir,挑取重组子并验证,得到重组质粒pUTKmALS。
[0078]实施例2、粘质沙雷氏菌中α -乙酰乳酸合成酶基因的敲除
[0079]将含有pUTKmALS的重组大肠杆菌Ε.coli S17-1 λ pir与粘质沙雷氏菌MGl进行接合转移，使PUTKmALS进入粘质沙雷氏菌与其基因组进行同源重组，从而插入失活α -乙酰乳酸合成酶基因，从而使其不能产生2，3- 丁二醇。
[0080]具体操作如下:在30ml含有卡那霉素抗生素的LB培养基中培养供体菌E.coliS17-1 λ pir(内含pUTKmALS)和受体菌粘质沙雷氏菌MGl，过夜培养；按照1%接种量将上述供体菌和受体菌转接入50ml的LB培养基中培养2h ;供体菌和受体菌按照体积比3:1的比例混合，离心并且去上清，加入100 μ I的新鲜LB培养基重悬菌体；将已经灭菌的0.45μπι滤膜平铺在不加抗生素的LB平板上，取5 μ I悬浮菌液点在滤膜上，37 V中倒置培养8小时以上；取出滤膜，放入含有Iml的LB液体培养基的EP管中振荡培养，取出100 μ I涂布在含200 μ g/ml卡那霉素和100μ g/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，37 °C培养箱中倒置培养。能够生长出来的即是发生同源重组的粘质沙雷氏菌。
[0081]之后，对生长出的粘质沙雷氏菌进行鉴定。采用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4扩增片段，之后电泳鉴定，700bp处有条带的为突变菌株，无条带的为野生菌。经PCR验证，获得α -乙酰乳酸合成酶基因被插入失活的重组粘质沙雷氏菌，该菌株因为不能产生α -乙酰乳酸合成酶，从而不能生成2，3- 丁二醇，转而生成大量D-乳酸。[0082]SEQ ID NO:3:AACAGGCAATGACTGGCAATGCG ；
[0083]SEQ ID NO:4:GAAGTAAGTTGGCCGCAGTG。
[0084]a -乙酰乳酸合成酶基因全长1686bp，将位于该基因43bp_534bp之间的片段克隆到pUTKm上，该质粒转入到粘质沙雷氏菌中之后，上面的a -乙酰乳酸合成酶基因片段会与粘质沙雷氏菌基因组上的a-乙酰乳酸合成酶基因的同源部分发生交换，从而截断该基因，不能正常表达有活性的酶，从而粘质沙雷氏菌失去了合成2，3- 丁二醇的能力。
[0085]实施例4、重组菌株适应发酵产生D-乳酸的驯化培养
[0086]为提高重组粘质沙雷氏菌菌株耐受乳酸的能力，对菌体进行驯化筛选。以LB培养基为出发培养基，在培养基中添加50g/L的葡萄糖和50g/L的乳酸钠，以此为筛选培养基筛选菌体。将常规方法活化后的菌种接入培养基中，接种前向培养基中添加卡那霉素，使其浓度为100 μ g/mL。起始pH值为6.0，在28°C，200rpm摇床上培养12h。再将含1.5%(w/w)琼脂粉的固体筛选培养基制成平板，将菌液涂布到平板上，37°C下培养24~36h，选择平板上体积较大的单个菌落进行保种。
[0087]经以上步骤的筛选得到经驯化的菌株与驯化前的菌株进行比较。使用发酵培养基(葡萄糖 30g/L ;酵母粉 20g/L ;KH2P04 8g/L ；NaCl 5g/L ；MgS04 0.5g/L ；MnS04 0.05g/L)，通过摇瓶实验验证对比。按5%(v/v)的接种量分别接种驯化前和驯化后的菌株，在有氧条件、28°C、pH值为7.0的条件下培养12h，测定菌体浓度0D_值；然后再转入无氧条件、44°C、pH值为6.0的条件下培养至48h，测定发酵液中的D-乳酸含量，结果如图4。因此可见，驯化后的菌株在含有葡萄糖的培养基中生长活力远远优于驯化之前的菌株。这表明经过驯化的菌体的生长活力和乳酸盐耐受性均得到了提升。
[0088]实施例5、重组菌摇瓶发酵D-乳酸的条件和培养基优化
[0089]通过单因素实验探索了发酵工艺条件中最主要的三项:氧、温度、pH值对菌体生长代谢的影响。
[0090](1)氧气对菌体生长及乳酸生成的影响
[0091]利用初始种子培养基和初始发酵培养基在摇瓶实验中考察氧气对菌体的整个代谢状况的影响。按5%(v/v)的接种量将活化后的菌种液接入到装有50mL初始发酵培养基的250mL螺丝口三角瓶中，再在28°C下分别进行有氧培养(摇床转速为200rpm，下同)和无氧培养12h。测定菌体浓度0D600值,考察氧气对菌体生长的影响。然后在适合菌体生长的条件下重复刚才的菌体生长的摇瓶实验，培养12h后再分别在有氧和无氧条件下培养至48h，考察氧气对乳酸生产积累的影响。
[0092](2)温度对菌体生长及乳酸生成的影响
[0093]利用初始种子培养基和初始发酵培养基在摇瓶实验中考察温度对菌体的整个代谢状况的影响。按5%(v/v)的接种量将活化后的菌种液接种到装有50mL初始发酵培养基的250mL螺丝口三角瓶中，后分别置于28°C、37°C、44°C下有氧培养12h，测定菌体浓度0D600值，考察温度对菌体生长的影响。选出最适生长温度后，再在最适生长温度下重复菌体生长的摇瓶实验，培养12h后分别置于28°C、37°C、44°C、50°C下无氧培养至48h，考察温度对乳酸生产积累的影响。
[0094](3) pH值对菌体生长及乳酸生成的影响
[0095]利用初始种子培养基和初始发酵培养基在摇瓶实验中考察pH值对菌体的整个代谢状况的影响。按5%(v/v)的接种量将活化的菌种液接种到装有50mL初始发酵培养基的250mL螺丝口三角瓶中，在28°C下有氧培养，使用NaOH分别将初始发酵培养基的初始pH值调为6.0、7.0、9.3培养12h，测定菌体浓度0D600值，考察pH值对菌体生长的影响。选出最适生长pH值后再在最适生长pH值下重复菌体生长的摇瓶实验，培养12h后分别将pH控制在6.0,7.0,9.3并于无氧条件下培养至48h，考察pH值对乳酸生产积累的影响。
[0096]⑷结果
[0097]结果如图1-3，发现菌体在有氧条件下，温度为28°C，pH值为7.0时生长相对活跃；在无氧条件下，温度为44°C，pH值为6.0时比较适合D-乳酸的生产积累。因此将发酵的调控策略确定为两步法，即前期菌体的生长阶段和后期D-乳酸的生产积累阶段。
[0098]培养基成分的优化主要集中于氮源和碳源的选择以及培养基各组分浓度的初步优化上。使用的优化实验方案包括单因素实验、PB实验设计、响应面分析等。优化的目标主要是提高菌体浓度0D_值和提升D-乳酸的表达量这两项。优化后的种子培养基和发酵培养基在降低原先成本的基础上提高了 D-乳酸的表达量。
[0099]最后确定菌种的最适生长条件:pH值7.0,温度28°C,有氧培养。
[0100]最后确定发酵生产D-乳酸的最适条件:pH值6.0,温度44°C,无氧培养。
[0101]种子培养基(g/L):葡萄糖30 ;酵母粉 20 ；KH2PO4 8 ；NaCl 5 ；MgS04 0.5 ；MnSO4
0.05。
[0102]发酵培养基成分(g/L):葡萄糖60，酵母粉 20，NaCl 5，KH2PO4 5，MgSO4 0.5, MnSO4
0.05。
[0103]实施例6、重组菌发酵罐放大实验
[0104]在3.7L发酵罐上做前面构建的重组粘质沙雷氏菌的发酵实验时，发酵液的装液量为2L。按5%接种量将菌株接种到发酵罐培养基。在有氧条件、28°C、pH值为7.0的条件下培养9h，由于菌体的初始浓度较高，有氧阶段中发酵罐搅拌桨转速为700rpm，通空气量为200vvm。当发酵培养至9h时向发酵培养基中添加终浓度到100g/L的葡萄糖，关闭通气阀门和排气阀门，将搅拌转速降低至300rpm以维持发酵液的均匀，并将发酵温度升至44°C，pH值调至6.0,继续培养至48h。
[0105]经检测，发酵培养9h时，菌体浓度OD6tltl值增加到33.24，进入生长阶段稳定期的菌体0D_值在20左右。9h时添加到发酵培养基中的100g/L的葡萄糖在发酵至48h时耗尽，D-乳酸在48h时的浓度为83.5g/L,由于D-乳酸只在无氧条件下产生,无氧发酵至48h的过程中乳酸转化率为83.5%。通过使用乳酸试剂盒测定发现，发酵液中L-乳酸含量为0.9g/L,即D-乳酸的光学纯度为98.9%。
[0106]本发明的发酵策略成功地提高了 D-乳酸的浓度，同时48h内将100g/L的葡萄糖耗尽。
[0107]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种应用重组粘质沙雷氏菌生产D-乳酸的方法，其特征在于，包括: (1)提供重组粘质沙雷氏菌，该菌株中乙酰乳酸合成酶不表达； (2)培养(I)的重组粘质沙雷氏菌，从而生产D-乳酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备: (1)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列； (2)将(I)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活； (3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑴和步骤(2)之间，还包括步骤: 将步骤(1)的重组粘质沙雷氏菌进行驯化培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的驯化培养方法如下:将重组粘质沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的液体培养基中，在起始pH值6.0±0.5、28±2°C、200±50rpm 摇床上培养 12±3 小时； 将经过前述培养的菌液涂布到含50 ±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的固体培养基上，在37±1°C下培养24~36小时(较佳地12~15小时)，选择平板上体积较大的单个菌落。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的培养重组粘质沙雷氏菌包括: (a)在有氧、28±2°C、pH值为7.0±0.3的条件下培养重组粘质沙雷氏菌，至菌体浓度OD600 值达到 25-40 ； (b)向发酵培养基中添加葡萄糖使之终浓度为100±20g/L，在无氧、44±2°C、pH值为6.0±0.3的条件下，继续培养36-60小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，在转速700±200rpm，通气量200±40vvm 下培养； 步骤(b)中，在转速300 ± IOOrpm下培养。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，发酵培养基成分为:葡萄糖60±10g/L，酵母粉 20±4g/L，NaCl 5± lg/L，KH2PO4 5±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。
9.一种重组粘质沙雷氏菌，该菌株的基因组中所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。
10.如权利要求9所述的重组粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备: (1)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列； (2)将(I)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；(3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。
【文档编号】C12R1/43GK103667374SQ201210349403
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】沈亚领, 饶犇, 苏刚, 满永博, 白方敏, 魏东芝 申请人:华东理工大学