本发明涉及番茄灰霉病的生物防治
技术领域：
，特别是涉及一种诱抗番茄灰霉病的混合发酵液及其制备方法。
背景技术：
：植物诱导抗病性也称系统获得抗性(SAR)，是指植物的某些部位在受到低毒或弱毒的病原菌或病原菌代谢物处理后，可诱导植物体产生一些保护物质，从而使植物由原来的易感状态转变为局部或整体对抗某种或某类病原物侵染的现象。由诱抗剂引发的SAR有以下四大特点和优点：一是系统性，即这种反应可以从诱导部位传遍全株，既可在诱导部位发生，也可以被传导到植物未经处理的其他组织或器官起作用，还可通过嫁接传递；二是持久性，SAR一经诱导，一般能持续几周至几个月，甚至在植物整个生长期起作用，持效期长；三是广谱性，SAR虽然是被特定诱抗剂诱导的，但作用却是广谱的，对真菌、细菌和病毒等多种病原物都起作用，这是因为诱导引起了SAR基因的启动和表达，导致一系列生理、生化和细胞学上的变化，进而抑制了病害的发生和扩展；四是安全性，即对人畜无毒、对环境安全，因为诱抗剂的作用机制是诱导植物内在抗病潜力，对病原物没有选择压力，不易产生抗药性，所以对环境也不产生副作用，这是许多化学杀菌剂所没有的优点，符合绿色、生态农业的发展趋势。番茄主要在设施内种植，设施的特殊环境条件使番茄灰霉病的发生越来越严重，每年有30％左右面积的番茄死苗和烂果，尤其早期第1-2穗果受害最严重，流行年份的发病率更高达50％以上，甚至绝产。同时由于生产上仍缺少抗病品种，且灰霉病菌已对多种化学杀菌剂产生了抗药性，防治效果大大降低，并且施药主要以果实为靶标，造成果实的农药残留超标，严重制约了番茄的安全生产。菜农在生产中主要利用化学农药来防治该病，能挽回总产量的15-30％，但农产品污染事件接连不断的发生，食品安全问题已成为民生的热点话题。目前市场也有防治番茄灰霉病的生物农药销售和使用，但现有的生物农药主要是在番茄灰霉病发生后使用，并且生物农药见效较慢，对使用环境的温度、光照等条件较为苛刻，另外对番茄产量也有一定影响。技术实现要素：针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诱抗番茄灰霉病的混合发酵液及其制备方法。该混合发酵液以黑根霉和拟康氏木霉的次生代谢物作为有效成分，可提早、并有效的提高番茄对灰霉病的抗性，大幅降低番茄灰霉病的发生；而且该混合发酵液的使用环境更为宽松，对人畜安全无害，环境兼容性好。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种诱抗番茄灰霉病的混合发酵液，所述混合发酵液是由黑根霉和拟康氏木霉经混合发酵制备而成。本发明所选用的黑根霉为保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9；该菌株已经记载在专利“一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用”(CN104017736A)中。本发明所选用的拟康氏木霉为保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI；该菌株已经记载在专利“一种复合生物土壤改良剂及其应用”(CN102391876A)中。本发明的第二方面，提供上述诱抗番茄灰霉病的混合发酵液的制备方法，步骤如下：(1)将黑根霉和拟康氏木霉进行活化处理；(2)将活化后的黑根霉和拟康氏木霉接种于发酵培养基中，在22-30℃、100-130r/min的条件下培养5-7天，过滤，滤液浓缩，即得诱抗番茄灰霉病的混合发酵液。步骤(1)中，所述活化处理的方法为：将黑根霉和拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。步骤(2)中，活化后的拟康氏木霉和黑根霉接种量的比为(3-5)：1。步骤(2)中，所述发酵培养基为PDB培养基。所述PDB培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml；其制备方法如下：将马铃薯切成0.5cm左右厚的小块，放入水中，煮沸20min后，4层纱布过滤，取滤液(加水定容至1000ml)，煮沸后加入葡萄糖，完全溶解后，分装于500ml的三角瓶中，装量为200ml，126℃、0.15MPa条件下高压蒸汽灭菌30min，备用。步骤(2)中，在35-45℃下浓缩滤液5-10倍。(即浓缩后滤液的质量为浓缩前滤液质量的1/5-1/10)。步骤(2)中，制备的诱抗番茄灰霉病的混合发酵液中，孢子数不少于108个/ml。本发明的第三方面，提供上述混合发酵液在制备诱抗番茄灰霉病的生防制剂中的应用。本发明的第四方面，提供一种诱抗番茄灰霉病的生防制剂，由上述的混合发酵液和常规的助剂制备而成；其活性成分为上述的混合发酵液。所述生防制剂的剂型为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散颗粒剂和悬浮剂等。本发明还提供上述混合发酵液或生防制剂诱抗番茄灰霉病的应用方法，步骤为：将上述的混合发酵液或生防制剂加水稀释，在番茄初花后7-10天内叶面喷施，之后每隔10-15天可喷施一次。本发明的有益效果：(1)本发明以保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉作为诱抗菌株，其混合发酵液可以明显提高番茄对灰霉病的诱抗作用。其中，保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉，前期主要是关于该菌株能够产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的研究；保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉，前期主要是关于该菌株在防治黄瓜黄萎病和棉花枯萎病中的应用研究。本发明意外的发现，以保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉作为中心组分，经发酵后得到的混合发酵液能明显提高番茄对灰霉病的诱抗作用，番茄灰霉病的诱抗效果可达87.9％。(2)本发明的混合发酵液是由黑根霉和拟康氏木霉经混合发酵而成，涉及上述两株诱抗菌株的初级代谢和次级代谢，化学成分复杂；而且，通过混合发酵的过程，增加了上述两菌株的协同作用方式和化学成分的渗透性，提高了作用效率。(3)本发明所使用的黑根霉和拟康氏木霉均来源于自然环境，能有效诱导番茄对灰霉病菌的系统抗性，其使用方法简便，对环境无污染，对人畜无毒；发酵液生产方法简便、周期短，所用原料廉价，易于大规模批量生产，生产成本低。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
背景技术：
所介绍的，现有技术中防治番茄灰霉病的生物农药主要是在番茄灰霉病发生后使用，生物农药的见效较慢，对使用环境的温度、光照等条件较为苛刻。基于此，本发明提供了一种新型的诱抗番茄灰霉病的混合发酵液。在本申请的一种实施方式中，提供了该诱抗番茄灰霉病的混合发酵液的制备方法，步骤如下：(1)将保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉进行活化处理；活化处理的方法为：将黑根霉和拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。(2)将活化后的黑根霉和拟康氏木霉接种于发酵培养基中，在22-30℃、100-130r/min的条件下培养5-7天，过滤，在35-45℃下浓缩滤液5-10倍，即得诱抗番茄灰霉病的混合发酵液。由于保藏编号为CGMCCNO.1443的黑根霉目前已知的功能为：产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖，可用于制备抗肿瘤药物或辅助药物。本发明在试验过程中发现：该黑根霉对番茄灰霉病还具有一定的诱抗作用；特别是将保藏编号为CGMCCNO.1443的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉组合使用，进行混合发酵，制备得到混合发酵液，可以显著提高对番茄灰霉病的诱抗作用，具有明显的协同增效效果。黑根霉和拟康氏木霉的形态性质各不相同，而且在生长过程中也会分泌多种具有不同生理功能的活性物质，本发明将黑根霉和拟康氏木霉进行混合发酵可以起到功能互补和增强的作用；而且这两株菌在混合发酵过程中可以互为对方提供所需的生长因子，有效促进了微生物的生长速度和产物得率。但在混合发酵过程中，如何实现各微生物之间最佳平衡的控制是难点所在，为了综合筛选黑根霉和拟康氏木霉的特异功效和相互间的增效作用以及最佳复合配比，本发明对此进行了优化筛选。在本发明的一个优选的实施方案中，活化后的拟康氏木霉和黑根霉接种量的比为(3-5)：1。筛选试验发现，黑根霉和拟康氏木霉接种量的比例会影响对番茄灰霉病的诱抗作用，将拟康氏木霉和黑根霉按(3-5)：1接种进行混合发酵时，其对番茄灰霉病的诱抗效果较佳。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。实施例1：诱抗番茄灰霉病的混合发酵液的制备(1)菌株的活化将保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。PDA平板培养基：马铃薯(去皮、挖净芽眼)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，马铃薯切0.5cm左右厚的小块，放入水中，煮沸20min后，4层纱布过滤，取滤液(加水定容至1000ml)，煮沸后依次加入葡萄糖、琼脂，完全溶解后，分装于250ml的三角瓶中，装量为100ml，126℃、0.15MPa条件下高压蒸汽灭菌30min，倒平板，备用。(2)混合发酵液的制备：用Φ6mm打孔器在长满拟康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培养基边缘打菌饼，将拟康氏木霉和黑根霉菌饼按4:1的比例用无菌接种环接种于PDB培养基中，在28℃、120r/min的恒温振荡器中培养6天后，4层纱布过滤，在40℃下浓缩滤液8倍，即得诱抗番茄灰霉病混合发酵液，其孢子数>108个/ml，置于4℃冰箱备用。PDB培养基：马铃薯(去皮、挖净芽眼)200g、葡萄糖20g、水1000ml，马铃薯切0.5cm左右厚的小块，放入水中，煮沸20min后，4层纱布过滤，取滤液(加水定容至1000ml)，煮沸后加入葡萄糖，完全溶解后，分装于500ml的三角瓶中，装量为200ml，126℃、0.15MPa条件下高压蒸汽灭菌30min，备用。实施例2：诱抗番茄灰霉病的混合发酵液的制备(1)菌株的活化将保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。PDA平板培养基同实施例1。(2)混合发酵液的制备：用Φ6mm打孔器在长满拟康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培养基边缘打菌饼，将拟康氏木霉和黑根霉菌饼按3:1的比例用无菌接种环接种于PDB培养基中，在22℃、130r/min的恒温振荡器中培养7天后，4层纱布过滤，在35℃下浓缩滤液5倍，即得诱抗番茄灰霉病混合发酵液，其孢子数不少于108个/ml，置于4℃冰箱备用。PDB培养基同实施例1。实施例3：诱抗番茄灰霉病的混合发酵液的制备(1)菌株的活化将保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。PDA平板培养基同实施例1。(2)混合发酵液的制备：用Φ6mm打孔器在长满拟康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培养基边缘打菌饼，将拟康氏木霉和黑根霉菌饼按5:1的比例用无菌接种环接种于PDB培养基中，在30℃、100r/min的恒温振荡器中培养5天后，4层纱布过滤，在45℃下浓缩滤液10倍，即得诱抗番茄灰霉病混合发酵液，其孢子数不少于108个/ml，置于4℃冰箱备用。PDB培养基同实施例1。对比例1：(1)菌株的活化将保藏编号为CGMCCNO.1443的拟康氏木霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。PDA平板培养基同实施例1。(2)单独发酵液的制备：将活化后的拟康氏木霉用无菌接种环接种于PDB培养基中，在28℃、120r/min的恒温振荡器中培养6天后，4层纱布过滤，在40℃下浓缩滤液8倍，得拟康氏木霉单独发酵液，其孢子数不少于108个/ml。PDB培养基同实施例1。对比例2：(1)菌株的活化将保藏编号为CGMCCNO.8436的黑根霉接种在PDA平板培养基上，24℃恒温培养48h。PDA平板培养基同实施例1。(2)单独发酵液的制备：将活化后的黑根霉用无菌接种环接种于PDB培养基中，在28℃、120r/min的恒温振荡器中培养6天后，4层纱布过滤，在40℃下浓缩滤液8倍，得黑根霉单独发酵液，其孢子数不少于108个/ml。PDB培养基同实施例1。对比例3：将对比例1和对比例2制备的拟康氏木霉单独发酵液和黑根霉单独发酵液按质量比为4：1混合，其余按实施例1的方法制备得到混合发酵液。对比例4：将实施例1中的“黑根霉”替换为“枯草芽孢杆菌”，按实施例1的方法制备得到混合发酵液。该枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.1442，该菌株已经记载在专利“一种复合生物土壤改良剂及其应用”(CN102391876A)中。对比例5：将实施例1中的“拟康氏木霉”和“黑根霉”接种量的比例调整为1：1，其余按实施例1的方法制备得到混合发酵液。对比例6：将实施例1中的“拟康氏木霉”和“黑根霉”接种量的比例调整为1：4，其余按实施例1的方法制备得到混合发酵液。应用例1：1.试验材料：番茄试验材料为安达3号，来源于寿光市金圣种苗有限公司，在山东农业工程学院院内日光温室内种植，采用大小行栽培方式(大行80cm、小行60cm)，株距40cm。生防制剂材料为实施例1、对比例1-3制备的发酵液，市售的产品腐霉利(50％可湿性粉剂1000x，日本住友化学株式会社)、嘧菌胺(400g/l悬浮剂800x，拜耳作物科学公司)。2.试验方法：将番茄试验材料分为7个处理组，每个处理组的面积为60m2，每个处理设置3个重复。在番茄初花后7天，处理组1用实施例1制备的混合发酵液稀释100倍后叶面喷施；处理组2-4分别用对比例1-3制备的混合发酵液稀释100倍后叶面喷施；处理组5用腐霉利进行叶面喷施；处理组6用嘧菌胺进行叶面喷施；7天后各处理组再喷一次。处理组7不进行任何处理，作为空白对照。10天后调查各处理组番茄植株灰霉病的病情指数并计算诱抗(防治)效果和植株座果率。3.试验结果：试验结果见表1。表1：各处理番茄灰霉病病情指数和诱抗(防治)效果处理病情指数诱抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)处理组14.287.0495.0处理组212.960.1981.0处理组315.651.8572.4处理组47.975.6284.7处理组55.383.6491.2处理组64.685.8094.0处理组732.4-80.2由表1可以看出：在温室条件下，本发明实施例1制备的混合发酵液能够较好的诱导番茄植株对灰霉病的系统抗性；与单独使用拟康氏木霉发酵液(处理组2)和单独使用黑根霉发酵液(处理组3)相比，番茄灰霉病的病情指数明显降低，诱抗效果得到较大提升，说明拟康氏木霉和黑根霉联合使用具有协同增效作用，并且可提高番茄植株的座果率；与处理组4相比，处理组1的防治效果仍有较显著的改善，说明将拟康氏木霉和黑根霉进行混合发酵可以进一步的增强这两株菌之间的协同作用；与市售的产品(处理组5和处理组6)相比，其对番茄灰霉病的诱抗效果与之相当，甚至更优；但上述市售的化学农药产品如果施用不当或过度施用后，会造成番茄产品的农药残留超标。而本发明的混合发酵液生产方法简便、周期短，所用原料廉价，可提早、有效提高番茄植株的系统抗性，并且环境兼容性好。应用例2：1.试验材料：番茄试验材料为巴顿，来源于山东金种子公司，在山东农业工程学院院内日光温室内种植，采用大小行栽培方式(大行80cm、小行60cm)，株距40cm。生防制剂材料为实施例2、对比例4-6制备的发酵液，市售的产品腐霉利(50％可湿性粉剂1000x，日本住友化学株式会社)、嘧菌胺(400g/l悬浮剂800x，拜耳作物科学公司)。2.试验方法：将番茄试验材料分为7个处理组，每个处理组的面积为60m2，每个处理设置3个重复。在番茄初花后7天，处理组1用实施例2制备的混合发酵液稀释100倍后叶面喷施；处理组2-4分别用对比例4-6制备的混合发酵液稀释100倍后叶面喷施；处理组5用腐霉利进行叶面喷施；处理组6用嘧菌胺进行叶面喷施；7天后各处理组再喷一次。处理组7不进行任何处理，作为空白对照。10天后调查各处理组番茄植株灰霉病的病情指数并计算诱抗(防治)效果和植株座果率。3.试验结果：试验结果见表2。表2：各处理番茄灰霉病病情指数和诱抗(防治)效果处理病情指数诱抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)处理组14.387.9972.8处理组214.260.3470.9处理组37.479.3371.2处理组410.869.8370.5处理组55.584.6468.3处理组65.385.2069.8处理组735.8-64.2由表2可以看出：在温室条件下，本发明实施例2制备的混合发酵液能够较好的诱导番茄植株对灰霉病的系统抗性；与处理组2相比，处理组1的番茄灰霉病的病情指数显著降低，诱抗效果显著提高，说明制备混合发酵所选用的菌株种类会显著影响番茄灰霉病的防治效果；并且混合发酵液也有益于番茄植株座果率的提高。与处理组3和处理组4相比，处理组1的防治效果仍有较显著的改善，说明拟康氏木霉和黑根霉进行混合发酵时接种的比例也会影响制备的混合发酵液对番茄灰霉病的防治效果。与市售的产品(处理组5和处理组6)相比，其对番茄灰霉病的诱抗效果相当，甚至更优，而本发明的混合发酵液生产方法简便、周期短，所用原料廉价，可提早、有效提高番茄植株的系统抗性，并且环境兼容性好。应用例3：1.试验材料：番茄试验材料为金种子，来源于山东金种子公司，番茄种植地点为山东省齐河县祝阿镇大杨村，种植方式为露地栽培，株行距为40cm×60cm。生防制剂材料为实施例3、对比例1-2制备的发酵液，市售的产品腐霉利(50％可湿性粉剂1000x，日本住友化学株式会社)、嘧菌胺(400g/l悬浮剂800x，拜耳作物科学公司)。2.试验方法：将番茄试验材料分为6个处理组，每个处理组的面积为667m2。在番茄初花后8天，处理组1用实施例3制备的混合发酵液稀释200倍后叶面喷施；处理组2-3分别用对比例1-2制备的单独发酵液稀释200倍后叶面喷施；处理组4用腐霉利进行叶面喷施；处理组5用嘧菌胺进行叶面喷施；处理组6不进行任何处理，作为空白对照；10天后各处理组再喷一次。15天后调查各处理组番茄植株灰霉病的病情指数并计算诱抗(防治)效果和植株座果率。3.试验结果：试验结果见表3。表3：各处理番茄灰霉病病情指数和诱抗(防治)效果处理病情指数诱抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)处理组14.679.1976.5处理组29.357.9269.7处理组310.652.0466.2处理组45.873.7672.3处理组54.280.9978.2处理组622.1-60.5由表3可以看出：在露地条件下，本发明实施例3制备的混合发酵液能够较好的诱导番茄植株对灰霉病的系统抗性；与处理组2、处理组3相比，处理组1的番茄灰霉病的病情指数明显降低，诱抗效果得到较大提升，说明拟康氏木霉和黑根霉联合使用具有协同增效作用，并且可提高番茄植株的座果率。与市售的产品(处理组4和处理组5)相比，其对番茄灰霉病的诱抗效果相当；但上述市售的化学农药产品如果施用不当或过度施用后，会造成番茄产品的农药残留超标，本发明的混合发酵液生产方法简便、周期短，所用原料廉价，可提早、有效提高番茄植株的系统抗性，并且环境兼容性好。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页1 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