去氢吴茱萸碱的制备方法及其抗农业病原菌的用途与流程

本发明提供了具有农药开发价值的去氢吴茱萸碱的制备方法及其在抗农业病原菌中的用途。其分离方法和结晶方法快捷、简单、实用，与以往的技术比较，方法新颖，具有明显的创新性。
背景技术：
：芸香科（Rutaceae）吴茱萸属（Evodia）全世界约有150种，分布于亚洲、非洲东部和大洋洲。我国有20种5变种，其中多数为民间常用中草药，主产于贵州、云南、广西、广东、湖北、湖南、江西、四川、安徽、浙江等地，早在《神农本草经》中就有吴茱萸的记载，应用历史悠久，临床效果显著，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻、疏肝解郁、行气止痛之功效，颇受人们的关注。吴茱萸属的主要化学成分：生物碱类、苦味素类、黄酮类、苯并吡喃酮类、降倍半萜类、挥发油等，果实中主要活性成分为吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱。该类化合物主要药理活性有扩张血管、降压、强心、止泻、收缩子宫、杀虫、抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗胆碱酯酶、抗遗忘症和抗肿瘤作用。技术实现要素：本发明提供了去氢吴茱萸碱的提取、分离、纯化的方法是，取吴茱萸属（Evodia）植物吴茱萸（E.rutaecarpa(Juss.)Benth）、石虎（E.rutaecarpavar.officinalis(Dode)Huang）、疏毛吴茱萸（E.rutaecarpavar.bodinieri(Dode)Huang）、华南吴萸（E.austrosinensis）、臭辣吴萸（E.fargesii）及臭檀吴萸（E.daniellii）的鲜（或干）果实，或者其粉碎品，用水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂或其二种、多种混合溶剂提取，提取液70℃以下真空浓缩至干（或无有机溶剂），加水至合适的体积，去除沉淀（如有沉淀），上常规处理好的吸附柱，用水洗去杂质，至近无色，再用5-50%的乙醇（或甲醇）洗脱，并收集此部分洗脱液，70℃以下真空浓缩至干（或无有机溶剂），加水至合适的体积，用适量活性炭脱色，脱色后的溶液70℃以下真空浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加适量20%的乙醇（或20%甲醇、20%丙酮），洗去色素，固体用无水溶剂如甲醇、乙醇、丙酮或者是混合液，或者是它们与氯仿（或乙酸乙酯）的混合液溶解，后加入适量氯仿（或乙酸乙酯），放置使其结晶和重结晶。1、上述从原药材提取含有去氢吴茱萸碱的浸膏所用的溶剂可以是水、乙醇、甲醇、丙酮，即可以单独使用，也可以二种或二种以上的溶剂合并使用。2、上述从原药材提取含有去氢吴茱萸碱的浸膏可以用回流提取，也可以用渗漉提取或者用索氏提取器提取。3、上述填充吸附柱所用的填料可以是非极性或弱极性的树脂，例如：苯乙烯型（包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型）或者丙烯腈型共聚体树脂，也可以是阳离子交换树脂，硅胶，凝胶，ODS等填料。本发明提供了所述去氢吴茱萸碱对农业病原真菌、细菌的抑制活性，所述化合物对农业病原细菌具有强烈的抑制活性。去氢吴茱萸碱的结构鉴定去氢吴茱萸碱的化学结构式1或2黄色颗粒状结晶，m.p.215-217℃（氯仿-甲醇），热溶于氯仿、甲醇的混合溶剂，不溶于丙酮。改良碘化铋钾试剂显棕红色，提示该化合物可能是生物碱。红外光谱显示有NH（3413cm-1）、羰基（1706cm-1）、苯环（1610，1498cm-1），双键（1544cm-1）。ESI-MS显示该化合物的准分子离子峰为302[M+H-Cl]+（100），表明其分子量为301。结合氢谱、碳谱可确定该化合物的分子式为[C19H16N3O]+，不饱和度为14。氢谱显示δH12.80(1H,s)是NH的质子信号，δH7.27-8.34(8H,m)是由8个芳氢质子组成的两个自旋体系的两组氢质子，δH3.34(2H,t,J=7.2,6.9Hz)和δH4.47(2H,t,J=7.2,6.9Hz)是2个有偶合关系的亚甲基氢信号，δH4.41(3H,s)是N-CH3的氢信号。碳谱显示19个碳信号，其中1个羰基δC158.3，δC113.7-150.1有15个芳碳信号，2个亚甲基δC42.2和δC18.6及1个氮甲基碳信号δC41.1。理化常数和波谱数据与文献报道的dehydroevodiamine一致，因此确定该化合物为去氢吴茱萸碱。表1去氢吴茱萸碱的NMR数据全归属No.C1H-NMRδ/ppm;J/Hz13C-NMRδ/ppmNH12.80(1H,s)2130.33150.154.47(2H,m)42.263.34(2H,m)18.67120.28123.497.88(1H,d,J=8.1)121.6106.90(1H,J=7.2,8.1)121.7117.25(1H,J=7.2,8.4)128.8126.82(1H,d,J=8.4)113.713141.615139.8168.19(1H,d,J=8.1)118.6178.13(1H,dd,J=8.1,6.9)136.7187.80(1H,J=6.3,6.9)128.7198.34(1H,d,J=6.3)127.820118.821158.322-CH34.41(3H,s,N-CH3)41.1附图说明：以下图可作为附件材料上报。图1、去氢吴茱萸碱1的IR谱图2、去氢吴茱萸碱1的1HNMR谱图3、去氢吴茱萸碱1的13CNMR谱图4、去氢吴茱萸碱1的ESI-MS谱图5、去氢吴茱萸碱2的1HNMR谱图6、去氢吴茱萸碱2的13CNMR谱图7、去氢吴茱萸碱2的ESI-MS谱具体实施方式：结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。实施例1.取吴茱萸的鲜果实2Kg，加70%乙醇3500mL室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加70%乙醇3000mL，室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加70%乙醇3000mL，室温浸泡7d，滤取提取液，合并所有滤取的提取液，提取液在50℃减压浓缩至200mL，并除去残留的乙醇，加等量的水，滤去沉淀，上已处理好的D101型大孔树脂柱（3KgD101型大孔树脂置于Φ=10cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，再用5%的乙醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，50℃减压浓缩至100mL，加水至500mL，用粉末活性炭5g，加热煮沸10'，趁热过滤得黄色溶液，50℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加30mL20%的甲醇滤除色素，固体用30mL甲醇溶解，加入90mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=3:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱1.7g。实施例2.取吴茱萸的干果实500g，放入5L的圆底烧瓶中，加70%甲醇4000mL，将圆底烧瓶放入水浴锅中，加热回流1h，滤取提取液，药渣加70%甲醇3000mL，加热回流1h，滤取提取液，药渣加70%甲醇3000mL，加热回流1h，滤取提取液，合并所有滤取的提取液，提取液在45℃减压浓缩至200mL，并除去残留的甲醇，加等量的水，滤去沉淀，上已处理好的AB型大孔树脂柱（2KgAB型大孔树脂置于Φ=10cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，再用10%的乙醇洗脱至近无色，接着用30%的乙醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，45℃减压浓缩至100mL，加水至500mL，用粉末活性炭5g，加热煮沸10'，趁热过滤得黄色溶液，45℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加30mL20%的甲醇滤除色素，固体用30mL甲醇溶解，加入90mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=2:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱1.1g。实施例3.取石虎的鲜果实2Kg，加80%甲醇3500mL室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加80%甲醇3000mL，室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加80%甲醇3000mL，室温浸泡7d，滤取提取液，合并所有滤取的提取液，提取液在60℃减压浓缩至200mL，并除去残留的甲醇，加等量的水，滤去沉淀，上已处理好的阳离子交换树脂柱（2Kg阳离子树脂置于Φ=10cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，再用20%的甲醇洗脱至近无色，接着用甲醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，60℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加15mL20%的甲醇滤除色素，固体用20mL甲醇溶解，加入60mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=1:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱0.9g。实施例4.取石虎的干果实500g，放入5L的圆底烧瓶中，加50%乙醇4000mL，将圆底烧瓶放入水浴锅中，加热回流1h，滤取提取液，药渣加50%乙醇3000mL，加热回流1h，滤取提取液，药渣加50%乙醇3000mL，加热回流1h，滤取提取液，合并所有滤取的提取液，提取液在50℃减压浓缩至200mL，并除去残留的乙醇，加等量的水，滤去沉淀，上已处理好的AB型大孔树脂柱（2KgAB型大孔树脂置于Φ=10cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，用50%的乙醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，50℃减压浓缩至100mL，加水至500mL，用粉末活性炭5g，加热煮沸10'，趁热过滤得黄色溶液，50℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加30mL20%的甲醇滤除色素，固体用20mL甲醇溶解，加入70mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=2:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱1.0g。实施例5.取疏毛吴茱萸的鲜果实500g，用水渗漉提取，得渗漉液5000mL，减压浓缩至800mL，上已处理好的D101型大孔树脂柱（3KgD101型大孔树脂置于Φ=12cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，接着用30%的乙醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，40℃减压浓缩至100mL，加水至500mL，用粉末活性炭5g，加热煮沸10'，趁热过滤得黄色溶液，40℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加12mL20%的甲醇滤除色素，固体用10mL甲醇溶解，加入30mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=3:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱0.7g。实施例6.取华南吴萸干果实4Kg，用80%乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，55℃减压浓缩得稠浸膏约800g，加水溶解至混悬液，依次用石油醚（60-90℃）、氯仿、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别浓缩成浸膏得石油醚部位14g、氯仿部位209g、乙酸乙酯部位26g、正丁醇部位210g、水部位316g。正丁醇部位反复通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析及重结晶等手段，得去氢吴茱萸碱1.5g。实施例7.取臭辣吴萸干果实0.5Kg，经石油醚冷浸7天，得石油醚浸膏27g；脱脂后的药渣，用60%乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压浓缩得稠浸膏约1.1Kg；加2%的酸水捏溶至混悬液，酸水用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯浸膏163g；萃取后的酸水加氨水碱化至PH9-10，用氯仿萃取，得总生物碱较集中的氯仿浸膏66g；最后碱水调至中性用正丁醇萃取，得正丁醇浸膏193g。正丁醇部位反复通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析及重结晶等手段，得去氢吴茱萸碱0.75g。实施例8.取臭檀吴萸的鲜果实1Kg，加80%甲醇1750mL室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加80%甲醇1500mL，室温浸泡7d，滤取提取液，药渣加80%甲醇1500mL，室温浸泡7d，滤取提取液，合并所有滤取的提取液，提取液在50℃减压浓缩至100mL，并除去残留的甲醇，加等量的水，滤去沉淀，上已处理好的阳离子交换树脂柱（1Kg阳离子树脂置于Φ=10cm的玻璃柱内），用水常规洗去杂质，至近无色，再用20%的甲醇洗脱至近无色，接着用甲醇洗脱至近无色，并收集此部分洗脱液，50℃减压浓缩至干，即得去氢吴茱萸碱粗品，去氢吴茱萸碱粗品加7.5mL20%的甲醇滤除色素，固体用10mL甲醇溶解，加入30mL氯仿，放置使其结晶，用氯仿-甲醇（V/V=3:1）重结晶后既得去氢吴茱萸碱0.3g。实施例9.按实施例1-8制备所得去氢吴茱萸碱的抗菌谱测定：测定对象包括油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、水稻恶苗病菌、稻瘟病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑橘溃疡病菌和十字花科蔬菜黑腐病菌等12种常见农业病原菌。所有供试病原菌均为田间采集分离菌株。将去氢吴茱萸碱溶于DMSO，配制成浓度为5000μg/mL的母液。将适量去氢吴茱萸碱母液或等体积DMSO加入加热融化并冷却至55℃的PSA培养基中，混匀后倒入直径为9cm的培养皿中制成终浓度为10μg/mL的含药平板。用直径5mm的打孔器在预培养的真菌菌落边缘打取菌碟，并接种至含药平板中间，每个处理3个重复。25℃倒置培养至对照接近长满板，十字交叉法测定菌落直径并计算抑制率。抑制率（%）=（对照菌落直径﹣加药处理菌落直径）/对照菌落直径×100。菌落直径=十字交叉法测定直径平均值-5mm。将去氢吴茱萸碱母液或等体积DMSO加入NB培养液中制成终浓度为10μg/mL的含药培养液，用分光光度计将预培养至对数生长期的细菌培养物OD600值调至0.02，并按1:200的比例加入含药培养液中，每个处理3个重复。28℃175rpm摇培使对照长至对数生长期，用分光光度计测定OD600并计算抑制率。抑制率（%）=（对照OD600值﹣加药处理OD600值）/对照OD600值×100。试验结果按实施例1-8制备所得的去氢吴茱萸碱抗菌谱如表1所示。从表中结果可以看出，去氢吴茱萸碱对农业病原真菌活性较弱，而对农业病原细菌具有较强的抑制活性。表1按实施例1-8制备的去氢吴茱萸碱对农业病原菌的抑制率病原菌10μg/mL抑制率（%）油菜菌核病菌13.78小麦赤霉病菌6.19黄瓜灰霉病菌6.76葡萄炭疽病菌2.29水稻纹枯病菌5.28玉米小斑病菌23.15水稻恶苗病菌3.95稻瘟病菌病菌6.73水稻白叶枯病菌98.84水稻细菌性条斑病菌92.43柑橘溃疡病菌82.57十字花科蔬菜黑腐病菌43.89实施例10.按实施例1-8制备所得去氢吴茱萸碱对农业病原细菌的毒力回归方程测定：测定对象包括水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑橘溃疡病菌和十字花科蔬菜黑腐病菌等4种常见农业病原细菌。所有供试病原菌均为田间采集分离菌株。将去氢吴茱萸碱溶于DMSO，配制成浓度为5000μg/mL的母液，并用DMSO倍比稀释成7个系列浓度梯度待用。将各浓度去氢吴茱萸碱或等体积DMSO加入NB培养液中制成含药培养液，用分光光度计将预培养至对数生长期的细菌培养物OD600调至0.02，将菌液加入含药培养液中，每个处理3个重复。28℃175rpm摇培至对照对数生长期，用分光光度计测定OD600并计算抑制率。抑制率（%）=（对照OD600值﹣加药处理OD600值）/对照OD600值×100。根据各浓度抑制率使用DPSv7.05计算毒力回归方程。试验结果按实施例1-8制备所得的去氢吴茱萸碱对农业病原细菌的毒力回归方程如表2所示。从表中结果可以看出，去氢吴茱萸碱对农业病原细菌抑制效果强烈。表2按实施例1-8制备的去氢吴茱萸碱对农业病原细菌的毒力回归方程病原菌毒力回归方程EC50EC90R值水稻白叶枯病菌y=4.9976+4.6601x1.00121.88590.9852水稻细菌性条斑病菌y=3.0445+2.9642x4.567812.36070.9913柑橘溃疡病菌y=2.6240+2.9593x6.351617.21620.9956十字花科蔬菜黑腐病菌y=0.7503+4.1715x10.441421.18240.9858当前第1页1 2 3