约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其应用的制作方法

本发明提供一种约安巨马陆(prospirobolusjoannsi)抗血栓肽joannsin及其编码基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

蛋白酶广泛存在于从病毒、细菌到哺乳动物的所有生物中，并在许多生理反应中起着重要的作用，例如食物消化、凝血、组织重建、免疫防御等，在这些生理过程中，蛋白酶调节着一系列胞内和胞外的蛋白水解级联反应。蛋白酶一旦被激活，将导致一系列迅速而不可逆的特异细胞反应。尽管蛋白酶是机体生理反应所必须的，但过量的蛋白酶对机体蛋白质内环境却是一种潜在的危险，所以蛋白酶抑制剂对生物的稳态是不可缺少的，同时在许多有毒动物中，蛋白酶抑制剂作为其捕食或者抵御捕食者中发挥着重要的作用。

目前，在自然界中共发现了四种蛋白酶抑制剂：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血因子x等的丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，抑制胶原酶、氨肽酶和嗜热菌蛋白酶等的金属蛋白酶抑制剂，及抑制组织蛋白酶d、逆转录蛋白酶和胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类最多。根据序列同源性、半胱氨酸数目和分子中二硫键与作用位点之间的拓扑学关系，丝氨酸蛋白酶抑制剂又分为serpin、til(trypsininhibitorlikecysteinerichdomain)、kazal、kunitz和bowman-birk等几个家族。

凝血系统包括内源途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径：是指从因子ⅻ激活，到因子x激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子ⅻ即与之结合，在hk和pk的参与下被活化为ⅻa。在不依赖钙离子的条件下，因子ⅻa将因子ⅺ激活。在钙离子的存在下，活化的ⅺa又激活了因子ⅸ。单独的ⅸa激活因子x的效力相当低，它要与ⅷa结合形成1：1的复合物，又称为因子x酶复合物。这一反应还必须有ca²⁺和pl共同参与；外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子ⅹ被激活的过程。内源性凝血途径和外源性凝血途径都是通过ⅹa、凝血酶共同的凝血途径完成最后的凝血过程；凝血途径由各种凝血因子组成，许多凝血因子都是丝氨酸蛋白酶，所以丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗凝血过程中可能会发挥一定的功能。

由于外源性凝血系统和内源性凝血系统都汇合于ⅹa、凝血酶共同的凝血途径，所以抗凝血抗血栓药物选择抑制ⅹa、凝血酶看似是个绝佳的选择，但是临床结果表明，抑制ⅹa、凝血酶这些共同的凝血途径，长时间用药可能会导致凝血功能障碍，引起出血，所以通过靶向其他的凝血因子或许是个更好的选择。

最近的研究表明通过靶向fxii抑制凝血过程，不会对血液系统的稳态产生影响，infestin-4是到现在为止发现的最强的fxii抑制剂，研究表明其作为抗凝药不会引起出血等；同时fxii的抗体也会产生抗血栓效应而不会产生出血的风险。

蛋白酶抑制剂也广泛存在于动物、植物、真菌、细菌和病毒等生物体内，通过发掘生物质资源，并从生物中分离纯化出针对于内源性凝血途径和外源性凝血途径中的凝血因子的蛋白酶抑制剂，在抗血栓药物的研发中起着重要的作用。

马陆(millipede)也叫千足虫、千脚虫、秤杆虫。马陆属于无脊椎动物，多足纲，倍足亚纲，体节组成。长约20～35厘米，暗褐色，背面两侧和步肢赤黄色。目前已经命名的有12000多种，估计全世界其有80000多种。从马陆的基因组中可以发现有许多蛋白酶抑制剂，但是马陆中的蛋白类或者多肽类活性分子目前还未见研究，所以通过转录组蛋白质组学分析或许可以发现马陆中个体防御功能的蛋白分子，使其遇见捕食者时不仅仅通过气味还能够通过这些多肽毒素来发挥抵御作用。我们首次从约安巨马陆中识别了一个作用很强的fxa和trypsin抑制剂joannsin。

本发明涉及的多肽joannsin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓活性。将本发明的约安巨马陆抗血栓肽joannsin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。将本发明的约安巨马陆抗血栓肽joannsin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提出一种约安巨马陆抗血栓肽joannsin及其编码基因和应用。

约安巨马陆抗血栓肽joannsin是约安巨马陆抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量8910.9道尔顿，约安巨马陆抗血栓肽joannsin的氨基酸序列(eqidno：1)为：qawqnyyrpsragysycyddydigpcrarfrqwyynrrtgeceiffyggclgndnkyeskeeceyickkllt。

约安巨马陆抗血栓肽基因的克隆包括：

约安巨马陆防御腺总rna提取，mrna纯化，mrna反转录及cdna文库构建，设计引物，利用pcr方法筛选约安巨马陆抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’cgtactgccgtggaacttc3’，pcr另一扩增引物为3’pcrprimer引物，其序列为5’ccgaggtttggtggctcatt3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码约安巨马陆抗血栓肽的由659个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列seqidno：2)为：

tcagtcacaggacttaatatctgtcgaaccttaagacgtactgccgtggaacttccaaaatttcttcatctttgcatgtacagtagctcatataaatttttctgattttgagaccgatttaggaagggagaaaataaatcaagtccagtttgtgaattcttaaaaacaaagatggacaataggtttgtggcactgcttaccgtcttagtcatcatgcacacactgacattcagcagaggtcaagcatggcagaattactataggcctagccgtgccggttattcatactgctacgatgactacgacattgggccctgcagagcccgttttcgtcagtggtattataatagacgtaccggtgaatgtgaaatctttttctacgggggatgtttgggaaacgacaataaatatgagtcaaaagaagaatgcgaatatatctgtaagaaattgctcacgtagcaagagtgttcactaattatgactgttgacgaacacgtgttaatttgttcaagcagtaaacggatcatgacagcacaatgaaatataaaattgttggaactgttactcatgattggattttgataagtgttgccttttcacggtgtttcataaaccatgttttaacagacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

这条核苷酸序列转录的多肽的氨基酸序列为：

mdnrfvalltvlvimhtltfsrgqawqnyyrpsragysycyddydigpcrarfrqwyynrrtgeceiffyggclgndnkyeskeeceyickkllt

其中24-95的片段为约安巨马陆抗血栓肽成熟肽。约安巨马陆抗血栓肽基因作为基因工程制备约安巨马陆抗血栓肽的应用。

约安巨马陆抗血栓肽的原核表达及纯化：

基因合成joannsin成熟肽的核苷酸序列并将其连接到pet-32a表达载体转入bl21菌株，用iptg诱导表达，后经镍亲和层析色谱，凝胶过滤层析，高压液相色谱等进行纯化，最后经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)测定其分子量及纯度。

本发明的有益效果在于：从约安巨马陆防御腺内分离到的joannsin序列经原核表达获得的joannsin重组多肽能够抑制trypsin，fxa的活性，并且在体内表现极显著的抗血栓功能；另外该多肽经原核表达获得，容易大规模工业化生产并且抗血栓活性强，能够作为抑制fxa的试剂和制备抗血栓药物。

附图说明

图1为约安巨马陆抗血栓肽joannsin对各种凝血因子的作用效果图；

图2为约安巨马陆抗血栓肽joannsin的体内抗血栓作用效果图：a：joannsin作用12小时后鼠尾血栓长度统计；b：joannsin作用24小试后鼠尾血栓长度统计；c：24小时后处死小鼠，各个组间鼠尾血栓测量对比。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的内容并不局限于此。

约安巨马陆抗血栓肽基因克隆：

1.约安巨马陆防御腺总rna提取：

(1)在无菌环境下纵向解剖约安巨马陆，在约安巨马陆的每一节体节两侧均有防御腺，用镊子取出防御腺，迅速放至盛有液氮的研钵中，不断加入液氮充分研磨。待研成粉末状后，加入1mltrizol提取缓冲液(invitrogen)，与液氮共研磨。待trizol溶化，将研钵中全部液体吸出至1.5ml离心管中，室温放置5min。

(2)加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5min；4℃，12000g离心10min；吸取上层无色水相至新的1.5ml离心管中(尽量多吸上层液体，但一定要避免吸到中下层，中层白色为蛋白沉淀，粉红色下层为酚-氯仿)。

(3)加入500μl4℃预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min，管底微量沉淀为rna，用移液枪轻微吸去上清弃掉。

(4)沉淀加入1ml75％冰上预冷乙醇洗涤，4℃，7500g离心5min，弃上清，重复两次；超净台中放置5-10min，晾干至无乙醇味，即为约安巨马陆防御腺总rna；向晾干的ep管中加入30μl0.1％depc水，轻微震荡溶解rna。从中吸取1μl加49μldepc水，于230nm、260nm、280nm波长处检其吸光值。取10μl用于1％琼脂糖胶电泳。其余总rna于-80℃冻存。

2.约安巨马陆防御腺cdna双链的合成：

按照creatortmsmart^tmcdnalibraryconstructionkit(clontech)说明书操作构建约安巨马陆防御腺cdna文库。具体操作如下：

(1)cdna第一链合成(mrna反转录)

(2)在无rnasepcr管中加入2μl约安巨马陆防御腺总rna、1μlsmart^tmⅳoligonucleotide、1μlcdsiii/3’primer，加1μldepc水使总体积达到5μl，混匀并离心10s；72℃保温2min，冰上孵育2min；在上面pcr管中继续加入2μl5×第一链buffer、1μl20mmdtt、1μl10mmdntp混合物、1μlpowerscript逆转录酶，混匀并离心10s。pcr仪中42℃保温1h，冰上终止反应。

(3)采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增cdna第二链

将1μlcdna第一链(mrna反转录)，40μl去离子水，5μl10×buffer缓冲液，1μl50×dntp混合物，1μl5’pcrprimer，1μlcdsiii/3’pcr引物以及1μl聚合酶于pcr管中混匀。按以下程序进行pcr扩增：

①95℃1min

②20个循环：

95℃15sec

65℃30sec

68℃6min

扩增结束后，合成好的cdna双链用pcr管分装成10μl每管，取出5μl进行1％琼脂糖电泳，其余立刻置于-80℃保存。

3.大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备：

(1)挑取单个dh5α菌落，接种于1ml不含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1：100再接种于1mllb培养液中，37℃振荡2h。(2)当od600达到0.35时，将菌液在冰上放置10min使培养物冷却至0℃。

(3)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(4)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

(5)每1ml初始培养液加入600μl预冷的0.1mcacl2-mgcl2溶液(80mmmgcl2,20mmcacl2)重悬每份细胞沉淀。

(6)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(7)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量液体流尽。

(8)每1ml初始培养物加入60μl用冰预冷的0.1mcacl2重悬细胞沉淀。4℃冰箱放置10-18h。

4.cdna文库的筛选：

(1)特异性引物的合成

使用primerblast设计两条引物。

(2)从马陆防御腺cdna中克隆目标序列

20μl体系：tag酶0.1μl，cdsiii、smart4各0.4μl，dntp0.4μl，buffer2μl，mg²⁺1.2μl，pcr水16μl

pcr条件：1预变性：95℃，5min

(3)序列的连接、转化与检测。在微量离心管中加入0.2μltakarapmd19-t载体，2.3μldna双链；加入2.5μl等量的连接酶缓冲液混合物(冰上溶解)；16℃反应过夜；全部5μl连接产物加至60μldh5α感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，轻放于冰上孵育3-5min，加入温浴过的lb培养基，37℃，80rpm摇菌45min；取100μl涂布与含有100ug/mlamp的lb培养基中，37℃培养16h；菌落长出后，挑单克隆进行10μl菌液pcr。

5.挑取单克隆测序及序列筛选：

挑取20个与目标序列核酸大小相近的单菌落送测序公司进行dna测序。采用abi3730测序仪测序。测序引物为m13(+)：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’,m13(-)：5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’。测序结果进行序列筛选。

6.约安巨马陆抗血栓肽joannsin基因序列测定

提取质粒dna用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国appliedbiosystems373a全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为bcabest^tmsequencingprimerrv-m和bcabest^tmsequencingprimerm13-47，bcabest^tmsequencingprimerrv-m序列：5`gagcggataacaatttcacacagg3’，bcabest^tmsequencingprimerm13-47：5’cgccagggttttcccagtcacgac3’。基因测序结果自5’端至3’端序列(核苷酸序列seqidno：2)为：

tcagtcacaggacttaatatctgtcgaaccttaagacgtactgccgtggaacttccaaaatttcttcatctttgcatgtacagtagctcatataaatttttctgattttgagaccgatttaggaagggagaaaataaatcaagtccagtttgtgaattcttaaaaacaaagatggacaataggtttgtggcactgcttaccgtcttagtcatcatgcacacactgacattcagcagaggtcaagcatggcagaattactataggcctagccgtgccggttattcatactgctacgatgactacgacattgggccctgcagagcccgttttcgtcagtggtattataatagacgtaccggtgaatgtgaaatctttttctacgggggatgtttgggaaacgacaataaatatgagtcaaaagaagaatgcgaatatatctgtaagaaattgctcacgtagcaagagtgttcactaattatgactgttgacgaacacgtgttaatttgttcaagcagtaaacggatcatgacagcacaatgaaatataaaattgttggaactgttactcatgattggattttgataagtgttgccttttcacggtgtttcataaaccatgttttaacagacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

约安巨马陆抗血栓肽joannsin基因核苷酸的序列表为：序列长度为659个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cdna，来源：约安巨马陆防御腺。

编码约安巨马陆成熟抗血栓肽joannsin的为核苷酸序列seqidno：2的第241-456位核苷酸。约安巨马陆抗血栓肽joannsin的氨基酸序列(seqidno：1)为：qawqnyyrpsragysycyddydigpcrarfrqwyynrrtgeceiffyggclgndnkyeskeeceyickkllt。

约安巨马陆抗血栓肽joannsin基因作为基因工程制备约安巨马陆抗血栓肽的应用。

约安巨马陆抗血栓肽joannsin，在制备fxa抑制剂和抗血栓药物中的应用。

约安巨马陆抗血栓肽joannsin的原核表达及纯化

1.原核表达载体的构建

2.约安巨马陆抗血栓肽joannsin的原核表达

(1)菌体收集

将得到的载体菌液划平板得到单克隆后，挑取单克隆测序，验证载体序列正确性，并将单克隆菌体在一定的甘油浓度下冻存。首先进行小量诱导表达，在不同iptg浓度、温度及时间条件下，摸索最合适的诱导条件。预实验结束后，使用最优条件进行大量诱导表达。表达结束，离心，弃掉上清，收集菌体，并用bindingbuffer将菌体重悬。

(2)重组蛋白的可溶性分析

将菌体重悬液进行超声(冰上)以破碎细胞，再次离心后分别取全细胞、上清和沉淀跑sds-page胶以验证其可溶性。

3.重组约安巨马陆抗血栓肽joannsin的纯化

(1)重组蛋白的亲和层析及甲酸切割

将破碎后的菌体上清用0.45μm滤膜过滤后，上样于用bindingbuffer平衡好的hisbindresin亲和柱，并跑sds-page胶验证不同缓冲液洗脱下的样品。

甲酸切割：将洗脱下的融合蛋白加入50％(v/v)的甲酸切割以切除融合蛋白标签。切割后的样品吹干以去除甲酸，并用sds-page胶验证。

(2)sephadexg-50葡聚糖凝胶纯化

将甲酸切割产物取2ml上样于pbs(0.1mol/l，ph6.0)缓冲液平衡过的sephadexg-50(amershambioscience)凝胶柱(26mm×100cm)。用同样浓度的平衡缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，3ml/管，使用cbs-a程控全自动部分收集器收集(上海青浦沪西仪器厂)。使用μltrospec2100pro分光光度计(amershambiosciences)测定280nm和215nm值。收集各峰组分存于-20℃备用，并用sds-page验证。

(3)rp-hplc纯化

g50葡聚糖凝胶收集到的目的峰使用反相高压色谱(waters1525binaryhplcpump)c4柱(lichrospher10×250mm)继续分离；溶剂a：0.1％tfa的超纯水溶液，溶剂b：0.1％tfa的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-10min，b：0％；10-70min，b：0-60％；60-70min，b：70-100％，流速为1.5ml/min。峰收集使用waters2489可见/紫外检测器检测(215nm/280nm)，每一个峰为一个收集单位。

(4)maldi-tof质谱鉴定

将收集的高压峰进行质谱鉴定。

4.约安巨马陆抗血栓肽joannsin的药理实验

(1)酶动力学：在96孔板中10μl样品与10μl终浓度为0.1nm的fxiia混合于40μl缓冲液(0.05mtris–hcl,ph7.8)中。室温放置5分钟后，加入30μl缓冲液与10μl终浓度为0.05mm发色底物的混合液，终体积为100μl。凝血反应的动力学使用epoch(biotek)酶标仪、genchs1.09软件检测od405，20min，间隔30s。样品浓度为0.3μm。joannsin对fxiia、kallikrein等无抑制作用。可以抑制fxa和trypsin。经计算joannsin对fxa和trypsin的抑制常数分别为29.5±4.7nm,、182.7±14.6nm。

(2)aptt和pt实验：

aptt：将aptt试剂平衡至室温，轻轻倒置混匀aptt试剂。50μlaptt试剂、40μl去血小板血浆(ppp)和10μl样品混匀后，在37℃的水浴锅中孵育3分钟，加入50μl预热的0.025mcacl2溶液，立即混匀，用酶标仪记检测od650。

pt：37℃预热凝血酶原试剂(pt)15分钟。40μl去血小板血浆(ppp)与10μl样品在37℃水浴锅中孵育3分钟，加入预热的凝血酶原试剂50μl，立即混匀，用酶标仪记录od650。

joannsin对aptt及pt均有作用，表明joannsin可以抑制外源及内源性凝血途径，与是fxa抑制剂的结果一致。

(3)卡拉胶致鼠尾血栓模型：实验动物用昆明小鼠，雄性，体重20-25g(昆明医学院实验动物中心提供)，饲养一周后，随机分组(n＝8)。分别为生理盐水对照组，样品组：2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg，阳性对照组：0.2mg/kgapixaban(medchemexpress)。尾静脉给药处理30min后，以60mg/kg的剂量从小鼠腹腔注射卡拉胶(carrageenan，typei，sigma，用生理盐水溶解成1％的浓度)，由于在低温环境下，血栓形成率>90％，所以饲养温度为17.5℃。12、24h后根据尾部皮肤颜色变化测定血栓形成的平均长度。随着时间的增加，各组血栓的平均长度都增加了，样品组长度略微增加。在每个测量时间点，相对于对照组，2mg/kg的joannsin和0.2mg/kgapixaban对鼠尾血栓形成的影响都有意义；而相对于0.2mg/kgapixaban组，4mg/kg的joannsin可以达到近似同等的水平，6mg/kg的joannsin则可以形成更好的抑制效果，如图2所示。数据处理为graphpadprime5，数据平均值±sd，t-test(*p<0.05)。

序列表

<110>南京农业大学

<120>约安巨马陆抗血栓肽joannsin及其应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>72

<212>prt

<213>约安巨马陆抗血栓肽joannsin

<400>1

glnalatrpglnasntyrtyrargproserargalaglytyrsertyr

cystyraspasptyraspileglyprocysargalaargphearggln

trptyrtyrasnargargthrglyglucysgluilephephetyrgly

glycysleuglyasnaspasnlystyrgluserlysgluglucysglu

tyrilecyslyslysleuleuthr72

<210>2

<211>659

<212>dna

<213>约安巨马陆抗血栓肽joannsin基因

<400>2

tcagtcacaggacttaatatctgtcgaaccttaagacgtactgccgtggaacttccaaaatttcttcatctttgcatgtacagtagctcatataaatttttctgattttgagaccgatttaggaagggagaaaataaatcaagtccagtttgtgaattcttaaaaacaaagatggacaataggtttgtggcactgcttaccgtcttagtcatcatgcacacactgacattcagcagaggtcaagcatggcagaattactataggcctagccgtgccggttattcatactgctacgatgactacgacattgggccctgcagagcccgttttcgtcagtggtattataatagacgtaccggtgaatgtgaaatctttttctacgggggatgtttgggaaacgacaataaatatgagtcaaaagaagaatgcgaatatatctgtaagaaattgctcacgtagcaagagtgttcactaattatgactgttgacgaacacgtgttaatttgttcaagcagtaaacggatcatgacagcacaatgaaatataaaattgttggaactgttactcatgattggattttgataagtgttgccttttcacggtgtttcataaaccatgttttaacagacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa659