本发明属于多肽领域，涉及多肽在细胞免疫治疗的应用，具体涉及增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的人工多肽及其生物制品。
背景技术：
：原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年大约有63万的新发病例，而且近年来发病率有上升趋势。肝癌患者的病程短，临床上较难早期发现，确诊时往往病情已进入中、晚期，病死率高。目前肝癌的治疗主要是以手术切除、肝移植、局部消融、化学治疗栓塞及其他局部区域治疗、分子靶向治疗等，但这些方法的治疗效果并不理想，因为肝癌患者体内天然免疫、特异性免疫功能低下，根治性手术切除率低，手术后复发率高，放射、化学治疗疗效差，易发生肝内播散及肝外转移，因此急需寻找新的有效方法来治疗肝癌。生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式，越来越受到重视。目前用于肿瘤生物治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、树突状细胞(dc)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)等。cik细胞是一种新型的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为cd3+cd56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。研究表明，过继细胞免疫治疗对抑制肝癌的复发和转移、提高患者治愈率、改善患者生活质量、延长生存期都具有重要作用。如何用较少的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果是科研工作者的一个重要研究方向。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的人工多肽及其生物制品，以使用较少的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。实现本发明上述目的技术方案如下：一种包含式(ⅲ)氨基酸序列的多肽：etlgqpdak(xa)pcfqedpma(xb)gtdcmelgiwn；(ⅲ)其中，xa和xb选自m,y,l,v,w或e。优选地，xa和xb选自m或w。优选地，所述多肽的氨基酸序列如下：etlgqpdakmpcfqedpmamgtdcmelgiwn(seqidno.1)；etlgqpdakwpcfqedpmawgtdcmelgiwn(seqidno.2)；etlgqpdakmpcfqedpmawgtdcmelgiwn(seqidno.3)；etlgqpdakwpcfqedpmamgtdcmelgiwn(seqidno.4)。优选地，多肽n和/或c末端被化学修饰。优选地，所述多肽的n末端被乙酰化修饰，c末端被酰胺化修饰。优选地，所述多肽为游离形式或药学上可以接受的成盐形式，包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐。上述多肽在增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性方面的应用。一种生物制品，含有上述多肽和药学上可以接受的辅料。上述生物制品在增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性方面的应用。本发明的突出优点：本发明提供的人工多肽可以有效增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的生物制品，以实现使用少量的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。附图说明图1为各组cik细胞对hepg2的杀伤率比较。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料本发明涉及的多肽通过本领域公知的标准多肽固相合成技术合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保护策略。按照树脂固相合成的方法依次连接相应氨基酸，期间依次脱去fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品经c18柱分离纯化，即可制得式(ⅲ)所示的多肽。hplc和ms检测确证了本发明多肽的结构，且纯度均≥98％。多肽ⅲ-1至多肽ⅲ-4的氨基酸序列如下(n末端→c末端)，末端未经化学修饰：etlgqpdakmpcfqedpmamgtdcmelgiwn(多肽ⅲ-1，seqidno.1)；etlgqpdakwpcfqedpmawgtdcmelgiwn(多肽ⅲ-2，seqidno.2)；etlgqpdakmpcfqedpmawgtdcmelgiwn(多肽ⅲ-3，seqidno.3)；etlgqpdakwpcfqedpmamgtdcmelgiwn(多肽ⅲ-4，seqidno.4)。人肝癌细胞系hepg2为本公司长期保存。重组人干扰素rhifn-γ、重组人白细胞介素rhil-2、cd3鼠抗人单克隆抗体、cik细胞分离液、pbs、无血清培养基md-cm-stmn、rpmi1640培养基、胎牛血清fbs、mtt、dmso、胰酶均购自南京建成生物。二、实验方法1、外周血单个核细胞制备无菌抽取健康人外周血约50ml，肝素抗凝(肝素15iu/ml)，用等体积pbs稀释外周血。按1：1的体积比缓慢加入到含有细胞分离液的50ml离心管中，2000r/min离心20min。取中间环状乳白色单个核细胞层，移入50ml离心管中，加入适量pbs，1800r/min离心8min，弃上清，洗涤2次，细胞计数。2、cik细胞诱导培养用含有5％fbs的md-cm-stmn细胞培养基调整单个核细胞密度为1×106个/ml，接种20ml于培养瓶中，细胞总数为2×107，当天(第0天)加入rhil-21000u/ml、rhifn-γ1000u/ml、cd3鼠抗人单克隆抗体5mg/l，放置37℃，5％co2培养箱中开始培养。第3天开始补加md-cm-stmn细胞培养基，同时补充cd3鼠抗人单克隆抗体、rhifn-γ、rhil-2，用量同前，此后每3d添加新鲜培养基，补加rhifn-γ，用量相同，rhil-2用量减半为500u/ml。3、cik细胞增殖测定台盼蓝染色方法，用细胞计数板分别于培养第0、5、8、13、20天对细胞进行计数，重复3次取平均值。4、肿瘤细胞系的培养将hepg2细胞接种于培养瓶中，加入含有10％fbs的rpmi1640，贴壁细胞用0.25％的胰酶消化。取对数生长期的细胞，接种于96孔板，进行体外杀伤实验。5、mtt法测定多肽ⅲ-1～ⅲ-4对hepg2细胞的细胞毒作用取对数生长期hepg2细胞，调整细胞悬液密度为5×103个/ml，接种于96孔板，每孔200μl。待细胞贴壁后换液，给药组分别加入5μm多肽ⅲ-1～ⅲ-4，对照组加入培养液，每组均设3个平行孔，放置在37℃、5％co2培养箱中作用48h后，各给药组及对照组每孔均分别加入20μlmtt(5g/l)，继续放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，弃上清，每孔加入200μldmso，37℃下摇床振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度(a)值。6、mtt法测定cik对hepg2细胞杀伤作用将培养至第13天的cik细胞作为效应细胞，进行体外杀伤实验。调整hepg2细胞浓度5×103个/ml，每孔100μl，分为ⅲ-1增敏组、ⅲ-2增敏组、ⅲ-3增敏组、ⅲ-4增敏组和常规组，ⅲ-1～ⅲ-4增敏组分别添加5μm多肽ⅲ-1～ⅲ-4，常规组正常培养，放置在37℃、5％co2培养箱中培养至细胞贴壁后换液，按效靶比10：1将效应细胞加入培养孔中，同时另设单独靶细胞(靶细胞+培养液)和单独效应细胞(效应细胞+培养液)为阴性对照，放置在37℃、5％co2培养箱中作用48h后，加入mtt(5g/l)，20μl/孔，继续放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，2000r/min离心5min，翻板弃上清，加入dmso150μl/孔，震荡，待沉淀溶解，放于酶标仪中，490nm测光密度(od)值，按如下公式计算杀伤活性：杀伤率(％)＝{1-[(实验组od值-单独效应细胞od值)/单独靶细胞od值]}×100％。7、统计学方法采用spss19.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，p＜0.05具有统计学意义。三、实验结果1、cik细胞增殖cik细胞在培养第5天细胞增殖速度加快，第5-13天为快速增殖时间段，在第20天细胞增殖达到原种植量的约115倍，在第20天细胞增殖达到原种植量的约180倍。2、多肽ⅲ-1～ⅲ-4对hepg2细胞的细胞毒作用多肽ⅲ-1～ⅲ-4给药组与对照组的吸光度(a)值无显著差异，证明5μm多肽ⅲ-1～ⅲ-4对hepg2细胞无明显细胞毒作用。结果见表1。表1多肽ⅲ-1～ⅲ-4给药组与对照组的吸光度值的比值ⅲ-1ⅲ-2ⅲ-3ⅲ-4a给药/a对照0.981.030.990.973、多肽ⅲ-1～ⅲ-4增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性从表2和图1可以看出，各增敏组cik细胞对hepg2细胞的杀伤率均显著高于常规组。已知5μm多肽ⅲ-1～ⅲ-4对hepg2细胞无明显细胞毒作用，各增敏组cik细胞对hepg2细胞杀伤率的提高只能归结于多肽ⅲ-1～ⅲ-4提高了hepg2细胞对cik细胞的杀伤敏感性，使用多肽ⅲ-1～ⅲ-4对靶细胞hepg2细胞增敏后，效靶比不变的情况下，cik细胞对hepg2细胞的杀伤力显著提高。表2各组cik细胞对hepg2细胞的杀伤率(效靶比10:1)本发明提供的人工多肽可以有效增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的生物制品，以实现使用少量的cik细胞就发挥较优的免疫治疗效果。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。sequencelisting<110>南京盖斯夫医药科技有限公司<120>增强肝癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的人工多肽及其生物制品<130>1<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>prt<213>人工序列<400>1gluthrleuglyglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysmetgluleuglyiletrpasn202530<210>2<211>31<212>prt<213>人工序列<400>2gluthrleuglyglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysmetgluleuglyiletrpasn202530<210>3<211>31<212>prt<213>人工序列<400>3gluthrleuglyglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysmetgluleuglyiletrpasn202530<210>4<211>31<212>prt<213>人工序列<400>4gluthrleuglyglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysmetgluleuglyiletrpasn202530当前第1页12