基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法与流程

本发明涉及的是一种生物检测领域的技术，具体是一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法。

背景技术：

核酸结合蛋白包括dna结合蛋白和rna结合蛋白，参与调控多种细胞功能，包括dna复制和转录，rna加工和翻译，基因沉默以及端粒长度的维持等。rna结合蛋白可以与rna形成核糖核蛋白复合物进而调控rna的合成和降解，也可以与非编码rna比如microrna结合调控信使rna(mrna)的转录后加工。dna结合蛋白包括核小体蛋白和转录因子，在dna复制，转录以及修复的过程中发挥着非常重要的作用。核酸结合蛋白表达或功能的缺失会导致许多疾病的发生，比如癌症和代谢性疾病。由于核酸结合蛋白重要的生物学功能，使得其在细胞内的蛋白质谱以及在不同生理病理条件下的活化状态的研究变得尤为重要。

对核酸结合蛋白研究常用的方法包括染色质免疫沉淀，电泳迁移率实验，染色体捕获技术，dna或rna亲和层析，并应用质谱对核酸结合蛋白进行鉴定。这些方法或以单个或多个基因为中心，研究与其结合的蛋白，或者是以蛋白为中心，研究与其结合的核酸片段。这些技术的特点是专一性高，但是通量低，不能作为核酸结合蛋白组学研究的方法。近几年发展了一些以基因为中心的，可以高通量研究dna结合蛋白或者rna结合蛋白的方法。比如，蛋白微阵列芯片技术，通过人工合成并串联上百个已被证明可以和蛋白结合的dna片段从细胞裂解液中筛选出dna结合蛋白(huetal.,2009)。mrna免疫共沉淀技术利用可以特异性结合mrna的抗体，通过富集mrna从而鉴定到rna结合蛋白(castelloetal.,2012)(baltzetal.,2012)。这两种方法虽然可以鉴定到一定量的核酸结合蛋白，但是由于操作复杂，成本高的原因，在核酸结合蛋白质组学研究中的应用有很大的局限性。直到现在仍然没有一种通用的提取核酸结合蛋白的方法，因此发展一种简单高效的核酸结合蛋白提取方法变得尤为必要。

通常情况下，核酸结合蛋白在细胞中的丰度很低，因此对核酸结合蛋白特异性的富集将有助于对其后续的分析。由于核酸结合蛋白与核酸结合的特性，因此可以通过富集核酸从而提取到核酸结合蛋白。传统的核酸提取的方法基于苯酚-氯仿体系，在提取过程中会丢失绝大多数的核酸结合蛋白，因此需要发展一种在保证核酸结合蛋白不丢失的前提下富集核酸的新方法。

纳米材料比如碳纳米管，石墨烯和氧化石墨烯由于其出色的力学，热力及导电性能被广泛应用于生物医学的研究中，比如生物传感器，药物载体等。以往的研究表明，纳米材料可以通过π-π堆积的作用力稳定的吸附单链核酸。2012年zhang等人利用碳纳米管吸附核酸的特性，从细胞中提取核酸并利用质谱鉴定到2595个蛋白(zhangetal.,2012)，该方法虽然简单，但是核酸结合蛋白提取的特异性只有24％。

技术实现要素：

本发明针对现有技术只能提取核酸，核酸结合蛋白会在提取过程中全部损失，所以无法用来提取核酸结合蛋白的缺陷，提出一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，该方法成本低，操作简单，提取过程不到1分钟，可以简单高效的提取核酸结合蛋白并有助于疾病发生发展相关的核酸结合蛋白的研究。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，然后收集上清液中的核酸结合蛋白即得。

所述的待测细胞为所有类型的动物细胞，优选为重悬于缓冲液中并缓慢加入细胞裂解液，进一步优选为将待测细胞重悬于pbs中为5x10⁶个细胞重悬于20μlpbs。

所述的细胞裂解液，具体为：每裂解5x10⁶个细胞，溶解500μg氧化石墨烯于500μl250mmsds中。

所述的氧化石墨烯尺寸优选为小于500nm。

所述的离心收集是指：用移液器吸头缓慢搅拌充分裂解细胞，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物，超纯水洗复合物3次。

所述的超纯水洗是指：在1.5mlep管中用超纯水重悬复合物并上下颠倒清洗，不打散复合物。

所述的蛋白变性液为6～8m尿素，10～100mmtris-hcl，ph7.0～8.0。

所述的重悬于蛋白变性液，具体为：300-500μl蛋白变性液重悬复合物于1.5mlep管中。

所述的超声处理，优选为在200w-400w环境下超声6～10s。

所述的核酸结合蛋白，其采用但不限于以下方式鉴定得到：采用本发明的方法提取293t细胞的核酸结合蛋白，并应用lc-msms的方法对核酸结合蛋白进行鉴定。

技术效果

与现有技术相比，本发明可以快速有效的富集到细胞内的核酸包括dna和rna，通过对核酸的富集从而提取核酸结合蛋白，本发明操作简单，成本低，耗时短的优点，可用于从各种细胞系中提取核酸结合蛋白。更具体来说，本发明涉及利用纳米材料氧化石墨烯可以吸附核酸的属性，通过富集核酸进而从细胞中富集到核酸结合蛋白。该方法可用于所有动物细胞核酸结合蛋白的提取，结合定量蛋白质组学技术有助于疾病发生发展相关的核酸结合蛋白的发现和研究。

附图说明

图1为本方法的流程示意图；

图2为氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物；

图中：a为氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物照片；b为共聚焦荧光显微镜分析复合物结果，其中dipa为核酸染料；c为三种纳米材料羧基化石墨烯cg为，氧化石墨烯go为，羧基化碳纳米管ccnt为rna提取效率的比较；其中方法a为本发明使用的方法，方法b为文献中使用的方法；氧化石墨烯提取rna的效率最高；d为三种纳米材料dna提取效率的比较；氧化石墨烯提取dna的效率最高；e为五种纳米材料石墨烯g为，羧基化石墨烯cg为，氧化石墨烯go为，羧基化碳纳米管ccnt为，高羧基化碳纳米管hccnt为在rna提取效率中的比较，其中氧化石墨烯的对rna提取效率最高；f为用石墨烯，氧化石墨烯和碳纳米管分别从5x10⁶个细胞中提取的核酸结合蛋白的质量；

图3为sds-page并结合蛋白银染的结果；

图中：a为全细胞裂解液；b为提取的核酸结合蛋白；c为阴性对照：从经过核酸酶处理过后的全细胞裂解液中提取出的蛋白；

图4为lc-msms对提取的核酸结合蛋白的鉴定结果；

图中：a为为打散和不打散的方法清洗复合物分别鉴定到的核酸结合蛋白的数量；b为为蛋白免疫印迹检测dna结合蛋白组蛋白h3和rna结合蛋白ptbp1分别在全细胞裂解液，提取的核酸结合蛋白，核酸结合蛋白提取后细胞上清液中的含量。

具体实施方式

如图1所示，本实施例包括以下步骤：

步骤1、将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解：

1.1)配制含有氧化石墨烯的细胞裂解液，细胞裂解液成分为250mmsds，根据所要裂解的细胞的数量，取相应量的氧化石墨烯并溶解于细胞裂解液中，使其终浓度为1mg/ml，一般5x10⁶个细胞需要500μg氧化石墨烯。

1.2)将细胞重悬于20μlpbs中后缓慢加入到细胞裂解液中裂解细胞，并用移液器吸头缓慢搅拌充分裂解细胞。

所述的待测细胞为293t细胞系。

1.3)在4℃、20000g环境下离心5分钟，弃上清。

1.4)收集氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物，如图2a所示，并用超纯水上下颠倒洗复合物3次，不打散复合物。其结果如图2b所示，核酸被氧化石墨烯所吸附。

到目前为止，仍然没有通用的核酸结合蛋白提取方法。碳纳米管已被报道可以用于核酸结合蛋白的提取(zhangetal.,2012)，与碳纳米管相比，氧化石墨烯可以吸附更多的dna和rna，如图2c-2e所示。相同细胞数目下提取得到的核酸结合蛋白的量是碳纳米管的4倍，如图2f所示。因此，氧化石墨烯更适于核酸结合蛋白的提取。

步骤2、核酸结合蛋白的提取：

2.1)复合物水洗后重悬于蛋白变性液中，400w超声10s使核酸及核酸结合蛋白从氧化石墨烯上脱附。

2.2)在4℃、20000g离心60分钟，收集上清；

2.3)使用3k超滤管置换蛋白变性液为超纯水，并浓缩体积到100μl。

2.4)bca法测蛋白浓度后，取2μg蛋白进行sds-page分析。其结果如图3所示，表明本发明提取核酸结合蛋白特异性高。

步骤3、核酸结合蛋白的表征：

3.1)用本发明的技术从293t细胞中提取核酸结合蛋白，取30μg蛋白进行溶液内酶解。

3.2)采用q-exactiveorbitraplc-msms对所提取到的蛋白进行鉴定，共鉴定到2563个蛋白。

用蛋白免疫印迹技术检验了dna结合蛋白组蛋白h3，rna结合蛋白ptbp1能够被本发明所发展的方法特异性的富集。结果如图4所示，证明了本发明方法可以从细胞中高效，特异的富集核酸结合蛋白。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。