本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种亲和层析介质及应用。
背景技术：
亲和层析是一种蛋白质分离纯化技术。在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。亲和层析就是根据这样的原理设计的。
葡萄球菌蛋白a(staphylococcusaureusproteina，spa，proteina，蛋白a)为金黄色葡萄球菌细胞壁相关蛋白，其具有与人类和其它哺乳动物血液中免疫球蛋白分子的fc段特异性结合的能力，可以吸附igg和含igg的免疫复合物。基于这些特性，蛋白a亲和层析柱已成为生物技术领域广泛应用的纯化抗体的亲和柱，通常在制备蛋白a亲和层析介质时，所用到的环氧氯丙烷活化琼脂糖都以水为反应介质，环氧氯丙烷在水中的溶解度约为6.58％左右，因此该反应是一个复杂的油(环氧氯丙烷)-水-固(凝胶)三相反应体系，反应速率较慢；同时环氧化过程中环氧基在碱性条件下极易发生水解副反应，需要对反应条件进行全面优化和严格控制才能获得较高的活化效率。史清洪等通过在反应介质中引入dmso有效消除了环氧氯丙烷对琼脂糖活化过程中的相界面，使环氧基密度有效提高到了100μmol/ml左右，但反应介质为水，水解反应仍较严重【史清洪等。环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶过程强化及性能评价[j].过程工程学报,2007,7(4):743-746.】。
目前，随着生物技术产业，尤其是生物制药产业的快速发展，蛋 白a的市场需求迅速增加，且对蛋白a亲和柱的亲和力、纯化效率等要求越来越高。但在使用含有蛋白a的亲和层析技术时，存在亲和力低、纯化效率低等问题，因此在施用该亲和层析技术时，需要一种改进的亲和层析介质，提高纯化效果。
技术实现要素：
本发明经过大量研究，开发一种新型亲和层析介质。具体的，本发明提供了：
1、一种亲和层析介质，其特征在于，所述亲和层析介质包含如seqidno.1所示重组蛋白a。
2、上述1所述的亲和层析介质，其特征在于，还包含固相载体，所述固相载体与重组蛋白a偶联。
3、上述2所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。
4、上述3所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖或葡聚糖凝胶。
5、一种制备上述1-4任一所述的亲和层析介质的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)通过化学合成的方法设计合成重组蛋白a基因单体，5‘端ala-asp突变成asn-val，以形成acli酶切位点，各重组蛋白a基因单体间以acli酶切位点相连，第一个重组蛋白a基因单体前端加入与表达载体相连的ncoi酶切位点，6个his和ek酶切位点，最后一个重组蛋白a基因单体末端加入中止密码子taa和与表达载体pet32a相连的bamhi酶切位点；
(2)将步骤(1)的重组蛋白a基因单体酶切后接入载体pet32a的相应酶切位点之间，再以acli内切酶酶切，筛选具有氨苄青霉素抗 性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有4个蛋白a基因单体的葡萄球菌蛋白a的表达载体pet32a-p；
(3)用cacl2法将步骤(2)的表达载体pet32a-p转化大肠杆菌bl21de3，筛选、酶切，获得重组转化子bl21de3/pet32a-p；
(4)将步骤(3)的菌株bl21de3/pet32a-p进行培养发酵，使其高效表达重组蛋白a，再收集菌体，经分离、纯化得到重组蛋白a产品；
(5)用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖或葡聚糖凝胶在介质中进行反应，反应产物与步骤(4)获得的重组蛋白a在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，获得重组蛋白a凝胶。
6、上述5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)琼脂糖凝胶为5％的交联琼脂糖凝胶。
7、如上述6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖凝胶在dmso介质中进行反应。
8、上述1-4任一所述的亲和层析介质在蛋白质分离纯化中应用。
9、上述8所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为抗体。
10、上述9所述的应用，其特征在于，所述抗体为抗egfr抗体。
本发明的亲和层析介质，其包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白a，其中重组葡萄球菌蛋白a核苷酸序列由757个核苷酸构成。本发明重组葡萄球菌蛋白a基因序列如seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.1所示。实验结果表明，本发明的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点，与市售的sp-琼脂糖凝胶ff相比，其动态吸附载量明显提高。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，下述实施例不应理解为对本 发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述。
实施例1重组葡萄球菌蛋白a的制备
1、构建重组葡萄球菌蛋白a基因单体
通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白a基因一个重复片段(重复片段序列如seqidno:2所示的第47-217位核苷酸所示)的序列单体，其包括长度为171bp的重复片段，以及前端加入与表达载体相连的ncoi酶切位点、6个his(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)、ek酶切位点(用于将his和ddddk切去，形成正确的proteina)和acli酶切位点(aacgtt，用于连入多个重复片段)。另外，还包括终止密码子taa，及克隆用bamhi限制性内切酶接头共9bp。标记为“单体1”。
另外，通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白a基因一个重复片段(重复片段序列如seqidno:2的第47-217位核苷酸所示)的序列单体，其序列包括长度为171bp重复片段，以及两端acli酶切位点。标记为“单体2”。
2、构建重组葡萄球菌蛋白a基因的表达载体
用限制型内切酶ncoi和bamhi酶切实施例1所获得的单体1，然后与经ncoi及bamhi酶切的载体pet32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明葡萄球菌蛋白a基因单体已克隆至pet32a中，从而成功构建汗一个葡萄球菌蛋白a基因单体的pet32a载体。
3、含葡萄球菌蛋白a基因单体的pet32a-p载体的构建
将上述步骤1所获得的单体2以acli酶切，回收相应片段，然后与上述步骤2所构建的含有一个重组葡萄球蛋白a基因单体的pet32a载体连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有4个蛋白a基因单体的葡萄球菌蛋白a的表达载体，标记为“pet32a-p”，经检测，pet32a-p表达载体包含如seqidno：2所示基因序列。
4、构建表达重组葡萄球菌蛋白a的大肠杆菌菌株
用cacl2法将上述步骤3所获得的pet32a-p转化bl21de3，在含有氨苄青霉素的lb平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pet32a-p的重组转化子，标志为“bl21de3/pet32a-p”。
5、重组葡萄球菌蛋白a的生产与纯化
(1)菌种的培养发酵
挑取大肠杆菌工程菌bl21de3/pet32a-p，接种于lb培养基中，接种量1～2％v/v，于35℃培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按l:8-1:4接种于发酵培养基上，35℃发酵至o.d600达到0.4～0.7，升温至48℃诱导，3～5小时后离心收菌。
取少量细胞加2×上样缓冲液，进行sds-page凝胶电泳检测，结果显示葡萄球菌蛋白a已诱导可溶表达。
(2)重组葡萄球菌蛋白a的纯化
将步骤(1)收集的菌体用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph7.0-8.0，含有0.1mnacl)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。
将粗提液使用sds-page电泳检测，结果显示大部分葡萄球菌蛋白a被粗提，残存于菌体的量极微：将粗提液进行sephacryl5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组葡萄球菌蛋白 a(命名为“proteina1”)，经检测，proteina1氨基酸序列如seqidno：1所示。
实施例2elisa法检测重组葡萄球菌蛋白a与抗体结合活性
采用elisa法检测上述实施例1制备的proteina1与抗体结合活性，具体过程如下：
1)包被：在96孔板中每孔包被proteina1样品200u1，38℃，1h；
2)封闭：每孔以200u1的1％的bsa封闭，38℃，1h；
3)加一抗：每孔加入约150ug人igg抗体(购自mlbio公司)，38℃，1h；
4)加二抗：每孔加入约200u1，1:1000辣根过氧化物酶标记抗体(购自mlbio公司)，38℃，1h；
5)显色。
同样的方法检测市售proteina(购自古朵生物)与抗体结合活性。
elisa检测结果：本发明的proteina1与人igg抗体结合，每孔包被0.8-1.9ng葡萄球菌蛋白a即可获得明显的检测信号，而市售的proteina需每孔包被7.5-10.5ng葡萄球菌蛋白a时才获得明显的检测信号。可见本发明的proteina1具有更强的抗体结合活性。
实施例3重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质的制备
利用实施例1的proteina1制备琼脂糖凝胶亲和层析介质，包括以下步骤：
1、琼脂糖凝胶的活化：用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(5％的交联琼脂糖凝胶)在二甲基亚砜(dmso,购自日本东丽集团)介质中进行反应，在45-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的琼脂糖凝胶；
2、重组葡萄球菌蛋白a与活化的琼脂糖凝胶的化学偶联：将上述步骤1获得的活化琼脂糖凝胶与实施例1制备的proteina1在10-28℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗抽干，获得葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质。
经检测，制备的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质特性如表1所示：
表1、重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质特性
实施例4重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质的制备
利用实施例1的proteina1制备葡聚糖凝胶亲和层析介质,包括以下步骤：
1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与葡聚糖凝胶在水介质中进行反应，在45-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的葡聚糖凝胶；
2、将上述步骤1获得的活化葡聚糖凝胶与实施例1制备的proteina1在10-28℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质。
经检测，制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质特性如表2所示：
表2、重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质特性
实施例5亲和层析介质分离纯化抗体
使用上述实施例3、实施例4中制备的重组葡萄球菌蛋白a亲和层析介质从抗体培养液中分离纯化抗体(按照201010148069.0所述的方法制备抗egfr单克隆抗体)，具体过程如下：
1、重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质分离纯化抗体
1)、上述实施例3制备的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为l0ml；
2)、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
3)、将2m1抗egfr单克隆抗体培养液用缓冲液a稀释到20m1，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为lml/min；
4)、用缓冲液a再洗5-10个床体积，流速为lml/min；
5)、用缓冲液b(ph4.0的20mm柠檬酸缓冲液，其配制方法如下：柠檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh调至ph4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰；
6)、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；
7)、将分离纯化的抗egfr单克隆抗体与对照品同时进行sds-page电泳分析。
(备注：柱子每使用几次后应该用以缓冲液c(ph3.0的0.5m醋酸缓冲液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固体naoh调至ph3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)
sds-page电泳结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质一次纯化获得的抗egfr单克隆抗体纯度约97.2％。
2、重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质分离纯化抗体
使用上述实施例4中制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质从抗体培养液中分离纯化抗体(按照201010148069.0所述的方法制备抗egfr单克隆抗体)，具体过程如下：
1)、上述实施例4制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为l0ml；
2)、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
3)、将2m1抗egfr单克隆抗体培养液用缓冲液a稀释到20m1，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为lml/min；
4)、用缓冲液a再洗5-10个床体积，流速为lml/min；
5)、用缓冲液b(ph4.0的20mm柠檬酸缓冲液，其配制方法如下：柠檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh调至ph4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰；
6)、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；
7)、将分离纯化的抗egfr单克隆抗体与对照品同时进行sds-page电泳分析。
(备注：柱子每使用几次后应该用以缓冲液c(ph3.0的0.5m醋酸缓冲液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固体naoh调至ph3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)
sds-page电泳结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质一次纯化获得的抗egfr单克隆抗体纯度约96.3％。
3、市售sp-琼脂糖凝胶ff分离纯化抗体
另外，使用相同的方法，利用市售sp-琼脂糖凝胶ff(购自博尔西科技公司)从培养液中分离纯化抗体(按照201010148069.0所述的方法制备抗egfr单克隆抗体)。sds-page电泳结果显示，使用mabselectsure一次纯化获得的抗egfr单克隆抗体纯度约87％。
实验结果表明。本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质及重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质一步就能得到纯度大于96％的抗egfr单克隆抗体，其纯化效果明显优于市售产品。
实施例6亲和层析介质对抗体的动态吸附载量的检测
本发明的亲和层析介质与市售sp-琼脂糖凝胶ff(购自博尔西科技公司)对抗体动态吸附载量比较(按照201010148069.0所述的方法制备抗egfr单克隆抗体)，步骤如下：
1、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
2、2mg/ml浓度抗egfr单克隆抗体上样，流速为lml/min，至10％穿透时停止；
3、根据样品浓度、上样体积及柱体积计算出10％穿透时各凝胶的动态吸附载量。
实验结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶对抗体的动态吸附载量为约45.2mg/ml，本发明的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶对抗体的动态吸附载量为约42.6mg/ml，市售sp-琼脂糖凝胶ff的动态吸附载量约24mg/ml。
实验结果表明，本发明的亲和层析介质对抗体的动态吸附载量明显高于市售的sp-琼脂糖凝胶ff的动态吸附载量，具有更好的纯化效果。