本发明涉及水处理技术领域，特别涉及一种提高囊泡中水通道蛋白表达活性的方法及反渗透膜。
背景技术：
目前，对水通道蛋白反渗透膜的研究最终的目的是提高膜的水通量和脱盐率，而这与水通道蛋白息息相关，水通道蛋白的载入量、活性直接影响到膜的性能，往往水通道蛋白的载入量越大、活性越高，那么膜的性能就越优异。然而，在水通道蛋白反渗透膜的实际制备过程中，水通道蛋白的载入量和活性远远低于理论水平。其原因通常如下：
(1)一个囊泡中所能嵌入的水通道蛋白数量有限；
(2)由于囊泡对水通道蛋白的装载不完全或结合力不够稳固导致水通道蛋白的流失；
(3)水通道蛋白与基膜接触而使活性降低甚至是失去活性；
(4)囊泡与基膜表面结合过程中因基膜表面形态的差异降低了水通道蛋白的活性。
所以，为了提高水通道蛋白反渗透膜的水通量和脱盐率，就要从增加水通道蛋白的载入量和提高其表达活性入手。
然而，一个囊泡中所能嵌入的水通道蛋白的数量是一定的，因此只能从提高其表达活性来达到目的。
当前，丹麦aquaporina/s公司已经商品化生产的水通道蛋白反渗透膜的技术中是将水通道蛋白直接嵌入到囊泡中，通过界面聚合的方法制备的。这种制备方法具有操作简单、所制备的反渗透膜尺寸大、机械强度好，适合于工业化生产的优点。
但是，直接将水通道蛋白嵌入到囊泡中，水通道蛋白本身嵌入量少，再加上囊泡对水通道蛋白的装载不完全或结合力不够稳固或水通道蛋白与基膜接触或基膜表面形态对囊泡的作用等影响，最后真正发挥活性作用的水通道蛋白少之又少，水通道蛋白反渗透膜的性能远远达不到膜中水通道蛋白全部发挥其活性的水平。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高囊泡中水通道蛋白表达活性的方法及使用由此制备的囊泡制得的反渗透膜，以提高水通道蛋白表达活性及反渗透膜的水通量和脱盐率。
本发明的技术方案如下：
一种提高囊泡中水通道蛋白表达活性的方法，包括如下步骤：
第一步包括水通道蛋白的磷酸化作用和磷脂囊泡体系溶液的制备，并且两者没有先后顺序；其中，水通道蛋白的磷酸化作用方法如下：
(1)移取0.5-5mg/ml的水通道蛋白溶液于定量瓶中，分别加入10-200ml的甘油，0.1mmol-5mmol蛋白激酶，5-15mmol磷酸基团供体剂，磷酸基团供体剂与水通道蛋白的摩尔比例为1∶20-1∶200，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至相应量程的定量瓶刻度线，配制浓度为0.01-0.5mg/ml的水通道蛋白储备溶液；
(2)抽取10-100ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.005-0.1mol/l的氯化钙溶液0.1-1ml，和/或滴加磷酸改变溶液的ph值为6-7，和/或往溶液中通入0.5-5ml氧气来激活蛋白激酶使水通道蛋白发生磷酸化作用；
(3)在磷酸化的水通道蛋白溶液中加入去污剂，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复2-4次；
(4)保留离心得到的蛋白质体，溶于ph值为7.5的磷酸盐缓冲液中，置于-20℃下冷冻避光保存；
磷脂囊泡体系溶液的制备方法如下：
将两亲脂质加入去离子水或磷酸缓冲溶液中，超声震荡，制备磷脂囊泡体系溶液，得到浓度为0.05-4mg/ml的样品；
第二步、磷酸化水通道蛋白的引入
将第一步得到的水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡体系溶液混合，加入体积浓度10％甘油1-100ml，0.005-0.1mg/mln-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷0.05-1ml，再将该混合液置于磷酸缓冲液中进行渗析，期间需更换磷酸缓冲液2-5次，得到磷酸化水通道蛋白囊泡。并优选，对磷酸化水通道蛋白囊泡进行纯水透过系数测试来表征其渗透活性。
优选地，所述水通道蛋白选自aqp1、aqp2、aqp4、aqp5、aqp6中的一种或多种。
优选地，所述蛋白激酶选自蛋白激酶a(pka)、蛋白激酶b(pkb)、蛋白激酶c(pkc)、丝氨酸蛋白激酶、苏氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、磷酸化酶激酶、丙酮酸脱氢酶激酶、环腺苷酸蛋白激酶(camp)、环鸟苷酸蛋白激酶(cgmp)、组蛋白激酶中的一种或多种。
优选地，所述磷酸基团供体剂选自三磷酸腺苷(atp)、三磷酸鸟苷(gtp)、二磷酸鸟苷(gdp)、核苷三磷酸(ntp)中的一种或多种。
优选地，所述去污剂选自聚乙二醇十八烷基醚、聚乙二醇辛基苯基醚和十二烷基硫酸钠中的一种或多种，体积浓度为0.05-o.5％，添加量为0.05-1ml，添加去污剂使蛋白质亚基更容易迁移。
优选地，所述两亲脂质选自1，2-二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap)、二油酰磷脂酰丝氨酸(dops)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、天然脂质提取物、心磷脂中的一种或多种。
优选地，所述水通道蛋白质体与囊泡中的两亲脂质的摩尔比为1∶10-1∶500。
本发明还提供一种水通道蛋白反渗透膜，其采用上述的磷酸化水通道蛋白囊泡制备得到。
优选地，制备水通道蛋白反渗透膜的方法采用界面聚合法。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明将水通道蛋白进行磷酸化修饰，提高其表达活性，之后将其成功嵌入囊泡中，将此改性的水通道蛋白囊泡应用于反渗透膜中，提高了膜的水通量和脱盐率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明通过水通道蛋白的磷酸化作用，提高了水通道蛋白的表达活性，再将该磷酸化修饰的水通道蛋白嵌入到囊泡中，应用于反渗透膜中，在达到同等水平水通量和脱盐率的情况下，所使用的水通道蛋白与囊泡的比例大大降低；换言之，在所使用的水通道蛋白与囊泡的比例相同的情况下，反渗透膜的水通量和脱盐率大大提高。
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
对比例1
作为对比，先将0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液与0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液分别按照摩尔比例1∶100和1∶20混合，并分别加入体积浓度为10％甘油20ml，0.01mg/mln-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷0.1ml，再将该混合液置于磷酸缓冲液中进行渗析，期间更换磷酸缓冲液3次，制备水通道蛋白囊泡，对制得的水通道蛋白囊泡进行纯水透过系数测试来表征其渗透活性，得到的纯水透过系数分别为1456.21×10-6m/s和3061.78×10-6m/s。
实施例1
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入甘油10ml，1mmol蛋白激酶a和0.5mmol环腺苷酸蛋白激酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。
抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，并滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。
移取dopc，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。
将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶100混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为2593.09×10-6m/s。
实施例2
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入甘油10ml，1mmol蛋白激酶a和0.5mmol环腺苷酸蛋白激酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。移取适量的dopc，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶20混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为3125.26×10-6m/s。
实施例3
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入甘油10ml，1mmol蛋白激酶c和0.5mmol环腺苷酸蛋白激酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。移取适量的dopc，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶100混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为2658.28×10-6m/s。
实施例4
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入0.1mg/ml的甘油10ml，1mmol蛋白激酶a和0.5mmol丝氨酸酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。移取适量的dops，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶100混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为2562.43×10-6m/s。
实施例5
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入甘油10ml，1mmol蛋白激酶a和0.5mmol环腺苷酸蛋白激酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。移取适量的天然脂质提取物，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶100混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为2487.65×10-6m/s。
实施例6
移取10ml1mg/ml的水通道蛋白溶液于100ml定量瓶中，分别加入甘油10ml，1mmol蛋白激酶a和0.5mmol丝氨酸酶，10mmolatp，用ph值为7.5的磷酸盐缓冲液标定至刻度线，配制0.1mg/ml水通道蛋白储备溶液。抽取10ml上述水通道蛋白储备溶液，滴加0.01mol/l的氯化钙溶液0.2ml，滴加磷酸调节溶液的ph值为6.5，加入体积浓度0.1％聚乙二醇十八烷基醚0.1ml，离心，去掉清液，留下蛋白质体，如此反复4次。移取适量的天然脂质提取物，加入磷酸缓冲溶液，超声震荡30min，制备浓度为0.1mg/ml的磷脂囊泡体系溶液。将水通道蛋白质体与配制好的磷脂囊泡溶液按比例1∶100混合，采用与对比例1相同的方法制备磷酸化水通道蛋白囊泡，制得的磷酸化水通道蛋白囊泡的纯水透过系数为2607.59×10-6m/s。
水通道蛋白反渗透膜的制备实施例
将上述得到的磷酸化水通道蛋白囊泡应用于反渗透膜中，测试该膜的渗透性能，并与未经过磷酸化修饰的水通道蛋白制备的反渗透膜进行比较，发现未磷酸化修饰的水通道蛋白制备的反渗透膜在蛋白与囊泡比例为1∶20的时候，膜在25℃，5bar压力，500ppm氯化钠，ph＝6.5的水溶液的测试条件下，水通量和脱盐率分别为15.21lmh/bar和99.35％；而磷酸化修饰的水通道蛋白制备的反渗透膜在蛋白与囊泡比例为1∶100的时候，膜在25℃，5bar压力，500ppm氯化钠，ph＝6.5的水溶液的测试条件下，水通量和脱盐率分别为15.08lmh/bar和99.33％。
本发明通过人为配制原料进行无活体细胞水通道蛋白的磷酸化修饰，来达到提高水通道蛋白表达活性的目的，并成功将得到的水通道蛋白嵌入两亲脂质囊泡中，将此改性的水通道蛋白囊泡应用于反渗透膜中，从而提高了反渗透膜的水通量和脱盐率。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。