原代T细胞感染用重组逆转录病毒、感染方法及其应用与流程

本发明涉及一种原代T细胞感染用重组逆转录病毒、感染方法及其应用，尤其应用于转染T细胞。

背景技术：

肿瘤免疫治疗(Cancer Immunotherapy)是目前治疗恶性肿瘤最有前景的手段之一。肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，可通过提高肿瘤细胞的免疫原性和增强效应细胞杀伤的能力来激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，也可通过免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。当前的嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)以及T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞(TCR-T)作为过继性细胞回输治疗(Adoptive cellular Therapy，ACT)技术两大最新的免疫细胞技术，被认为是肿瘤的过继性细胞免疫疗法(Adoptive Cellar Immunotherapy，ACI)中最有前景的治疗方式之一。

T细胞过继性细胞回输治疗技术原理如下：识别黑色素瘤相关抗原的重组TCR和嵌合抗原受体(CAR)的基因序列被包装进病毒载体中，通过病毒感染可以实现TCR/CAR在T细胞上的表达，通过将基因工程编辑的T细胞(表达活性的TCR/CAR分子)扩增和回输进患者体内以达到治疗肿瘤的目的。CAR-T/TCR-T疗法要求对病人的效应T细胞在体外进行基因编辑和扩增，这些细胞将具有特异识别和杀伤肿瘤细胞的能力，通过T细胞回输实现治疗肿瘤的目的。如何实现T细胞CAR/TCR分子的高效表达是此过程十分关键的步骤之一，因而传递CAR/TCR基因载体的设计显得尤为重要。常用的载体有病毒载体和非病毒载体(Non-Viral Vectors)，非病毒载体虽然较病毒载体在免疫原性等方面有优势，但是其不仅要克服细胞内及细胞外的屏障，还要克服许多来自提高转染效率的挑战，其次由于没有通用的传送手段，目前可行性非常低，而病毒载体在实现基因转导和表达的效率方面有着绝对的优势，也是目前基因治疗的主流载体。

T细胞由于其本身的生物特性使其进行病毒感染实现外源基因表达的效率非常低，基于不断研究，越来越多的研发工作需要对原代T细胞进行基因编辑，目前国际上也没有十分成熟的产品可以高效感染原代T细胞并保证操作简单，这严重限制和阻碍了相关研究工作的开展。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种原代T细胞感染方法、感染用重组逆转录病毒及其应用，用于解决现有技术中的不足。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种原代T细胞感染用重组逆转录病毒，所述逆转录病毒从5’端到3’端依次包括长链重复序列编码区、包装信号编码区、启动子编码区，puro基因编码区，其中所述包装信号编码区第786-788位的核苷酸编码的序列为ATA；所述包装信号编码区第829-831位的核苷酸编码的序列为GCC；所述启动子编码区第70-72位的核苷酸编码的序列为TGC。

优选地，所述启动子为MSCV。

优选地，启动子编码区和包装信号编码区之间还有增强子，所述增强子的序列为TTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG。

优选地，所述原代T细胞感染用重组逆转录病毒是将HB-RV通过突变获得的。所述HB-RV为现有已知病毒。

更优选的，所述原代T细胞感染用重组逆转录病毒是将HB-RV的1386-1388位的核苷酸序列变为ATA，1429-1431位核苷酸序列变为GCC，1470-1472位核苷酸序列变为TGC。

优选地，所述逆转录病毒载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明另一方面公开了原代T细胞感染用重组逆转录病毒应用于转染T细胞。

本发明另一方面公开了原代T细胞感染用重组逆转录病毒，其用于制备抑制肿瘤体内生长以及转移的药物或试剂盒。

本发明另一方面公开了一种抑制肿瘤体内生长及转移的试剂盒，包括治疗有效量的如上所述的原代T细胞感染用重组逆转录病毒；所述试剂盒中还可以包含HB-Tmax2.0-M/Hplate24和封闭液；所述HB-Tmax2.0-M/Hplate24为含油活化原代T细胞所需的anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被的24孔板。

本发明另一方面公开了一种原代T细胞活化方法，至少包括以下步骤：

a)将anti-CD3和anti-CD28的抗体用缓冲液稀释至5-10ug/ml，向表面未做处理的多孔板上每个培养孔加入抗体溶液，包被12-16h；

b)弃掉抗体包被液，用缓冲液封闭多孔板，封闭；

c)弃掉封闭液，烘干；

d)将原代T细胞加到上述包被好的培养孔中，放入CO₂培养箱进行活化；

e)观察活化细胞体积增大后，保留20～30％体积的培养基，其余培养基用移除，并将剩余的细胞吹散重悬，计数，每个培养孔加入30ul如上所述的原代T细胞感染用重组逆转录病毒，病毒滴度为1*10⁸TU/ml，加入病毒后吹打混匀将平板于室温，进行离心。

优选地，所述步骤a)中缓冲液选自pH 7.4磷酸缓冲盐溶液。

优选地，所述述步骤a)中缓冲液选自1％BSA(牛血清白蛋白)的磷酸缓冲盐溶液，封闭时间是30min-1h。

优选地，所述步骤C)中烘干的条件是37℃烘干2-4h。

如上所述，本发明的逆转录病毒载体及其应用，具有以下有益效果：

(1)可同时兼顾小鼠和人的原代T细胞的感染；

(2)提高病毒感染小鼠及人原代T细胞的感染能力至60％以上；

(3)以最精简的操作实现最好的感染效果；

(4)与初代病毒载体相比提高外源蛋白表达水平到2～3倍。

(5)活化方法简单，效率高。

附图说明

图1显示为本发明实施例2中所述制备的转染后T细胞荧光图。

图2显示为本发明实施例2中对照组所述制备的转染后T细胞荧光图。

图3显示为本发明实施例2中活化原代T细胞的加入流式细胞仪结果示意图。

图4显示为本发明实施例2中对照实验中活化原代T细胞的加入流式细胞仪结果示意图。

图5显示为本发明实施例3中所述制备的转染后T细胞荧光图。

图6显示为本发明实施例3中对照组所述制备的转染后T细胞荧光图。

图7显示为本发明实施例3中活化原代T细胞的加流式细胞仪结果示意图。

图8显示为本发明实施例3中对照实验中活化原代T细胞的加入流式细胞仪结果示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

在以下实施例中

PBS(磷酸缓冲盐溶液)

BSA(牛血清白蛋白)

实验试剂

实验仪器

实施例1：制备试剂盒

(1)HB-Tmax2.0-M/Hplate24的制备

a)将anti-CD3和anti-CD28的抗体用pH 7.4PBS缓冲液稀释至8ug/ml，表面未做处理的24孔板每孔加入500ul稀释好的抗体溶液，于4℃包被14h；

b)弃掉抗体包被液，用1％BSA的PBS缓冲液封闭24孔板，室温封闭45min；

c)弃掉封闭液，甩干后于37℃烘干3h；

d)装入铝箔袋，加入干燥剂，封口贴标签，储存于4℃。

(2)组装：

将本发明所述的原代T细胞感染用重组逆转录病毒(HB-RV3)和HB-Tmax2.0-M/Hplate24组装成盒，病毒需存储于-80℃，其余组分储存于2-8℃。

所述HB-RV3通过使用HB-RV突变获得。

实施例2：小鼠原代T细胞感染

a)分离小鼠原代T细胞(Untouched^TM Mouse CD4Cells Kit，11416D，thermo)，用含200U/ml的rmIL-2(R&D，402-ML-020)的完全培养基重悬细胞，2*10⁵个细胞每孔铺HB-Tmax2.0-Mplate24(实施例1制备)，保持培养液的体积为2ml，放入5％CO₂培养箱，37℃活化48h。

b)观察活化细胞体积增大，吸掉1.5ml的培养基留下约500ul培养基并将细胞吹散重悬，计数，数目变为原来的60％，即每孔1.2*10⁵个活化的细胞，加入HB-RV3病毒，按照MOI 25，即每孔加入30ul的HB-RV3病毒，病毒滴度为1*10⁸TU/ml，加入病毒后吹打混匀。

c)将平板于室温，2000g，离心2h。

d)离心结束放回5％CO₂培养箱，37℃感染6h，6h后弃掉70％的上清，加入含200U/ml的rmIL-2的完全培养基补足体积为2ml，放入5％CO₂培养箱，37℃培养72h，染后的24h可见荧光开始表达(如图1)，(加入流式细胞仪分析结果如图3)。

对照实验：采用在相同条件下使用慢病毒的转染小鼠原代T细胞，荧光表达结果见图2，结果加入流式细胞仪，结果如图4。

结果可见HB-Tmax2.0-M试剂感染小鼠原代T细胞的效率明显高于传统慢病毒感染。

实施例3：人原代T细胞感染

a)分离人原代T细胞(Untouched^TM Human CD4Cells Kit，11352D，thermo)，用含200U/ml的rhIL-2(R&D)的完全培养基重悬细胞，2*10⁵个细胞每孔铺HB-Tmax2.0-Hplate24，保持培养液的体积为2ml，放入5％CO₂培养箱，37℃活化48h。

b)观察活化细胞体积增大，吸掉1.5ml的培养基留下约500ul培养基并将细胞吹散重悬，计数，数目变为原来的70％，即每孔1.4*10⁵个活化的细胞，加入HB-RV3病毒，按照MOI 50，加入病毒后吹打混匀。

c)将平板于室温，2000g，离心2h。

d)离心结束放回5％CO2培养箱，37℃感染12h，12h后弃掉70％的上清，加入含200U/ml的rhIL-2的完全培养基补足体积为2ml，放入5％CO₂培养箱，37℃培养72h，可见荧光表达(如图5)(加入流式细胞仪分析结果如图7)。

对照实验：采用相同条件下使用慢病毒的转染人原代T细胞，荧光结果见图6，结果加入流式细胞仪，结果如图8。

结果可见HB-Tmax2.0-M试剂盒感染小鼠原代T细胞的效率明显高于传统慢病毒感染。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 汉恒生物科技（上海）有限公司

<120> 原代T细胞感染用重组逆转录病毒、感染方法及其应用

<130> 0001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6470

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGACTCGCTGATCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGATTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGTCTTTCATTTGGAGGTTCCACCGAGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCCCCCGCCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCGGTCGTTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGTGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAATGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGATACGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTAGATCTCTCGAGCGCGTTAGCCAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACTGCCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCCTCGAGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGGATCCGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGGCCTATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTGAATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAAGAGCTGGGGAGAATTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA 6470