技术领域:
本发明涉及一种在水中利用尿素大量诱导少孢节丛孢产捕器的方法，属生物技术领域。
背景技术：
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由于线虫分布广泛，长期以来严重危害着畜牧业和农业的发展。对于线虫病的防治目前主要采用的是各种化学驱虫剂，大量驱虫药的使用导致药物的残留、耐药性的产生、次级代谢产物污染环境等问题的日趋严重，利用捕食线虫性真菌对线虫进行防治能够避免上述问题的产生。少孢节丛孢(arthrobotrysoligospora)是一类捕食线虫真菌，属于半知菌纲。作为一种兼性寄生真菌，少孢节丛孢在普通环境中营腐生生活；但在周围环境存在线虫时，该真菌则通过营养菌丝体特化形成三维菌网的捕器捕捉线虫。因此，捕食器官是捕食线虫真菌包括少孢节丛孢最重要的侵染结构，研究该类真菌捕器的特征对于捕食线虫性真菌的作用机理也具有重要意义。
国内外的报道均提示，除线虫以外的其它一些含氮化合物如尿素，能够诱导少孢节丛孢产生三维菌网型的捕器捕杀线虫。但目前尿素诱导捕食器官产生的实验均是在水琼脂平板上进行，尿素诱导捕器产生的最佳浓度为300mg/l。与此同时，此方法虽然便于观察捕器，但由于产生的捕食器官和菌丝量少，且都是镶嵌于琼脂中，因此再利用这些数量过少的捕器菌丝进行下一步实验或者应用就难以实现，也成为尿素诱导的少孢节丛孢产捕器的一大瓶颈。
本发明提供的在水中利用尿素大量诱导少孢节丛孢产捕器的方法，经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种在水中利用尿素大量诱导少孢节丛孢产捕器的方法。
本发明的在水中利用尿素大量诱导少孢节丛孢产捕器的方法，其具体步骤如下：
1、cmy培养基培养真菌
cmy平板培养基的制作：20g玉米粉煮沸30min后过滤加入2g酵母提取物，用去离子水补足1l，ph自然。将在pda培养基上新鲜培养5天的少孢节丛孢接种到三角瓶中的培养基上，28℃下培养2周。
2、用玻璃珠震荡的方法洗孢子
将无菌玻璃珠和无菌水加入到培养真菌的三角瓶中，震荡洗下孢子后，用4层擦镜纸过滤，含有孢子的滤液收集到培养皿中，置室温下培养72h。
3、尿素诱导
在上述培养了72h的孢子滤液中加入尿素，使尿素的浓度达到0.5mg/l，置于28℃下诱导72h后镜检可见大量捕器的产生，将漂浮在水表面的菌丝用枪头挑出作为后续实验的材料。
本发明的有益效果在于：
1、在灭菌的无菌水中利用尿素能稳定地诱导少孢节丛孢产生捕器，并能获得大量菌丝，为后续深入分析研究捕食器官的结构、功能以及相关的应用提供了切实可行的操作方案。
2、本发明操作过程简单，试剂低廉，是一种能够广泛推广的新方法。
附图说明：
图1显示尿素诱导少孢节丛孢72h后光镜下的捕器形成情况。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明作进一步是的详述。
实施例：尿素诱导少孢节丛孢产捕器菌丝的总rna提取
一、获得少孢节丛孢产捕器
在水中利用尿素大量诱导少孢节丛孢产捕器，其具体步骤如下：
1、cmy培养基培养真菌
cmy平板培养基的制作：20g玉米粉煮沸30min后过滤加入2g酵母提取物，用去离子水补足1l，ph自然。将在pda培养基上新鲜培养5天的少孢节丛孢接种到三角瓶中的培养基上，28℃下培养2周。
2、用玻璃珠震荡的方法洗孢子
将无菌玻璃珠和无菌水加入到培养真菌的三角瓶中，震荡洗下孢子后，用4层擦镜纸过滤，含有孢子的滤液收集到培养皿中，置室温下培养72h。
3、尿素诱导
在上述培养了72h的孢子滤液中加入尿素，使尿素的浓度达到0.5mg/l，置于28℃下诱导72h后镜检可见大量捕器的产生，将漂浮在水表面的菌丝用枪头挑出即用枪头挑出即作为下一步实验的材料。
二、提取样品的总rna
取上述诱导的菌丝，根据rnaextractionkit(axygen)试剂盒说明书提取样品的总rna，步骤如下：
a.取诱导菌丝体，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末，取30—100mg菌丝粉末至1.5mlep管中；b.加入400μlbufferr-ⅰ，涡旋振荡；
c.加入150μlbufferr-ⅱ，涡旋振荡15-30s，12,000×g，离心5min(4℃下离心)；
d.转移上清至新1.5mlep管中，加入250μl异丙醇，混合均匀；
e.将制备管置于2mlep管中，转移上述混合液到制备管中，6,000×g，离心1min(4℃下离心)；
f.弃滤液，将制备管置回到2mlep管中，加入500μlbufferw1a，12,000×g，离心1min；
g.弃滤液，将制备管置回到2mlep管中，加入700μlbufferw2，12,000×g，离心1min，此步骤重复2次；
h.弃滤液，将制备管置回到2mlep管中，12,000×g，离心1min；
i.将制备管置于新的1.5mlep管中，在制备管膜中央加入70-100μlbufferte或rnase-free水；
j.室温静置1min，12,000×g，离心1min，洗脱得rna。
实验证明：在灭菌的无菌水中利用尿素能稳定地诱导少孢节丛孢产生捕器，并能获得大量菌丝，这为后续深入分析研究捕食器官的结构、功能以及相关的应用提供了切实可行的操作方案。