一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法。

背景技术：

红曲菌（monascus）是小型腐生丝状真菌，在发酵过程中不仅能产生多种芳香物质和水解酶类等初级代谢产物，还能次级代谢产生一系列聚酮类（polyketide）化合物如红曲色素、桔霉素等。但红曲霉发酵产生红曲色素同时其基因性真菌毒素即桔霉素(citrinin)相伴而生，桔霉素不仅可以致畸、导致肿瘤的发生，而且可以诱发突变，而使红曲产品的食用安全性受到质疑，严重影响了红曲产品的全球化推广。

在红曲霉发酵生产各类红曲制品过程中，红曲色素产量及桔霉素含量问题是常面临的两个瓶颈。红曲霉的发酵培养除了受菌种本身限制外，外界因素影响很大，可通过培养基优化、混菌发酵、添加表面活性剂或金属离子等方式来提高色素产量。另外，抗氧化剂能干扰自由基连锁反应中引发及扩散过程，保护细胞免受破坏，在培养基中添加抗氧化剂，不仅可以增加红曲色素的产量，还会影响菌丝颜色以及桔霉素含量，不同抗氧化剂及添加量对红曲发酵结果的影响存在差异。

技术实现要素：

本发明在于针对目前红曲色素产量及桔霉素含量问题，提供一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法，通过添加芦丁、维生素e或硫辛酸液态发酵红曲霉，提高色素产量的同时降低桔霉素，提高红曲产品的安全性。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

以紫红曲霉(monascuspurpureus)fzump1501为出发菌株，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基菌株活化、种子液制备、外源添加抗氧化剂发酵培养基制备后，液态发酵红曲霉可提高其色素产量降低桔霉素。

具体实验步骤如下：

1）种子培养基的制备：按每1000ml种子液培养基添加籼米粉30~40g、葡萄糖10~14g、黄豆粉8~14g、nano30.8~1.4g、kh2po40.6~1.4g、mgso4.7h2o0.2~0.4g，去离子水定容至1000ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装种子液培养基，121℃灭菌20min；

2）种子液的制备：将斜面活化的红曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在恒温培养箱中25~35℃恒温活化培养6~8天，经活化后加入无菌的0.85%生理盐水将红曲霉孢子洗脱下来制得孢子悬浮液，孢子悬浮液的浓度为10⁶-10⁸个/ml，接种8~12%（v/v）的红曲霉孢子悬浮液于种子培养基，充分混匀后于摇床振荡培养，温度25~35℃，转速180~200r/min，培养48~72h；

3）发酵培养基制备：按每1000ml发酵培养基中含有味精21~23g、硫酸铵8~10g、籼米粉25~35g、葡萄糖10~14g、磷酸二氢钾2.5~3.5g、一水合硫酸锰0.05~0.10g、七水合硫酸镁0.5~1.0g，以去离子水配制后添加抗氧化剂，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装发酵培养基，121℃灭菌20min；抗氧化剂为芦丁、维生素e或硫辛酸，添加量为10~250μg/ml；

4）接种3~9%（v/v）的红曲霉种子液于发酵培养基，充分混匀后25~35℃，转速180~200r/min，振荡培养5~8天，即得色素产量高、桔霉素低的红曲发酵液。

所述的籼米粉和黄豆粉的大小为20~80目。

所述红曲霉为紫红曲霉(monascuspurpureus)fzump1501，并于2016年06月24日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：cgmccno.12516。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

本发明的优点在于：本发明采用在配制发酵培养基时添加抗氧化剂，液态发酵红曲霉技术，添加简单合理，成分安全无害，效果优良且价格低廉，制备发酵工艺过程稳定合理，可在提高红曲色素产量的同时降低桔霉素含量，提高红曲相关产品安全性，也可用于食品等相关红曲企业的安全规模化生产。

本发明中红曲霉发酵液色价测定方法

取5ml发酵液于离心管，4500r/min离心10min，上清按适当倍数稀释后测定发酵液胞外色素色价，按2~4倍数（v70%乙醇/v发酵液）添加70%乙醇至离心菌体沉淀混匀，超声处理20min，55~65℃水浴处理2h后离心取上清，按适当倍数稀释后测定发酵液胞内色素色价，色价采用紫外光谱仪测定，波长设定范围为380~550nm，测定结果取410nm、465nm和510nm处的吸光度值乘以对应稀释倍数即可得色素色价。

本发明中红曲霉发酵液总菌量测定方法

无菌取250~300μl发酵液300g/min离心处理5min，定量取200μl上清，再经10000~12000r/min离心处理10min，取沉淀用dna提取试剂盒提取红曲真菌基因组dna后，以红曲真菌基因组dna为模板，采用红曲霉菌株特异性引物mp-f/mp-r（mp-f：catctggtcctcaacttcc，mp-r：gtgttattcccgcatcaa）对红曲霉菌量进行实时荧光定量pcr（qpcr）分析。

本发明中红曲霉发酵液桔霉素测定方法

采用高效液相色谱法测定发酵液中的桔霉素含量，具体方法参考国家标准《红曲产品中桔青霉素的测定》gb/t5009.222-2008。

附图说明

图1抗氧化剂灭菌前后抗氧化活性对比。

图2外源添加硫辛酸在实施例1中的发酵结果。

图3外源添加芦丁在实施例2中的发酵结果。

图4外源添加维生素e在实施例3中的发酵结果。

具体实施方式

上述是本发明的相关概述，接下来结合具体实施实例进行进一步阐释说明，但本发明不仅仅限于以下具体实施方式。

实施例1

1）种子培养基的制备：按每1000ml种子液培养基添加籼米粉30g、葡萄糖14g、黄豆粉14g、nano31.3g、kh2po41.2g、mgso4.7h2o0.2g，去离子水定容至1000ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装种子液培养基，121℃灭菌20min；

2）种子液的制备：将斜面活化的红曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在恒温培养箱中28℃恒温活化培养8天，经活化后加入无菌的0.85%生理盐水将红曲霉孢子洗脱下来制得孢子悬浮液，接种8%（v/v）的红曲霉孢子悬浮液于种子培养基，充分混匀后于摇床振荡培养，温度28℃，转速200r/min，培养72h；

3）发酵培养基制备：按每1000ml发酵培养基中含有味精21g、硫酸铵10g、籼米粉25g、葡萄糖14g、磷酸二氢钾2.8g、一水合硫酸锰0.06g、七水合硫酸镁0.8g，以去离子水配制后添加抗氧化剂硫辛酸100μg/ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装发酵培养基，121℃灭菌20min；

4）接种7%（v/v）的红曲霉种子液于发酵培养基，充分混匀后28℃，转速200r/min，振荡培养5天，即得色素产量高，桔霉素低的红曲发酵液。

本发明所涉及的一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法中上述实例得到发酵液，胞外色价提高75.57%，胞内色价提高55.33%，胞外桔霉素含量降低73.20%，仅为4.42mg/l,胞内桔霉素含量降低68.85%，仅为7.04mg/l。

实施例2

1）种子培养基的制备：按每1000ml种子液培养基添加籼米粉35g、葡萄糖10g、黄豆粉14g、nano31.0g、kh2po40.8g、mgso4.7h2o0.4g，去离子水定容至1000ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装种子液培养基，121℃灭菌20min；

2）种子液的制备：将斜面活化的红曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在恒温培养箱中28℃恒温活化培养6天，经活化后加入无菌的0.85%生理盐水将红曲霉孢子洗脱下来制得孢子悬浮液，接种10%（v/v）的红曲霉孢子悬浮液于种子培养基，充分混匀后于摇床振荡培养，温度30℃，转速200r/min，培养60h；

3）发酵培养基制备：按每1000ml发酵培养基中含有味精22.5g、硫酸铵9.5g、籼米粉30g、葡萄糖12g、磷酸二氢钾3.2g、一水合硫酸锰0.06g、七水合硫酸镁0.6g，以去离子水配制后添加抗氧化剂芦丁150μg/ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装发酵培养基，121℃灭菌20min；

4）接种4%（v/v）的红曲霉种子液于发酵培养基，充分混匀后30℃，转速200r/min，振荡培养7天，即可得色素产量高，桔霉素低的红曲发酵液。

本发明所涉及的一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法中上述实例得到发酵液，胞外色价提高42.70%，胞内桔霉素含量降低92.55%。

实施例3

1）种子培养基的制备：按每1000ml种子液培养基添加籼米粉30g、葡萄糖14g、黄豆粉14g、nano31.3g、kh2po41.2g、mgso4.7h2o0.2g，去离子水定容至1000ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装种子液培养基，121℃灭菌20min；

2）种子液的制备：将斜面活化的红曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在恒温培养箱中28℃恒温活化培养8天，经活化后加入无菌的0.85%生理盐水将红曲霉孢子洗脱下来制得孢子悬浮液，接种8%（v/v）的红曲霉孢子悬浮液于种子培养基，充分混匀后于摇床振荡培养，温度28℃，转速200r/min，培养72h；

3）发酵培养基制备：按每1000ml发酵培养基中含有味精21g、硫酸铵10g、籼米粉25g、葡萄糖14g、磷酸二氢钾2.8g、一水合硫酸锰0.06g、七水合硫酸镁0.8g，以去离子水配制后添加维生素e100μg/ml，ph自然，三角瓶或其他可高压灭菌容器分装发酵培养基，121℃灭菌20min；

4）接种7%（v/v）的红曲霉种子液于发酵培养基，充分混匀后，28℃，转速200r/min，振荡培养5天，即可得色素产量高，桔霉素低的红曲发酵液。

本发明所涉及的一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法中上述实例得到发酵液，胞外色价提高43.02%，胞内色价提高38.68%，胞外桔霉素含量降低72.53%，仅为4.53mg/l，胞内桔霉素含量降低76.20%，仅为5.38mg/l。

以上所述为本发明较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖内容。

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