一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种生产复苏促进因子(resuscitationpromotingfactor,rpf)的基因工程菌和利用该基因工程菌快速制备高纯度rpf蛋白的方法，具体涉及重组蛋白的应用。

背景技术：

复苏促进因子(resuscitationpromotingfactor,rpf)是由俄罗斯mukamolova课题组发现的一种由micrococcusluteus在对数生长期后期分泌，在皮摩尔(10^-12mol/l)浓度下就能使处于活的但非可培养(viblebutnon-culturable,vbnc)状态的自身菌体重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质。rpf除了对自身vbnc菌体有复苏促进作用外，还可以复苏与其近缘的处于vbnc时期的革兰氏阳性菌mycobacterium属的部分菌种，与该rpf相似的基因也在链霉菌、棒状杆菌等高gc的革兰氏阳性菌中存在。mukamolova等人还报道了rpf采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠中的vbnc微生物复活，还可以刺激某些细菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。

目前有关rpf的研究主要集中在对人体vbnc菌体(如结核分枝杆菌属)的复苏、免疫学及结核病的快速诊断等方面，然而利用rpf对于土壤、水体等环境样品中处于vbnc状态的特殊微生物资源发掘国内外还鲜有报道。

技术实现要素：

本发明提供一种利用生物工程技术构建生产重组复苏促进因子的基因工程菌，应用于土壤、水体等环境样品中处于vbnc状态的的微生物的复苏和分离。

一种生产复苏促进因子的基因工程菌，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，菌株号为pet28a-rpf(wt)，保藏编号为cgmccno.13217。

藤黄微球菌(micrococcusluteus)含有有编码复苏促进因子基因(genbank登录号cp001628)。本发明将micrococcusluteus复苏促进因子基因装载在pet-28a(+)载体上，转入到大肠杆菌宿主中，得到一株工程菌。该工程菌已于2016年10月31号保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13217。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：escherichiacoli，菌株号为pet28a-rpf(wt)。

所述编码复苏促进因子基因rpf的碱基序列如seqidno：1所示。

本发明还提供一种如所述基因工程菌在制备高纯度重组rpf蛋白中的应用。利用上述工程菌简单、快速制备高纯度的重组rpf蛋白。

重组rpf蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明还提供一种所述基因工程菌在复苏和分离环境样品中活的但非可培养状态微生物中的应用。包括如下步骤：将所述基因工程菌表达的重组rpf蛋白分离纯化后加入环境样品培养体系中，培养结束后收集微生物。

进一步地，所述环境样品为土壤样品，更进一步地，所述土壤为垃圾填埋场渗滤液均质池周围土壤样品。

优选地，所述重组rpf蛋白的添加终浓度为4～6μg/ml；进一步地，终浓度为5μg/ml。

基因工程菌表达重组蛋白的步骤为：将所述基因工程菌在含卡那霉素的lb培养基中培养过夜；次日接种至相同抗性的新鲜培养基中，待菌体生长到od600为0.6～0.8时，加入异丙基硫代β-d-半乳糖苷，降低培养温度至20～22℃，低转速培养12-16小时后离心收集菌体，从菌体中分离纯化重组rpf蛋白。

本发明是利用工程菌制备的rpf蛋白促进土壤样品中潜在休眠细菌生长，提高分离丰度，可应用于环境样品(土壤、水体等)中特殊生理功能微生物类群的发掘和分离。自然界中广泛存在着活的但不可培养微生物，这些微生物资源通过传统的微生物分离方法无法获得，通过添加本发明所涉及重组rpf蛋白，可促发这类微生物生长，应用于某些环境样品中微生物资源多样性的发掘。

本发明的工程菌菌株的制备方法及应用过程如下：

(1)以藤黄微球菌的基因组dna为模板，通过pcr扩增rpf基因；将pcr产物插入到表达质粒pet-28a(+)多克隆位点处，构建重组质粒pet28a-rpf，随后将重组质粒转入大肠杆菌获得基因工程菌。

(2)将含有重组质粒的大肠杆菌接种到5ml含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb培养基中培养过夜；次日接种到200ml相同抗性的新鲜培养基中，待菌体生长到od600为0.6～0.8时，加入终浓度为1mm的异丙基硫代β-d-半乳糖苷，降低培养温度至22℃，低转速培养12-16小时后离心收集菌体。通过细胞超声破碎、ni亲和柱纯化及透析处理即可获得高纯度的目标蛋白。

(3)rpf蛋白对于土壤样品潜在休眠细菌的复苏和促生长作用，利用工程菌发酵所制备的rpf蛋白处理土壤样品，菌液密度相比对照最大可提高18倍，可用于环境样品中vbnc状态微生物资源的发掘和分离。

与现有技术相比，本发明所具有的优势：

(1)由于藤黄微球菌自身分泌的复苏促进因子含量低、提取困难，因此不利于直接利用藤黄微球菌来生产复苏促进因子。本发明将复苏促进因子基因转入到可快速繁殖、培养条件简单的大肠杆菌宿主内，能有效地解决这些问题。相比酵母工程菌，大肠杆菌更易培养、培养周期更短、操作简单。

(2)本发明构建的工程菌表达产物是细胞内可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、ni亲和柱纯化及透析处理即可获得高纯度的目标蛋白，纯度90％以上。

(3)利用本发明所生产的rpf活性蛋白用于环境样品中休眠微生物的复苏和促生长，这将突破传统微生物分离方法的局限，极大提高获得vbnc状态微生物的可能性。

(4)藤黄微球菌自身分泌的复苏促进因子含量低、提取工艺复杂、无法通过定性、定量的实验方法鉴别，将复苏促进因子基因转入到可快速繁殖、培养条件简单的大肠杆菌宿主内，能有效地解决这些问题。

(5)相比野生菌株原位处理，野生型菌株培养复杂(培养基成分复杂、培养周期长)，分泌的rpf产量极低，制备工艺复杂，且无法通过蛋白质电泳及western杂交等方法鉴别。

附图说明

图1pcr扩增来源于micrococcusluteus的rpf基因经1％琼脂糖凝胶电泳检测图。m泳道为dna分子量标准；第1泳道为micrococcusluteus基因组dna；第2泳道为pcr扩增产物(rpf基因)。

图2重组质粒pet28a-rpf的构建步骤示意图。

图3重组rpf蛋白经15％sds-page分析图。m泳道为蛋白质分子量标准；第1泳道为蛋白粗提液；第2，3泳道为ni柱纯化组分(重组rpf蛋白)。

图4土壤样品经rpf处理培养72小时后菌密度比较图。

具体实施方式

下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可以参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook,j.,russell,dsvidw.,molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,2001,ny,coldspringharbor)。

实施例1：复苏促进因子基因的克隆及基因工程菌构建

(1)藤黄微球菌micrococcusluteus的培养及其基因组dna的提取

将micrococcusluteus接种至乳酸盐基本培养基(lactateminimalmedium,lmm)35℃复活培养。

lmm培养基配方：4.0gnh4cl、1.4gkh2po4、0.005g生物素(biotin)、0.02gl-蛋氨酸、0.04g维生素b1、1.0g肌苷(inosine)、0.03gmgso4、10.0gl-乳酸锂盐(lithiuml-lactate)和1.0ml矿物质盐溶液(0.375gcuso4·5h2o、0.785gmncl2·4h2o、0.183gfeso4·7h2o、0.029gna2moo4·2h2o和0.089gznso4·7h2o)，加入蒸馏水1000ml溶解，调节ph至7.5，高温高压灭菌。

取5ml藤黄微球菌培养液离心收集菌体，用200μl的25mmol/ltris-hcl缓冲液(ph8.0,含50mmol/l葡萄糖、10mmol/ledta)重悬沉淀，加入50μl的50mg/ml溶菌酶，4℃消化1小时；加入125μl的sds溶液(终浓度为2％w/v)反应10分钟；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，离心5分钟，将上清液转移到另一支离心管中；向沉淀中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀菌体dna，12000rpm离心5分钟，倒去上清后，用70％的乙醇洗涤dna；离心后除去上清，用灭菌的去离子水重新溶解，所得基因组dna溶液置-20℃冰箱中备用。

(2)复苏促进因子基因的克隆及工程菌株构建

micrococcusluteus基因组中含有复苏促进因子编码基因(genbank:cp001628)。cp001628基因是通过pcr方法从上述菌株的基因组dna中扩增得到。上下游引物是根据cp001628基因的序列及表达质粒的酶切位点而设计的，委托上海生工生物工程公司合成。

上游引物：5'-gcgcggatccatggacaccatgactctcttcacc-3'(seqidno：3)，划线部分为bamhi位点；

下游引物：5'-gatcaagctttcaggcctgcggcaggacgagctcc-3'(seqidno：4)，划线部分为hindiii位点。

两个引物所设计的酶切位点与表达质粒pet-28a(+)多克隆位点区域的bamhi和hindiii相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。

pcr反应体系：在50μl反应体系中含1μldna聚合酶(neb公司phusion超保真dna聚合酶)，5μl10×缓冲液，2μldntp混合物(每种核苷酸浓度2.5mm)，2μlmicrococcusluteus基因组dna，1μl上游引物(20pmol/μl)，1μl下游引物(20pmol/μl)，38μl超纯水。pcr反应条件为：首先95℃预变性5min；每个循环包括95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃延伸5min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。分子量与预期的(672bp)一致(见图1：第2泳道)。使用纯化试剂盒对pcr产物进行回收。

将纯化的pcr产物用限制性内切酶bamhi和hindiii酶切(neb公司)，在37℃下孵育3小时。酶切完毕，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，应用dna凝胶试剂盒回收酶切后的dna片段。

应用同样酶切割pet-28a质粒，随后用碱性磷酸酶(fermentas公司)处理质粒(每50μl体系加入1μl，37℃孵育1h)，在0.8％琼脂糖凝胶中检测线性载体并进行回收纯化。然后将处理过的目的基因片段与线性载体片段利用t4dna连接酶(neb公司)连接。将连接产物转入大肠杆菌bl21(de3)codonplus中，用含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行阳性克隆筛选。随机挑取单克隆进行测序，测序结果与genbank登录序列完全一致，证明得到了含有复苏促进因子基因的重组质粒，命名为pet28a-rpf，重组质粒构建步骤如图2所示。

实施例2：复苏促进因子基因工程菌构建及其表达、纯化

将含有重组质粒的大肠杆菌接种到5mllb培养基(含50μg/ml卡那霉素)中37℃振荡培养过夜；次日接种到200ml相同抗性的新鲜培养基中，37℃振荡培养，待菌体生长到od600为0.6～0.8时，加入100mm的异丙基硫代β-d-半乳糖苷(iptg)至终浓度为1mm，降低培养温度至22℃，对菌体进行诱导使其表达大量目的蛋白，同时避免包涵体产生，100rpm培养12-16小时后离心收集菌体。

加入5-10倍体积的50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)重悬菌体，超声破碎10分钟；离心(12000rpm,30min)，收集上清得到粗提液。

因为所表达的目标蛋白n-端含有组氨酸标签，应用镍亲和柱对重组蛋白进行纯化，用100mm咪唑洗脱与柱料结合的目的蛋白，洗脱体积为10ml。随后利用sds-page电泳检测目标蛋白的纯度，结果如图3所示：第2、3泳道在26kda附近可见均一蛋白条带，与理论预测分子量相一致，蛋白纯度达到90％以上。

洗脱组分经过两次50mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液(ph8.0)透析去除咪唑。纯化蛋白分装后保存于-20℃冰箱待用，蛋白浓度通过bradford法测定。

实施例3：复苏促进因子对土壤样品中微生物的复苏促生长作用

(1)配制牛肉膏蛋白胨细菌培养基：牛肉膏3g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l，等体积分装于微量培养瓶(日本亚速旺,货号：2-867-01)，10ml/瓶，高温高压灭菌。

(2)土壤样品来源：采取自杭州市天子岭垃圾填埋场渗滤液均质池周围土壤样品。

(3)在超净工作台中，取100mg土壤样品置于灭菌1.5ml离心管中，添加1ml灭菌去离子水，充分振荡混匀，离心收集上清；取出纯化冻存的rpf蛋白置于冰浴融化后待用。

(4)mpn(mostprobablenumber)计数法培养：实验共分为两组(rpf处理组和rpf对照组)，每组三个平行实验。移取100μl土壤上清液接种于装有培养基的微量培养瓶中，记为10^-1，摇匀后在从10^-1瓶移取100μl混合液到下一个培养瓶中，记为10^-2，依次类推至10^-6瓶，最后逐个培养瓶中添加终浓度为5μg/ml重组rpf蛋白；另外一组同样操作添加等量高温失活的rpf蛋白作为对照。

(5)将微量培养瓶瓶盖拧紧后置于培养箱中，30℃振荡培养72小时，测定培养液的菌液密度(od600)值，根据测定结果绘制柱形图，结果如图4所示：通过对照组和rpf处理组培养瓶的菌密度对比，但稀释倍数为10^-1、10^-2和10^-3数量级时，两组培养瓶的菌密度接近；当稀释倍数达到10^-4、10^-5和10^-6数量级，rpf处理组的菌密度显著高于对照组，相比对照组菌液密度分别提高达18.6倍、5.6倍和12.2倍。rpf处理组中的10^-5和10^-6两个培养瓶中分别分离到两株细菌，经鉴为microbacteriumsp.和bacillussp.，而在对照组的10^-5和10^-6培养瓶中未分离到这两种细菌。这些结果说明这两种细菌在实验所选的环境样品中处于休眠状态，通过rpf复苏后，变为可培养状态，进而被分离得到，因此本专利所保护的重组rpf蛋白可用于环境样品中处于vbnc状态微生物资源的发掘、检测和分离。

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<110>浙江省环境保护科学设计研究院

<120>一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用

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