一种MZF1蛋白可结合DNA片段及在MZF1活性检测中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种mzf1蛋白可结合的dna片段及其在检测细胞内mzf1转录调控活性中的应用。

背景技术：

髓样锌指蛋白1(mzf1)是由人类19号染色体mzf1基因编码的一种具有锌指结构的蛋白，属于c2h2类锌指结构蛋白家族，在人类细胞中大量存在。mzf1蛋白全长734个氨基酸，大约82055da，与靶基因结合后，通过其特有的锌指结构与靶基因启动子区域dna相结合，在骨髓造血过程中发挥基因激活或抑制效应。

mzf1基因发生突变后，会引起某些调节紊乱，甚至疾病的发生。然而，目前检测细胞内源性mzf1活性仍然依靠westernblot或者qrcr等技术，虽然灵敏度高，但检测到的只是mzf1蛋白含量的差异，并不能直接体现其结合到靶序列后活性的改变。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内mzf1转录调控活性的方法。

技术实现要素：

发明人通过研究发现，mzf1蛋白结合的dna序列存在高度的保守性，其结合的dna核心序列为5'-agtgggga-3'或5’-cgggngagggggaa-3’(n表示a、t、c、g，如seqidno:1-4所示)。

基于以上研究，本发明提供了一种mzf1蛋白可结合的dna片段，其包含多个mzf1蛋白结合框，其中至少一个mzf1蛋白结合框的序列为5'-agtgggga-3'，其余的mzf1蛋白结合框的序列5’-cgggngagggggaa-3’(n表示a、t、c、g，如seqidno:1-4所示)。

优选地，当包含多个mzf1蛋白结合框时，每两个相邻的mzf1蛋白结合框之间具有间隔序列。

优选地，每两个相邻的mzf1蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为ta。

优选地，所述dna片段的序列如seqidno:5所示。在研究过程中，我们试验了多种组合，结果发现该序列的dna片段比其他组合方式对mzf1蛋白的结合效率更高。

本发明还提供了上述dna片段在检测细胞内mzf1转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内mzf1转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

s1：将包括上述dna片段以及连接于所述dna片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

s2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内mzf1转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为指示mzf1转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述dna片段以及连接在所述dna片段下游的荧光素酶i的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶ii的表达框，所示荧光素酶i与所述荧光素酶ii激发产生的荧光波长不同。将mzf1转录调控活性表示为荧光素酶i激发产生的荧光强度与荧光素酶ii激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述重组质粒通过将所述dna片段插入至质粒pgl3.0-basic的kpni与hindiii位点之间得到。

优选地，所述对照质粒为phrl-tk。

优选地，s1具体包括：

s11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

s12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

优选地，s2具体包括：

s21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

s22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶i和荧光素酶ii的活性；

s23：将荧光素酶ii活性归一化荧光素酶i活性得到值作为衡量mzf1转录调控活性的指标。

通过使用本发明的dna片段和方法，可直接针对性地检测细胞内mzf1的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析mzf1作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为kpni与hindiii对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有pgl3.0-basic和pgl3.0-basic-mzf1的人结肠癌细胞系sw480、人宫颈癌细胞系hela、人乳腺癌细胞系mcf7细胞中的相对mzf1活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pcdna3.1(+)空载体和pcdna3.1(+)-mzf1的人结肠癌细胞系sw480、人宫颈癌细胞系hela、人乳腺癌细胞系mcf7细胞中的相对mzf1活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建mzf1蛋白可结合的dna片段

发明人对mzf1进行研究分析，发现mzf1蛋白结合的dna序列为5'-agtgggga-3'，以及5'-cgggngagggggaa-3'(n表示a、t、c、g，如seqidno:1-4所示)，合成该dna核心序列时，本发明实施例在设计合成该dna核心序列时，将这两段dna核心序列分别重复两次，以ta碱基进行间隔，得到序列如seqidno:5所示的dna片段。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入kpni酶切位点的粘性末端(catgg)，在3’端加入hindiii酶切位点的粘性末端(ttcga)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如seqidno:6和7所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含kpni酶切位点粘性末端和hindiii酶切位点粘性末端的双链dna片段。50μl退火体系如下：annealingbufferfordnaoligos(5x)10μl、寡核苷酸链(50μm)各10μl，余下为ddh2o。

充分混匀后，设置pcr仪程序进行退火反应，形成dna双链。用dna寡核苷酸退火缓冲液(购自碧云天公司，货号为d0251)将合成的两条dna单链进行退火处理，促使其互补配对，形成5'端包含kpni酶切位点粘性末端和3'端包含hindiii酶切位点粘性末端的双链dna。具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让dnaoligo充分变性)；每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。dna退火产物用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定(由于dna片段较小，电泳鉴定无法看到单一、特异的条带)，测浓度后置冰上备用，也可以-20℃冻存备用。如果退火结束后打算进行酶切等其它反应，最好用纯化试剂盒进行纯化，或者确保退火产物在反应体系中体积不超过5％，以避免annealingbuffer对后续的酶连反应体系的干扰。

2.将mzf1蛋白可结合的dna片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶kpni和hindiii(购自takara公司，kpni货号为1618，hindiii货号为1615)对上述pgl3-basic空载体进行双酶切，20μl酶切体系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，kpni1μl，hindiii1μl，pgl3-basic空载体1μg，余下为ddh2o。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(dna胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为dp209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链dna连接至pgl3-basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：dna连接酶(购自takara公司，货号为6022)5μl，双链dna片段与经双酶切的pgl3.0-basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将dna片段与载体的摩尔比控制在10:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于pcr仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有mzf1蛋白结合的dna片段的pgl3-basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞dh5α置于冰上解冻2-3分钟，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟后42℃热激60秒，迅速放至冰上静置2分钟，然后加入450μl不含抗生素的无菌lb液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时，复苏条件为37℃，200转/分钟。取复苏后的菌液100μl均匀涂布于直径为3.5厘米含氨苄青霉素(重组质粒可耐受氨苄青霉素)的lb固体选择培养基中。吸收10分钟后，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。次日挑取单菌落至5-7ml含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，200转/分钟，摇菌繁殖12小时后提取质粒，1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶kpni和hindiii(购自takara公司，kpni货号为1618，hindiii货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道5为marker，泳道1-4显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认dna片段已整合至pgl3-basic载体上。至此，含有mzf1蛋白结合的dna片段的pgl3-basic表达载体(以下均表示为pgl3.0-basic-mzf1)构建成功。

3.pgl3-basic-mzf1转染细胞

本发明实施例采用人结肠癌细胞系sw480、人宫颈癌细胞系hela、人乳腺癌细胞系mcf7细胞进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为tf20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pgl3-basic空载体、pgl3.0-basic-mzf1、phrl-tk(带有海肾荧光素酶基因的载体)、pcdna3.1(+)-mzf1(mzf1过表达质粒，以下简称为pcdna3.1-mzf1)。

4.计算mzf1的活性

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算mzf1活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xpbs清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为gn201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性，将pgl3.0-basic-mzf1重组质粒转染至细胞中，检测mzf1报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，处理组(转染pgl3.0-basic-mzf1)荧光活性明显高于对照组(转染pgl3.0-basic空载体)。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测mzf1活性，将pcdna3.1(+)-mzf1转染至细胞，结果如图3所示，外源导入mzf1后，阳性处理组(转染pcdna3.1(+)-mzf1)荧光活性明显高于对照组(转染pcdna3.1(+)空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种mzf1蛋白可结合dna片段及在mzf1活性检测中的应用

<130>1

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgggagagggggaa14

<210>2

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgggtgagggggaa14

<210>3

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgggcgagggggaa14

<210>4

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgggggagggggaa14

<210>5

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

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<210>7

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<212>dna

<213>人工序列

<400>7

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