本发明属于生物技术领域，具体是一种催化木质纤维素糖化的纤维素酶制剂及其应用。
背景技术
木质纤维素是一类供应丰富且环境友好的可再生生物质，是唯一可大规模再生且全面替代化石能源的资源，大力发展木质纤维素原料在能源等领域的利用，是加快发展循环经济，保障国家能源安全和碳减排的一项重要战略任务。然而，木质纤维素转化的最大瓶颈莫过于纤维素结晶区难降解、导致酶解效率低，成本高。因此，要实现木质纤维素的高效利用，就必须首先实现该不溶性复杂底物的高效水解糖化。目前，木质纤维素糖化主要是通过依赖于真菌游离酶纤维素降解酶系的工艺来实现。这些工艺中酶的成本占木质纤维素生物转化过程总成本的50％左右，且经过几十年的努力仍不能有效降低其用酶成本。此外，木质纤维素的水解效率也是重要的限制因素。因此，需要转换思路，开发不同于游离纤维素酶系的新型酶制剂实现木质纤维素的高效利用。
已知纤维小体是热纤梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。纤维小体包括脚架蛋白等非催化单元以及具有不同催化活性的酶单元，并通过多级脚架蛋白和不同纤维小体酶类具有的多类型组装模块间特异性的非共价相互作用，将不同的功能组分组装成为分子量超过兆道尔顿的超分子多酶复合体。纤维小体组分和结构还具有时空调控特性，以适应木质纤维素的复杂成分，从而保证了其高效降解活力。此外，纤维小体还通过脚架蛋白或纤维素酶上所具有的纤维素结合模块和挂壁模块与底物及细胞组成三元复合体，纤维小体和细胞间的协同作用可以进一步提高了木质纤维素的糖化效率(专利文件ep2013355)。
尽管纤维小体及其生产菌株在木质纤维素糖化应用中具有巨大潜力，但目前纤维二糖对纤维小体酶的反馈抑制作用是阻碍其工业化应用的最大因素之一。前人主要通过向水解体系里额外添加β-1,4-葡萄糖苷酶水解纤维二来解除反馈抑制作用。如，专利文件wo/2013/137151通过向热纤梭菌的纤维素水解体系中添加来源于嗜热厌氧杆菌的游离β-1,4-葡萄糖苷酶提高葡萄糖产量；专利文件cn200910252180用生产β-1,4-葡萄糖苷酶的毕赤酵母与其他菌剂进行配伍实现β-1,4-葡萄糖苷酶的添加。此外，多年来，国内外研究者为了提高β-1,4-葡萄糖苷酶的产量、降低生产成本，开展了筛选新型的β-1,4-葡萄糖苷酶生产菌株(cn201180007605、cn20141007552、cn201310686413)、开发新型的β-1,4-葡萄糖苷酶生产(cn201410126924)及回收工艺(us9074200)，以及通过蛋白质工程手段对β-1,4-葡萄糖苷酶进行改造(cn201410603781、cn201310125106、cn201080061975)等工作。然而，由于添加的β-1,4-葡萄糖苷酶的活性及稳定性会随着糖化过程的进行而降低，因此，酶的消耗需要提高酶添加量或添加次数。β-1,4-葡萄糖苷酶作为游离酶添加到糖化体系中，会显著降低与体系中其他酶的协同作用，不可避免造成大于需求量的酶的额外添加，导致酶制剂成本的居高不下。不仅如此，这种依赖于外源添加游离酶的糖化策略，工艺复杂，对设备要求高，转化效率还不能满足工业化生产要求。因此，现阶段需要根据整合生物加工的糖化策略，开发新型的高效纤维素酶制剂，将纤维素酶和β-1,4-葡萄糖苷酶的生产与糖化过程进行整合，实现木质纤维素的“一锅法”原位糖化。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种催化木质纤维素糖化的纤维素酶制剂。
为实现上述目的，本发明所采用技术方案为：
一种纤维素酶制剂，酶制剂由单一产纤维小体微生物合成，其为β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体中的组分相互作用结合在纤维小体复合体中。
所述酶制剂为β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体中的组分通过特异性识别的方式使其结合在纤维小体复合体中；
或，β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体中的组分直接融合表达，使其结合在纤维小体复合体中。
所述直接融合表达为β-1,4-葡萄糖苷酶的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的n端、c端或结构域序列中间的基因组上。
具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，将β-1,4-葡萄糖苷酶的编码基因连接到产纤维小体细菌同源重组质粒(图2)中，并根据基因组序列设计同源臂。
2)将1)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选(图3)实现β-1,4-葡萄糖苷酶的编码基因插入到基因组上纤维小体组分蛋白的序列的n端或c端或结构域序列中间，从而构建重组菌株，实现β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体组分蛋白在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，β-1,4-葡萄糖苷酶利用与其融合表达的纤维小体组分蛋白的组装模块结合到纤维小体复合体中。
所述酶制剂中通过特异性识别的方式使其结合在纤维小体复合体中的方式为β-1,4-葡萄糖苷酶通过共价连接的相互作用方式与纤维小体中的组分交联，使其结合在纤维小体复合体中；
或，β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体中的组分通过组装模块间的非共价对接，使其结合在纤维小体复合体中。
所述酶制剂为β-1,4-葡萄糖苷酶和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与β-1,4-葡萄糖苷酶的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使β-1,4-葡萄糖苷酶结合在纤维小体复合体中。
所述与β-1,4-葡萄糖苷酶和纤维小体组分共价相互作用的多肽片段为seqidno:2中所示的碱基序列或seqidno:3中所示的氨基酸序列。
具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接β-1,4-葡萄糖苷酶与共价相互作用的多肽片段对中的一个片段(多肽片段i或ii，即seqidno:2或3)的编码基因；
2)根据1)，通过基因克隆的方法，连接纤维小体组分蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的另一个片段(多肽片段ii或i，即seqidno:3或2)的编码基因。
3)根据1)，将β-1,4-葡萄糖苷酶与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒(图1)；
4)根据2)，将纤维小体组分蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌同源重组质粒(图2)，并根据基因组序列设计同源臂。
5)将4)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选(图3)实现重组基因序列对基因组上原始纤维小体组分蛋白序列的替换，从而构建重组菌株，实现纤维小体组分蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
6)将3)中获得的质粒转化到5)中获得的重组菌株中，实现β-1,4-葡萄糖苷酶与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，基因组表达的纤维小体组分蛋白与质粒表达的β-1,4-葡萄糖苷酶通过所融合的多肽片段i及ii间的特异性共价相互作用实现共价交联，并组装在纤维小体复合体中。
所述酶制剂为β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维小体分别连接组装模块中各自呼应的模块，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将β-1,4-葡萄糖苷酶组装在纤维小体复合体中。
所述各自呼应的模块为粘连模块(cohesin)与对接模块(dockerin)。
所述对接模块为seqidno:4中所示的碱基序列，对接模块为seqidno:5中所示的氨基酸序列。
具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接β-1,4-葡萄糖苷酶与i型对接模块(seqidno:4)的编码基因，或
2)通过基因克隆的方法，连接β-1,4-葡萄糖苷酶与ii型粘连模块(seqidno:5)的编码基因
3)将1)或2)获得β-1,4-葡萄糖苷酶与组装模块的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒(图1)
4)将3)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，实现β-1,4-葡萄糖苷酶与i型对接模块或ii型粘连模块在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，质粒表达的β-1,4-葡萄糖苷酶通过所融合的i型对接模块或ii型粘连模块实现与纤维小体脚架蛋白进行特异性非共价相互作用，从而组装在纤维小体复合体中。
所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体，优选的是来源于热纤梭菌菌株dsm1313的纤维小体。
所述的纤维小体组分为脚架蛋白、纤维二糖水解酶或纤维素内切酶；
所述β-1,4-葡萄糖苷酶为具有纤维二糖水解活性的酶蛋白。
所述厌氧细菌为热纤梭菌(clostridiumthermocellum)，黄色溶纤梭菌(clostridiumclariflavum)，嗜纤维梭菌(clostridiumcellulovorans)，解纤维梭菌(clostridiumcellulolyticum)，解纤维醋弧菌(acetivibriocellulolyticus)，溶纤维假拟杆菌(pseudobacteroidescellulosolvens)，白色瘤胃球菌(ruminococcusalbus)，黄化瘤胃球菌(ruminococcusflavefaciens)；优选的是热纤梭菌菌株dsm1313。
所述纤维小体来源于热纤梭菌菌株dsm1313，β-1,4-葡萄糖苷酶具有序列表seqidno:1所示的氨基酸序列。
一种纤维素酶制剂的应用，所述纤维素酶制剂在水解纤维素底物中的应用。
所述的纤维素底物为预处理的木质纤维素底物或微晶纤维素。
一种纤维素酶制剂糖化纤维素的方法，将所述纤维素酶制剂加入至水解纤维素底物中水解，即可实现对底物的糖化；其中，水解实验在50-65℃(优选为55℃)条件下持续不少于24小时。
所述的纤维素底物为预处理的木质纤维素底物或微晶纤维素。
本发明所具有的优点：
与已有技术相比，本发明提供的纤维素酶制剂具有使用方便、成本低廉、可发酵糖产量高等特点和积极效果。本发明酶制剂基于纤维小体复合体开发，具有β-1,4-葡萄糖苷酶活性，该酶制剂由单一微生物合成，采用本发明酶制剂可以实现木质纤维素的“一锅法”糖化，整个糖化过程不需要改变发酵条件，更不需要额外添加酶，糖化过程简单，具有高可发酵糖得率，即采用本发明酶制剂获得的可发酵糖产量为90-500mm，糖化率不小于70％，这一指标基本满足可发酵糖作为碳源直接进行下游应用的需求，减少了糖液浓缩的成本。
附图说明
图1为本发明实施例提的产纤维小体细菌表达质粒phk示意图。
图2为本发明实施例提的产纤维小体细菌同源重组质粒phk-hr示意图。
图3为本发明实施例提的产纤维小体细菌中进行同源重组筛选的过程示意图。
图4为本发明实施例提的sds-page分析热纤梭菌重组菌株纤维小体，具有融合i型对接模块的β-1,4-葡萄糖苷酶。
图5为本发明实施例提的sds-page分析热纤梭菌重组菌株纤维小体，具有融合共价结合模块的纤维素酶。
图6为本发明实施例提的sds-page分析热纤梭菌重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci纤维小体，具有融合β-1,4-葡萄糖苷酶的纤维素酶cel48s图。
图7为本发明实施例提的热纤梭菌重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci纤维小体活力分析。
图8为本发明实施例提的热纤梭菌重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci全菌催化微晶纤维素糖化分析图。
图9为本发明实施例提的热纤梭菌重组菌株δpyrf::celk-cabgla-doci全菌催化微晶纤维素还原糖浓度分析图。
图10为本发明实施例提的热纤梭菌重组菌株δpyrf::phk-cabgla-doci和dsm1313::phk-ctbgla-cohii全菌催化微晶纤维素还原糖浓度分析图。
图11为本发明实施例提的pnp标准曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1β-1,4-葡萄糖苷酶的筛选
要有效的接触纤维二糖的反馈抑制，需要选择具有高活性、高稳定性和高葡萄糖耐受性的β-1,4-葡萄糖苷酶。
选择来自热解纤维素果汁杆菌属、嗜热厌氧杆菌属、梭菌属及宏基因组的β-1,4-葡萄糖苷酶按照常规方式将源自不同菌株的酶在大肠杆菌bl21(de3)中进行重组表达，并利用亲和层析的方法对蛋白进行纯化。将纯化的蛋白以pnpg为底物检测酶活，进行酶学性质分析和比较(参见表1)。
酶活检测的体系为200μl，其中包括50mm的醋酸钠和1mm的pnpg，添加酶起始催化反应，反应5-10分钟后加入1ml碳酸钠终止反应，并在405nm处检测可见光吸收，并根据以不同浓度的pnp(以0-1mm的pnp为标准品)建立的标准曲线，计算反应产生的png的浓度(参见图11)。
表1.选择不同β-1,4-葡萄糖苷酶并检测其酶学性质
注，酶活单位定义为每分钟产生1μmolpnp所需的蛋白的量。除最适温度和最适ph分析，酶活测定都在ph5.5及55℃条件下进行。从结果可见，在选择的酶中，来自热解纤维素果汁杆菌的β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla具有最高的酶活和热稳定性。
实施例2
构建热纤梭菌重组菌株表达具有ii型粘连模块的β-1,4-葡萄糖苷酶
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将β-1,4-葡萄糖苷酶ctbgla(表1，seqidno:6)与ii型粘连模块cohii的序列(seqidno:5)连接起来，其中cohii的序列连接至ctbgla序列的3’端。再利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk(图1)上。由于phk上带有来源于热纤梭菌的纤维素酶cel48s的启动子及信号肽序列(seqidno:9)，表达的目标基因可以外泌到细胞胞外。将构建好的质粒转化到热纤梭菌dsm1313中，从而获得表达具有ii型粘连模块的β-1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株dsm1313::phk-ctbgla-cohii。
构建热纤梭菌重组菌株表达具有i型对接模块的β-1,4-葡萄糖苷酶
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将β-1,4-葡萄糖苷酶ctbgla(表1，seqidno:6)或cabgla(表1，seqidno:1)分别与i型对接模块doci的序列(seqidno:4)连接起来，其中doci的序列连接至ctbgla或cabgla序列的3’端。再利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk(图1)上。然后，将构建好的质粒转化到pyrf敲除的热纤梭菌突变株δpyrf中(tripathi,s.a.,et.al.(2010)."developmentofpyrf-basedgeneticsystemfortargetedgenedeletioninclostridiumthermocellumandcreationofaptamutant."applenvironmicrobiol76(19):6591-6599.)，从而获得表达具有i型对接模块的β-1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株δpyrf::phk-ctbgla-doci和δpyrf::phk-cabgla-doci。
通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有i型对接模块的β-1,4-葡萄糖苷酶可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中，但表达量不高(图4)。
上述实施例中i型可由ii型模块进行相应的替换，实现其目的。
实施例3
热纤梭菌无疤遗传操作系统的构建
为实现热纤梭菌dsm1313基因组上dna序列的精确编辑建立了热纤梭菌无疤遗传操作系统，包括pyrf敲除的热纤梭菌突变株δpyrf作为系统的底盘细胞，以及一个同源重组质粒phk-hr(图2)。同源重组质粒包括两个筛选标记和三个同源臂。其中，筛选标记为双向筛选标记pyrf和反向筛选标记tdk；三个同源臂中包括前后两个长同源臂(hr-up,hr-down,约1200bp)，以及前后同源臂中间的短同源臂(hr-short,约300bp)，其中中间短同源臂与前同源臂的3’末端的序列相同，以保证第二次同源重组的发生。
无疤操作(同源重组)筛选步骤(图3)包括：
1)将同源重组质粒phk-hr(图2)转化进入底盘菌株δpyrf，利用含甲砜氯霉素的gs-2半固体培养基(kh2po41.5g/l,k2hpo4·3h2o3.8g/l,尿素2.1g/l,mgcl2·6h2o1.0g/l,cacl2·2h2o150mg/l,feso4·6h2o1.25mg/l,半胱氨酸盐酸1.0g/l,mops钠盐10g/l,酵母提取物6.0g/l,纤维二糖5.0g/l，二水柠檬酸三钠3.0g/l,刃天青0.1mg/l,ph7.4)平板进行筛选，以获得质粒转化子。
2)获得的转化子在mj液体培养基(kh2po41.5g/l,k2hpo4·3h2o3.8g/l,尿素2.1g/l,mgcl2·6h2o1.0g/l,cacl2·2h2o150mg/l,feso4·6h2o1.25mg/l,半胱氨酸盐酸1.0g/l,mops钠盐10g/l,纤维二糖5.0g/l，二水柠檬酸三钠3.0g/l,刃天青0.1mg/l,盐酸吡哆胺2mg/l,生物素0.2mg/l,对氨基苯甲酸0.4mg/l，维生素b120.2mg/l，ph7.4)中转接三代后，涂布含10μg/ml5-氟脱氧尿苷(fudr)的mj半固体培养基进行第一次同源重组筛选。在这一步骤中，由于tdk可以将fudr转化为对细胞有毒的f-dump，同时底盘细胞在mj培养基中必须依靠质粒上的pyrf基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。
3)经第一次同源重组后获得的重组子先在gs-2液体培养基中传代3次，并用相同的培养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/ml5-氟乳清酸(foa)的gs-2半固体培养基进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，pyrf的反向筛选作用会促使上游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrf表达框从基因组中去除。第二次同源重组后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除、敲入或者替换。
同时，热纤梭菌无疤遗传操作系统的构建方式可参见文献(张杰.典型产纤维小体梭菌遗传操作平台的建立[d].北京.中国科学院大学.2015.)中的详细介绍。
实施例4
1)构建热纤梭菌重组菌株表达具有共价结合模块的纤维素酶和β-1,4-葡萄糖苷酶
①共价相互作用的多肽片段：酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的纤维连接蛋白fbab含有一个自催化的结构域，该结构可以自我催化在lys和asp两个氨基酸之间形成共价键。实验表明，若将该结构域分拆为两部分多肽片段i(seqidno:2)和多肽片段ii(seqidno:3)，这两个拆分的部分仍然可以形成共价键(zakeri,b.,etal.(2012)."peptidetagformingarapidcovalentbondtoaprotein,throughengineeringabacterialadhesin."procnatlacadsciusa109(12):e690-697.)。
②选择热纤梭菌表达量最大的纤维小体酶cel48s(外切纤维素酶，seqidno:10)的酶催化结构域和对接模块doci之间作为靶向敲入位点。将多肽片段i或多肽片段ii两个片段的编码序列作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点分别克隆到同源重组质粒phk-hr(图2)中，分别构建获得同源重组质粒phk-hr-i或phk-hr-ii。两个质粒的同源臂核酸序列相同，依次为cels-up(seqidno:13)、cels-short(seqidno:14)、cels-down(seqidno:15)。其次，将构建好的质粒再分别转化到δpyrf中，并按照实施例3的方法中的通过三步筛选(图3)分别获得同源重组菌株δpyrf-i或δpyrf-ii，其中，多肽片段i或多肽片段ii的编码基因分别插入到基因组上cel48s的酶催化结构域和对接模块之间，表达融合表达蛋白cel48s-i或cel48s-ii，其氨基酸序列按照序列表中seqidno:11和seqidno:12。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的cel48s可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中(图5)。
③利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla(表1，seqidno:1)与多肽片段ii(seqidno:3)或多肽片段i(seqidno:2)连接起来，其中多肽片段ii或多肽片段i连接至cabgla序列的3’端。利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk(图1)上。然后，将构建好的质粒分别转化到上述步骤②获得的重组菌株δpyrf-i或δpyrf-ii中(其中，含有连接多肽片段i的β-1,4-葡萄糖苷酶的重组序列的表达质粒转化到重组菌株δpyrf-ii；含有连接多肽片段ii的β-1,4-葡萄糖苷酶的重组序列的表达质粒转化到重组菌株δpyrf-i，实现纤维素酶和β-1,4-葡萄糖苷酶能够通过多肽特异性结合)，从而获得表达具有共价结合模块的β-1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株δpyrf-ii::phk-cabgla-i和δpyrf-i::phk-cabgla-ii。
④通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的β-1,4-葡萄糖苷酶可以外泌到胞外，并与具有共价结合模块的cel48s相互作用，组装到纤维小体复合体中。
实施例5
热纤梭菌中β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维素酶cel48s的直接融合表达
选择热纤梭菌表达量最大的纤维小体酶cel48s(外切纤维素酶，seqidno:10)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla(seqidno:1)、ctbgla(seqidno:6)或cglt(seqidno:7)编码基因分别作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr(图2)中，分别构建获得同源重组质粒phk-hr-cabgla、phk-hr-ctbgla或phk-hr-cglt。三个质粒的同源臂核酸序列相同，依次为cels-up(seqidno:13)、cels-short(seqidno:14)、cels-down(seqidno:15)。其次，将构建好的质粒再分别转化到δpyrf中，并按照实施例3的方法中的通过三步筛选(图3)分别获得同源重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci，δpyrf::cels-ctbgla-doci和δpyrf::cels-cglt-doci。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的β-1,4-葡萄糖苷酶与cel48s的融合蛋白均可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中(图6)。
实施例6
热纤梭菌中β-1,4-葡萄糖苷酶与纤维素酶cel9k的直接融合表达
选择热纤梭菌纤维小体中的纤维素酶cel9k(外切纤维素酶，seqidno:16)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla(seqidno:1)编码基因作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr(图2)中，构建同源重组质粒phk-hr-cabgla。同源臂核酸序列分别为celk-up(seqidno:17)、celk-short(seqidno:18)、celk-down(seqidno:19)。其次，将构建好的质粒转化到δpyrf中，并按照实施例3的方法中记载的通过三步筛选(图3)获得同源重组菌株δpyrf::celk-cabgla-doci。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的β-1,4-葡萄糖苷酶与cel9k的融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。
实施例7
热纤梭菌中β-1,4-葡萄糖苷酶与脚架蛋白的直接融合表达
选择热纤梭菌的纤维小体二级脚架蛋白olpb(seqidno:20)的ii型粘连模块(cohii)和挂壁模块(slh)序列之间作为靶向敲入位点。将β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla(seqidno:1)、ctbgla(seqidno:6)或cglt(seqidno:7)编码基因分别作为目标序列,利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr(图2)中，构建同源重组质粒phk-hr-cabgla2、phk-hr-ctbgla2或phk-hr-cglt2。三个质粒的同源臂核酸序列相同，依次为olpb-up(seqidno:21)、olpb-short(seqidno:22)、olpb-down(seqidno:23)。其次，将构建好的质粒转化到δpyrf中，并按照实施例3的方法中记载的通过三步筛选(图3)分别获得同源重组菌株δpyrf::olpb-cabgla-slh，δpyrf::olpb-ctbgla-slh和δpyrf::olpb-cglt-slh。
通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的β-1,4-葡萄糖苷酶与olpb的融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。
实施例8
热纤梭菌中β-1,4-葡萄糖苷酶与脚架蛋白的融合表达
选择热纤梭菌的纤维小体二级脚架蛋白olpb(seqidno:20)的ii型粘连模块之后作为靶向敲入位点，通过同源重组，将β-1,4-葡萄糖苷酶序列替换除olpb蛋白3’端的挂壁模块(slh)序列。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla编码基因作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr(图2)中，构建同源重组质粒phk-hr-cabgla3。质粒的同源臂核酸序列依次为olpb-up(seqidno:21)、olpb-short(seqidno:22)、olpb-down2(seqidno:24)。其次，将phk-hr-cabgla3转化到δpyrf中，并按照实施例3的方法通过三步筛选(图3)获得同源重组菌株δpyrf::olpb-cabgla。
通过分析重组菌株的胞外蛋白发现，表达的β-1,4-葡萄糖苷酶与olpb的融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。
采用上述实施例获得菌株对不同纤维素底物进行水解糖化处理，其水解温度可在50-65℃，但为实现高产能最优的温度为55℃。
应用例1
热纤梭菌重组菌株纤维小体糖化微晶纤维素
提取实施例5中构建的重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci的纤维小体，以微晶纤维素为底物，检测其水解活力。水解实验在55℃条件下持续24小时，然后用dns法检测水解释放的还原糖，用hplc法检测还原糖中纤维二糖和葡萄糖的浓度。如图7所示，δpyrf::cels-cabgla-doci的纤维小体的活力是其底盘菌株δpyrf的1.6倍，且葡萄糖在还原糖中的比重高达78％，这一比重是底盘细胞的2.3倍。这说明β-1,4-葡萄糖苷酶cabgla的加入显著提高了纤维小体的活力。
应用例2
热纤梭菌重组菌株糖化微晶纤维素
以微晶纤维素为底物，利用实施例5中构建的重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci作为全菌催化剂，检测其纤维素降解活力。采用两段式糖化过程，第一阶段为细胞生长阶段，用5g/l的微晶纤维素为唯一碳源培养36小时，使细胞生长到平台期，并将底物基本消耗，然后添加100g/l的微晶纤维素作为碳源培养，进行第二阶段的糖化。采用了三种糖化条件：通氧，即在有氧条件下进行糖化；ph5.5，即在糖化起始时，将发酵液ph调低至5.5；加酶—即在糖化起始时添加过量的异源表达纯化的cabgla蛋白；并以未做条件改变的糖化方式作为未处理对照(图8)。然后用dns法检测水解释放的还原糖，用hplc法检测还原糖中纤维二糖和葡萄糖的浓度。结果显示，未处理对照的还原糖产量最高，δpyrf::cels-cabgla-doci在20天内产生394±34.7mm还原糖，其中包括381±13.3mm(68.6±2.4g/l)葡萄糖，而底盘细胞δpyrf只生产182±8.7mm还原糖，其中包括173±0.2mm(31.1±0.03g/l)葡萄糖。δpyrf加酶处理后产糖水平(359±48.5mm还原糖)及纤维素糖化效率与δpyrf::cels-cabgla-doci相当(图8)。δpyrf::cels-cabgla-doci加酶处理并没有显著提高产糖能力，说明cels与cabgla的融合表达已经充分解除了纤维二糖的反馈抑制作用，额外添加β-1,4-葡萄糖苷酶并不能产生明显作用。
此外，通过在细胞生长阶段提高菌体浓度，可以进一步提高糖化水平。通过将菌体浓度提高2.4倍，还原糖产量可以达到490±7.6mm，包括451±5.7mm(81.1±1.0g/l)葡萄糖和6.8±0.4mm(2.3±0.1g/l)纤维二糖，糖化率达到79.4％，即79.4％的初始添加的纤维素底物转化为可发酵还原糖。通过对发酵液中小分子化合物的检测发现，乙醇的浓度为261±10.3mm，说明约21％的初始碳源转化为乙醇。
应用例3
热纤梭菌重组菌株糖化微晶纤维素
以微晶纤维素为底物，利用实施例6中构建的重组菌株δpyrf::celk-cabgla-doci作为全菌催化剂，检测其纤维素降解活力。糖化过程同应用例2所述两段式条件。用dns法检测水解释放的还原糖。如图9所示，在糖化15天之后，δpyrf::celk-cabgla-doci可以生产384.5±37.1mm的还原糖，糖化能力远高于底盘细胞δpyrf，与δpyrf::cels-cabgla-doci水平相当。
应用例4
热纤梭菌重组菌株糖化微晶纤维素
以微晶纤维素为底物，利用实施例2中构建的重组菌株dsm1313::phk-ctbgla-cohii或重组菌株δpyrf::phk-cabgla-doci作为全菌催化剂，检测其纤维素降解活力。糖化过程同应用例2所述两段式条件。用dns法检测水解释放的还原糖。如图10所示，二者在糖化15-16天后，两个重组菌株的产糖量相似，都为160mm左右，且都与底盘细胞δpyrf的糖化能力相当，未表现明显优势。这一结果与实施例2中所述的β-1,4-葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量不高的结果相一致，这说明利用质粒作为载体的形式可能不利于β-1,4-葡萄糖苷酶在胞内的表达，而将β-1,4-葡萄糖苷酶的编码基因整合到基因组上表达的方式更适合。
应用例5
热纤梭菌重组菌株糖化预处理底物
以不同预处理木质纤维素生物质为底物，利用实施例5中构建的重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci作为全菌催化剂，检测其纤维素降解活力。糖化过程采用向培养基中直接添加100-520g的预处理木质纤维素作为底物，其中纤维素的添加量相当于12-100g/l，糖化进行10天后，用dns法检测水解释放的还原糖。如表2可见，在水解10天之后，根据底物种类以及添加量的不同，该全菌催化剂的还原糖产量在47.8-513.3mm之间，纤维素转化率在71.5-99.7％之间。当纤维素添加量为100g/l时，一般情况下可达92.4％，获得的糖液浓度基本达到工业发酵碳源水平。
表2.热纤梭菌重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci的糖化效率分析
上述表中预处理样品中，1、3、7、8为秸秆，2为酒糟，4、5为玉米皮，6、9为麦草。1、4、5、6、8、9采用专利文件cn201610133959中提出的水热与磺化联合预处理分离技术进行预处理，2、3、7采用文献(binli,etal.recentprogressonthepretreatmentandfractionationoflignocellulosesforbiorefineryatqibebt.journalofbioresourcesandbioproducts,2017,2(1),4-9)中的碱法技术进行预处理。当添加量为100g/l或200g/l时，预处理样品未经过干燥处理，当添加量为520g/l时，预处理样品提前进行了脱水处理。
应用例6
热纤梭菌重组菌株糖化预处理底物
以麦草或秸秆等预处理木质纤维素生物质为底物(采用专利文件cn201610133959中提出的预处理技术)，利用实施例7中构建的重组菌株δpyrf::olpb-cabgla-slh以及实施例8中构建的重组菌株δpyrf::olpb-cabgla作为全菌催化剂，检测各自的纤维素降解活力。糖化过程采用向培养基中直接添加100-200g的预处理木质纤维素作为底物，其中纤维素的添加量相当于16-38.4g/l，糖化反应进行10天后，用dns法检测水解释放的还原糖。如表3可见，根据底物种类以及添加量的不同，该全菌催化剂的纤维素转化率在63.3-94.9％之间，糖化水平与δpyrf::cels-cabgla-doci相当。
表3.热纤梭菌重组菌株δpyrf::olpb-cabgla-slh和δpyrf::olpb-cabgla的糖化效率分析
应用例7
热纤梭菌重组菌株发酵上清液糖化微晶纤维素
以15g/l的微晶纤维素为底物，利用实施例2中构建的重组菌株dsm1313::phk-ctbgla-cohii、实施例5中构建的重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci的发酵液上清作为催化剂，检测其纤维素降解活力。即，将重组菌株用5g/l的微晶纤维素为唯一碳源，以不添加纤维二糖的gs-2培养基进行培养36小时，使细胞生长到平台期，然后将发酵液进行离心，取上清液在55℃有氧条件下进行水解实验，反应时间为3天，然后用dns法检测水解释放的还原糖。结果显示，δpyrf::cels-cabgla-doci的发酵液上清3天内可以产生50.8±4.1mm的还原糖，其中葡萄糖占75.8％，糖化率为61％，与其应用例2中的通氧条件下的全菌催化水平相当。dsm1313::phk-ctbgla-cohii的发酵液上清3天内可以产生32.4±4.1mm的还原糖，其中葡萄糖占40.4％，糖化率为38.9％,。
上述结果可知，热纤梭菌发酵液上清液也可以作为酶制剂进行纤维素底物的糖化，但糖化率低于以全菌催化剂形式的酶制剂，主要原因包括有氧条件不利于糖化的进行。
应用例8
以15g/l的微晶纤维素为底物，分别培养实施例4中构建的重组菌株δpyrf-ii::phk-cabgla-i(多肽片段ii与cel48s融合表达，多肽片段i与cabgla融合表达)和δpyrf-i::phk-cabgla-ii(多肽片段i与cel48s融合表达多肽片段ii与cabgla融合表达)，以不添加纤维二糖的gs-2培养基培养36小时后使细胞生长到平台期，然后将发酵液进行离心和过滤，获得各自的发酵液上清液作为催化剂进行纤维素的糖化水解。水解实验在55℃有氧条件下持续3天。结果显示，3天内δpyrf-ii::phk-cabgla-i和δpyrf-i::phk-cabgla-ii分别可以产生32.7和33.4mm的还原糖，糖化率分别为39.2％和40.1％。这一糖化率远低于应用例7中δpyrf::cels-cabgla-doci发酵液上清液的糖化率，但与dsm1313::phk-ctbgla-cohii发酵液上清液的糖化率相当。
应用例9
热纤梭菌重组菌株发酵上清液糖化预处理底物
以50g/l预处理麦草为底物(采用文献binli,etal.recentprogressonthepretreatmentandfractionationoflignocellulosesforbiorefineryatqibebt.journalofbioresourcesandbioproducts,2017,2(1),4-9中的预处理技术)，利用实施例4中获得的重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci的发酵液上清为催化剂(参见应用例8中发酵液上清的制备)对进行水解反应，检测各自的纤维素降解活力，水解体系中纤维素的添加量相当于7.8-11.9g/l，水解实验在55℃有氧条件下持续3天，用dns法检测水解释放的还原糖。如表4可见，在水解3天之后，根据底物种类的不同，以该发酵液上清为催化剂产生的还原糖在9.4-20.5mm之间，纤维素转化率在21.0-31.2％之间。
上述结果可知，热纤梭菌发酵液上清液也可以作为酶制剂进行预处理木质纤维素底物的糖化，但糖化率低于以全菌催化剂形式的酶制剂，主要原因包括有氧条件不利于糖化的进行。
表4.热纤梭菌重组菌株δpyrf::cels-cabgla-doci的糖化效率分析
seqidno:1
cabgla
msfpkgflwgaatasyqiegawnedgkgesiwdrfthqkgnilyghngdiacdhyhrfeedvllmkelglkayrfsiawtrifpdgfgnvnqkglefydrlinklvengiepvitiyhwdlpqklqdiggwanseivnyyfdyamlvinrykdrvkywitfnepyciaflghwhgvhapgikdfkvaidvvhnimlshfkvvkavkennidvevgitlnltpvylqterlgykvseieremvnlssqldnelfldpvlkgnypqklfdylvqkdlleaqkalsmqqevkenfifpdflginyytravrlydensswifpirwehpageytemgwevfpqglfdllmwikenypqipiyitengaayndivtedgkvhdskrieylkqhfdqarkaiengvdlrgyfvwslmdnlewamgytkrfgiiyvdyetqkrikkdsfyfyqqyikens
seqidno:2
多肽片段i
ahivmvdaykptk
seqidno:3
多肽片段ii
sseqgqsgdmtieedsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvng
seqidno:4
doci
ygdvnddgkvnstdavalkryvlrsgisintdnadlnedgrvnstdlgilkryil
seqidno:5
cohii
ssielkfdrnkgevgdiligtvrinniknfagfqvnivydpkvlmavdpetgkeftsstfppgrtvlknnaygpiqiadndpekgilnfalaysyiagyketgvteesgiiakigfkilqkkstavkfqdtlsmpgailgtqlfdwdgevitgyeviqpd
seqidno:6
ctbgla
mskitfpkdfiwgsataayqiegaynedgkgesiwdrfshtpgniadghtgdvacdhyhryeedikimkeigiksyrfsiswprifpegtgklnqkgldfykrltnlllengimpaitlyhwdlpqklqdkggwknrdttdyfteysevifknlgdivpiwfthnepgvvsllghflgihapgikdlrtslevshnlllshgkavklfremnidaqigialnlsyhypasekaedieaaelsfslagrwyldpvlkgrypenalklykkkgielsfpeddlklisqpidfiafnnyssefikydpssesgfspansilekfektdmgwiiypeglydllmlldrdygkpnivisengaafkdeigsngkiedtkriqylkdyltqahraiqdgvnlkayylwslldnfewaygynkrfgivhvnfdtlerkikdsgywykeviknngf
seqidno:7
cglt
miklakfprdfvwgtatssyqiegavnedgrtpsiwdtfsktegktykghtgdvacdhyhrykedveilkeigvkayrfsiawprifpeegkynpkgmdfykklidelqkrdivpaatiyhwdlpqwaydkgggwlnresikwyveyatklfeelgdaiplwithnepwcssilsygigehapghknyrealiaahhillshgeavkafremnikgskigitlnltpaypasekeedklaaqyadgfanrwfldpifkgnypedmmelyskiigefdfikegdletisvpidflgvnyytrsivkydedsmlkaenvpgpgkrtemgweispeslydllkrldreytklpmyitengaafkdevtedgrvhdderieyikehlkaaakfigeggnlkgyfvwslmdnfewahgyskrfgivyvdyttqkrilkdsalwykevilddgied
seqidno:8
td2f2
magerfpadfvwgaataayqiegavredgrgvsiwdtfshtpgkiadgttgdvacdsyhrygedigllnalgmnayrfsiawprivplgagpinqagldhysrmvdallgaglqpfvtlyhwdlpqpledrlgwgsratatvfaeyadivvrqlgdrvthwatlnepwcsamlgyylgvhapghtdlkrgleashnlllghglavqamraaapqplqigivlnltptypasdspedvaaarrfdgfvnrwfldplagrgypqdmldyygaaapqanpedltqiaapldwlgvnyyermravdapdaslpqaqrlddpdlphtadrevypeglydillrlhndypfrplyitengcalhdeiaedggihdgqrqaffeahlaqlqralaagvplkgyfawslldnfewamglsmrygicytnfetlerrikdsgywlrdfiagqrg
seqidno:9
cel48s的启动子及信号肽序列
cccatcttttgtaggtgcctttgtaggacctgcgaatgcagttgtgggtatcattatggataccagcattgcaactgccaacagaatagaaatctttctgctttttaccattctctccatcttcccctttcaaatatacttttttattctttttaagttatatgatgaaataatgcaacctacccgcaataaattcattccccctttttgcggataaattttacgcattattttcatcataaaactaagctggacccaaaaaatacttgtgttaacataataaatttgtgttaacaaacttttttatcaaatcagccgcgcatttgacataaatttacatttttttgtcggaacgacgtataacaaaagaaactgccacgaagacaatactgaaaggtttaaaagacaattgcttttttgaacagagactattgcaaatactgaaatttgtagatgccagattattactacaataaatacatcttattatgggaatttaaacagaccggcgaagtcttacgtcaaatgcagctgaatcacgcaaaacaacttaacatattcagttttcaacgaccctaaaaggccaaaattaataacttaaattaatcaataaattccatatatatatcttcgaaaaaaatatactttttgagggggcaacaaagaaatctccaatttttaaatttcactatggaaacatttgaagttcttgtgcttttttcgaaagacagcagatatgcaaccccattatacgatattaatactacccccatttcaaaaataactgagtaaattattgctattttgttttgtatttttattataatacacatcaagtttgtatgcaagtcataaaatttatatttaaccaagtctgactttaatagtactacaaacatgaaataacggtgaacccggcctgccaaaaataaaaaagcctacggcgcagttaaaagccatagactaaaaatatcttgccaaagaatattaaaatattaaaacttcatttttcctcgttttgctcagcggggcattcgctcc
seqidno:10
cel48s
mermvksrkisillavamlvsimipttafagptkaptkdgtsykdlflelygkikdpkngyfspdegipyhsietliveapdyghvttseafsyyvwleamygnltgnwsgvetawkvmedwiipdsteqpgmssynpnspatyadeyedpsyypselkfdtvrvgsdpvhndlvsaygpnmylmhwlmdvdnwygfgtgtqatfintfqrgeqestwetiphpsieefkyggpngfldlftkdrsyarqwrytnapdaegraiqavywankwakeqgkgsavasvvskaakmgdflrndmfdkyfmkigaqdktpatgydsahylmawytswgggigaswawkigcshahfgyqnpfqgwvsatqsdfapkssngkrdwttsykrqlefyqwlqsaegaiaggatnswngryekypagtstfygmayvphpvyadpgsnqwfgfqawsmqrvmeyyletgdssvknlikkwvdwvmseiklyddgtfaipsdlewsgqpdtwtgtytgnpnlhvrvtsygtdlgvagslanalatyaaaterwegkldtkardmaaelvnrawynfycsegkgvvteearadykrffeqevyvpagwsgtmpngdkiqpgikfidirtkyrqdpyydivyqaylrgeapvlnyhrfwhevdlavamgvlatyfpdmtykvpgtpstklygdvnddgkvnstdavalkryvlrsgisintdnadlnedgrvnstdlgilkryilkeidtlpykn
seqidno:11
cel48s-i
mermvksrkisillavamlvsimipttafagptkaptkdgtsykdlflelygkikdpkngyfspdegipyhsietliveapdyghvttseafsyyvwleamygnltgnwsgvetawkvmedwiipdsteqpgmssynpnspatyadeyedpsyypselkfdtvrvgsdpvhndlvsaygpnmylmhwlmdvdnwygfgtgtqatfintfqrgeqestwetiphpsieefkyggpngfldlftkdrsyarqwrytnapdaegraiqavywankwakeqgkgsavasvvskaakmgdflrndmfdkyfmkigaqdktpatgydsahylmawytswgggigaswawkigcshahfgyqnpfqgwvsatqsdfapkssngkrdwttsykrqlefyqwlqsaegaiaggatnswngryekypagtstfygmayvphpvyadpgsnqwfgfqawsmqrvmeyyletgdssvknlikkwvdwvmseiklyddgtfaipsdlewsgqpdtwtgtytgnpnlhvrvtsygtdlgvagslanalatyaaaterwegkldtkardmaaelvnrawynfycsegkgvvteearadykrffeqevyvpagwsgtmpngdkiqpgikfidirtkyrqdpyydivyqaylrgeapvlnyhrfwhevdlavamgvlatyfpdgggggahivmvdaykptkgggmtykvpgtpstklygdvnddgkvnstdavalkryvlrsgisintdnadlnedgrvnstdlgilkryilkeidtlpykn
seqidno:12
cel48s-ii
mermvksrkisillavamlvsimipttafagptkaptkdgtsykdlflelygkikdpkngyfspdegipyhsietliveapdyghvttseafsyyvwleamygnltgnwsgvetawkvmedwiipdsteqpgmssynpnspatyadeyedpsyypselkfdtvrvgsdpvhndlvsaygpnmylmhwlmdvdnwygfgtgtqatfintfqrgeqestwetiphpsieefkyggpngfldlftkdrsyarqwrytnapdaegraiqavywankwakeqgkgsavasvvskaakmgdflrndmfdkyfmkigaqdktpatgydsahylmawytswgggigaswawkigcshahfgyqnpfqgwvsatqsdfapkssngkrdwttsykrqlefyqwlqsaegaiaggatnswngryekypagtstfygmayvphpvyadpgsnqwfgfqawsmqrvmeyyletgdssvknlikkwvdwvmseiklyddgtfaipsdlewsgqpdtwtgtytgnpnlhvrvtsygtdlgvagslanalatyaaaterwegkldtkardmaaelvnrawynfycsegkgvvteearadykrffeqevyvpagwsgtmpngdkiqpgikfidirtkyrqdpyydivyqaylrgeapvlnyhrfwhevdlavamgvlatyfpdgggggsseqgqsgdmtieedsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvnggggmtykvpgtpstklygdvnddgkvnstdavalkryvlrsgisintdnadlnedgrvnstdlgilkryilkeidtlpykn
seqidno:13
cels-up
atccgggaagtatgtagccaatacacccattgcaactgcaaggtcaacttcatgccagaagcggtgataattcaatacaggagcttcgcctctcaagtatgcctgatatactatatcgtagtaaggatcttgtctatattttgtacggatgtctatgaacttaataccaggctgaatcttgtcaccgttcggcatagtaccgctccaacctgccggaacgtatacttcctgctcaaagaaacgtttgtagtcagcacgtgcttcctcagtaacaacaccttttccttcagagcagtagaagttgtaccatgcacggttaaccagttcagcagccatgtctcttgcttttgtatcaagttttccttcccatctttctgtagctgcggcataagttgcaagagcatttgcaagtgaacctgcaacaccaaggtcagtaccgtaagaagttactcttacatggaggttcgggttgcctgtgtatgttccggtccatgtatcaggctgacctgaccactcgaggtcgctaggaattgcaaatgttccatcgtcatagagcttaatttcgctcattacccagtcgacccacttcttaatcaaattcttaactgatgaatctcctgtttcgaggtagtactccattacacgctgcattgaccatgcctggaatccgaaccactggttactacccgggtcagcgtatacaggatgcggaacatatgccataccatagaacgttgacgtaccagcaggatatttctcatatctaccgttccaggagttggttgctccaccggcaataccaccttcagccgactgcaaccactgatagaattcaagctgtctcttgtagcttgttgtccagtctctcttaccgttggatgatttaggagcaaagtcgctctgtgttgcacttacccatccctggaatgggttctgatatccgaagtgtgcgtggctgcatccgatcttccatgcccaggatgcaccaattccaccaccccatgcagtataccaggccataaggtagtgtgcactgtcataaccggtagcaggagtcttgtcctgtgcaccgatcttcatgaagtatttgtcgaacatgtcgtttctcaagaagtcacccatctttgcagccttggatacaacggaagcaacggcagaacctttaccctgctcctttg
seqidno:14
cels-short
atccgggaagtatgtagccaatacacccattgcaactgcaaggtcaacttcatgccagaagcggtgataattcaatacaggagcttcgcctctcaagtatgcctgatatactatatcgtagtaaggatcttgtctatattttgtacggatgtctatgaacttaataccaggctgaatcttgtcaccgttcggcatagtaccgctccaacctgccggaacgtatacttcctgctcaaagaaacgtttgtagtcagcacgtgcttcctcagtaacaacaccttttccttcagagcag
seqidno:15
cels-down
tgtacacattcgaatttgttacggaaaaacctctttttataagctctttaaagaggttgttttcaattatcatcttcttcagtgtaattgtgggttgtccgtgcaaatgcctggacaggacctttgacgcattttgaccggtaaatatggttgtctgccccgttgcactctggggcaggccgggcacgtcaagacaggcatccgtaggaattgcaccggctttattaagtatataatttatgtttgggagctccggattggccagaggattgaccgaagcatcctcctttccaataccaaaaccatctataaagatgaatatcattttcacggttggacaccaccctgtaaaaaagtaaaaagaagcgccctttacgcttccctgccatttaaccgacatcccatattttaaattcttgctctcgttgacttctcaagggtatttcgaacttcattcaactcagcttctctctttgccagctccaattgatagtaggtatttttgttgcttattacggcattttcattggcgagcctccggttttcctctttcagcctttctatctcttcctttgcacttttcaactccctgctgagacttgcaatctcctcctgagctttgaaatactcatcggcaacattaacggcggtaagcaccgatgccattgaggtgctaagcttattattcattctcatgatttcagtcatctttttgtctatatacagcgccaccttctgaatatactcttcggattcgcaaccaaccaacgtataatcttttcccgctatcctgacttccaccttgtttttctccgccataccatcagctcctttgcacattgcagaccatgcgactcttttttcaaaaaagaacacattattatttattatacaatatttcggcacaaaaatcattggtttttagcgaatataatagaaattatgcgaaaagccatggtatggctttagaaatgtaaaaaagaccggcacaagccggtcctttcaaatcagttttgaaattagttcttgtacggcaatgtatctatttctttgagaatatatctcttcaaaattcctaagtcagttgaattaactctgccgtcttcattcaaatcggcattgtcagtgttgatgcttatacctgatctcaaaacatatctcttcaatgctacagcgtcagttgagttaacttttccgtcatcattgacgtcgccgtataatttagtagaaggagtaccaggtactttatatgtcat
seqidno:16
cel9k
mnfrrmlcaaivltivlsimlpstvfaledkspklpdykndllyertfdeglcfpwhtcedsggkcdfavvdvpgepgnkafrltvidkgqnkwsvqmrhrgitleqghtytvrftiwsdkscrvyakigqmgepyteywnnnwnpfnltpgqkltveqnftmnyptddtceftfhlggelaagtpyyvylddvslydprfvkpveyvlpqpdvrvnqvgylpfakkyatvvssstsplkwqllnsanqvvlegntipkgldkdsqdyvhwidfsnfktegkgyyfklptvnsdtnyshpfdisadiyskmkfdalaffyhkrsgipiempyaggeqwtrpaghigvapnkgdtnvptwpqddeyagrpqkyytkdvtggwydagdhgkyvvnggiavwtlmnmyerakirgianqgaykdggmnipernngypdildearweieffmkmqvteredasiagmvhhkihdfrwtalgmlphedpqerylrpvstaatlnfaatlaqsarlwkdydptfaaqclekaeiawkaalknpdiyaeytpgsggpgggpynddyvgdefywaacelyvttgkdeyknylmnsphylempakmgenggangedsglwgcftwgttqglgtitlalvenglpsadiqkarnniakaadkwlenieeqgyrlpikqaederggypwgsnsfilnqmivmgyaydftgnskyldgmqdgmsyllgrngldqsyvtgygerplqnphdrfwtpqtskkfpapppgiiaggpnsrfedptitaavkkdtppqkcyidhtdswstneitinwnapfawvtayldeidlitppggvdpeepeviygdcngdgkvnstdavalkryilrsgisintdnadvnadgrvnstdlailkryilkeidvlphk
seqidno:17
celk-up
tctagacattggcattcttctatcacaagagaagcggtattcctattgaaatgccgtatgcaggaggagaacagtggaccagacctgcaggacatattggtgttgctccgaacaaaggagacacaaatgttcctacatggcctcaggatgatgaatatgcaggaagacctcaaaaatattatacaaaagatgtaaccggtggatggtatgatgccggtgaccacggtaaatatgttgtaaacggcggtatagctgtttggacattgatgaacatgtatgaaagggcaaaaatcagaggcatagctaatcaaggtgcttataaagacggtggaatgaacataccggagagaaataacggttatccggacattcttgatgaagcaagatgggaaattgagttctttatgaagatgcaggttactgaaagagaggatgcttccatagccggaatggtacatcacaagattcacgacttcagatggactgctttgggtatgttgcctcacgaagacccgcaggagcgttacttaagaccggtaagtacggctgcaactttgaactttgcagcaaccttggcacagagcgcgcgtctctggaaggattatgatccgacttttgcggctcaatgtttggaaaaagctgaaatagcatggaaggcagcactgaagaatcctgatatttatgctgagtatactcccggtagcggtggtcccggaggcggaccatacaatgacgactatgtcggagacgagttctactgggcagcctgcgaactttatgtaacaacaggaaaagacgaatataagaattacctgatgaattcacctcactatcttgaaatgcctgcaaagatgggtgaaaacggtggagcaaacggagaagacagtggattgtggggatgcttcacctggggaactactcaaggattgggaactattactcttgcattagttgaaaacggattgccgtctgcagacattcaaaaggcaagaaacaatatagctaaagctgcagacaaatggcttgagaatattgaagagcaaggttacagactgccgatcaaacaggcggaggatgagagaggcggttatccatggggttcaaactccttcattttgaaccagatgatagttatgggatacgcatatgactttacaggcaacagcaagtatcttgacggaatgcaggatggtatgagctacctgttgggaagaaacggactggatcagtcctatgtaacagggtatggtgagcgtccacttcagaatcctcatgacagattctggacgccacagacaagtaagaaattccctgctccacctccgggtataattgccggtggtccgaactcccgtttcgaagacccgacaataactgcagcagttaagaaggatacaccgccgcagaagtgctacattgaccatacagactcatggtcaaccaacgagataactattaactggaatgctccgtttgcatgggttacagcttatctcgatgaaattgacttaataacaccgccaggaggagga
seqidno:18
celk-short
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<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120>一种纤维素酶制剂及其应用
<130>
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<213>热纤梭菌重组菌株
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