本发明涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用。
背景技术：
二氢叶酸是指生物的四氢叶酸生物合成的中间体，其本身不具辅酶活性，二氢叶酸还原酶为叶酸合成过程的催化酶，在辅助因子nadph的存在下，催化二氢叶酸还原为具有辅酶活性的四氢叶酸。四氢叶酸是传递一碳单位的辅酶，是嘌呤或者嘧啶核苷酸合成所必须的辅酶。因此，二氢叶酸还原酶活性被抑制后，会直接影响生物体的核苷酸生物合成，目前二氢叶酸还原酶抑制剂被广泛用于杀虫、抑菌、治疗肿瘤等。因此，大量体外合成的二氢叶酸还原酶被需求用于进行二氢叶酸还原酶抑制剂的研究，具有很高的实验价值和医学价值。然而，传统化学合成酶的制备方法会导致制备的蛋白酶产品中残留有机溶剂和表面活性剂，制备的蛋白酶产品的生物活性低，不仅给制备高活性和高纯度的蛋白酶带来困难，而且难以达到实验和应用的要求。因此，现有的二氢叶酸还原酶的制备方法还有待进一步发展。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明提供了一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用，以解决传统化学合成酶制备方法得到的蛋白酶活性低，残留有机溶剂和表面活性剂的问题。一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：a.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌r6基因组，以所述基因组为模板，采用引物p1和p2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为seqidno:1所示的核苷酸序列，所述引物p1的序列为seqidno:2所示的核苷酸序列，所述引物p2的序列为seqidno:3所示的核苷酸序列；b.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到peasytm-t1simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到trans1-t1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；c.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行ndei和xhoi双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pet-28a上，得到重组表达载体pet-28a-dhfr，将重组表达载体pet-28a-dhfr转化到大肠杆菌bl(de3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；d.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加iptg，诱导重组表达菌株表达重组二氢叶酸还原酶。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤a中，基因扩增的反应条件为：94℃预变性5min后，进行30个扩增反应循环，每个反应中条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤d具体包括以下步骤：挑取重组表达菌株至含有30μgml-1的卡那霉素的培养液中，37℃，200rpm过夜培养后，将过夜培养的菌液用液体培养基稀释100倍后培养至od值为0.5-0.8时，向培养液中加入0.5-1miptg，16-28℃条件下诱导5-16h，4℃条件下对培养液进行离心，收集菌体沉淀，用重悬缓冲液对菌体沉淀进行重悬后进行超声破碎，对悬液进行离心并收集上清液。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述d步骤中，当所述od值为0.6时，向培养液中加入0.5mmiptg，16℃条件下诱导15h。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，在步骤d之后，进行以下的步骤e的操作：e.重组二氢叶酸还原酶的纯化：对上清液进行镍离子亲和层析，先后采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，得到纯化的重组二氢叶酸还原酶。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述重悬缓冲液为由20mmtris-hcl、500mmnacl、5-15mm咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，15-25mm咪唑组成的水溶液，洗脱缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，450-550mm咪唑组成的水溶液。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述重悬缓冲液为由20mmtris-hcl、500mmnacl、10mm咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液由20mmtris-hcl，500mmnacl，20mm咪唑组成的水溶液，所述洗脱缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，500mm咪唑组成的水溶液。一种高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株，其中，所述重组表达菌株采用如上所述的制备方法得到。如上所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶在磺胺增效剂类药物多残留检测方法中的应用。本发明提供的技术方案中，具有如下有益效果：1、本发明选用peasytm-t1simple克隆质粒作为基因克隆载体，不仅连接效率高，并且操作简单，成功率高，还缩短了二氢叶酸还原酶基因的克隆阶段的时间。2、本发明选用pet-28a表达载体用于构建重组表达菌株，不仅保证重组表达菌株的基础表达水平低的前提下，最高程度的胞内表达二氢叶酸还原酶蛋白，并且表达出的二氢叶酸还原酶蛋白经过正确修饰和折叠，获得高活性的蛋白酶。3、本发明采用的重组表达菌株的表达最佳条件为：向培养液中加入0.5mmiptg，16℃条件下诱导15h。上述条件下诱导表达的重组二氢叶酸还原酶不仅表达量高，并且保持高活性，应用价值高，为后期重组二氢叶酸还原酶的大规模生产奠定了基础。4、重组表达菌株表达出的重组二氢叶酸还原酶上携带上6×his-tag标记，本发明采用的镍离子亲和层析柱通过吸附重组二氢叶酸还原酶的6×his-tag标记，从而实现对重组二氢叶酸还原酶的特异结合，去除表达产物中的非目的蛋白，上述纯化方法操作简单、纯化特异性高，洗脱下来的重组二氢叶酸还原酶的活性不受影响；纯化过程中采用的洗涤缓冲液(20mmtris-hcl，500mmnacl，15-25mm)和洗脱缓冲液(20mmtris-hcl，500mmnacl，450-550mm咪唑)保证最大程度的洗脱去除表达产物中的非目的蛋白，随后能最大程度的洗脱下层析柱上吸附的重组二氢叶酸还原酶，提高重组二氢叶酸还原酶纯度和产量。5、本发明提供的制备方法简单，制备出的重组表达菌株性状稳定，繁殖和表达周期短，能稳定的高表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。6、本发明提供的制备方法制得的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶，不仅产量高，并且纯度高，产物中不存在有机溶剂和表面活性剂，所述重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶活性高，对磺胺增效剂的识别敏感度高、结合能力强，可作为高效抗原应用于动物源食品中残留磺胺增效剂的多残留定量分析，分析灵敏度高，鉴定结果准确，适合于大规模生产和应用。附图说明图1为重组克隆菌株的pcr鉴定结果；其中，泳道m为dnamarker，泳道1-7为挑取的生长良好的单菌落。图2为重组克隆菌株的质粒酶切鉴定结果；其中，泳道m为dnamarker，泳道1-4为重组克隆质粒经过ndei和xhoi双酶切后形成的片段。图3为重组表达菌株的pcr鉴定结果；其中，泳道m为dnamarker，泳道1-4为挑取的生长良好的单菌落。图4为重组表达菌株的质粒酶切鉴定结果；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为重组表达质粒经过ndei和xhoi双酶切后形成的结果，泳道2为重组表达质粒经过ndei单酶切的酶切结果，泳道3为重组表达质粒经过xhoi单酶切的酶切结果。图5为重组二氢叶酸还原酶的sds-page电泳检测结果；其中，诱导温度28℃，iptg浓度为1mm，泳道m为蛋白marker，泳道1～8分别依次为诱导3～10h时重组二氢叶酸还原酶的表达量。图6为重组二氢叶酸还原酶的sds-page电泳检测结果；其中，诱导温度28℃，iptg浓度为0.5mm，泳道m为蛋白彩虹marker，泳道1～8分别依次为诱导3～10h时重组二氢叶酸还原酶的表达量。图7为重组二氢叶酸还原酶的sds-page电泳检测结果；其中，诱导温度16℃，iptg浓度为1mm,泳道m为蛋白彩虹marker，泳道1～8分别依次为诱导8～16h时重组二氢叶酸还原酶的表达量。图8为重组二氢叶酸还原酶的sds-page电泳检测结果；其中，诱导温度16℃，iptg浓度为0.5mm，泳道m为蛋白彩虹marker，泳道1～8分别依次为诱导8～16h时重组二氢叶酸还原酶的表达量。图9为纯化的重组二氢叶酸还原酶的western-blotting检测结果。泳道m为蛋白彩虹marker，泳道1-2为重组二氢叶酸还原酶。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：实施例11、目的基因的扩增(1)首先提取肺炎链球菌r6基因组，设计并合成用于扩增二氢叶酸还原酶基因(即dhfr基因)的引物p1(seqidno:2)和p2(seqidno:3)：上游引物p1：5’-cgccatatgatgactaagaaaatcgtagctat-3ndei酶切下游引物p2：5’-ccgctcgagttagacttcctttctcttgcg-3xhoi酶切其中，上游引物p1的5’端添加ndei酶切位点(catatg)和保护碱基cgc，下游引物的5’端添加xhoi酶切位点(ctcgag)和保护碱基ccg。上述设计的引物p1和p2与扩增位点结合的特异性高，自身不易产生发卡等影响扩增的二级结构，扩增出的目的基因纯度高，扩增产物中杂带少。上述两个酶切位点的选择便于后续的氢叶酸还原酶基因的克隆和表达实验中的多次酶切，在不破坏氢叶酸还原酶基因的前提下，酶切效率高，且酶切特异性高，避免了错误酶切。●以肺炎链球菌r6基因组为模板，采用引物p1和p2进行基因扩增，扩增体系采用2×mix(takara公司，规格：48reactions(l×48tubes))的扩增反应液(包括taq酶、反应缓冲液、dntps)，20ul的扩增体系如下：p10.5μlp20.5μl基因组1μl2×mix10μl双蒸水8ul基因扩增的反应条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸7min。上述条件下引物与模板的结合特异性高，目的基因扩增产量高，非特异性扩增少，也便于后续的二氢叶酸还原酶基因的回收。将上述扩增产物通过基因胶回收试剂盒进行回收，得到长度为525bp的二氢叶酸还原酶基因(seqidno:1)，序列如下：上述基因序列分别在5’和3’端添加了限制性酶切位点ndei、xhoi和相应的保护碱基。2、重组克隆菌株的构建将上述回收后的二氢叶酸还原酶基因连接到peasytm-t1simple克隆质粒上，并将连接产物转化到trans1-t1感受态细胞中。连接反应体系为：peasytm-t1simplecloningvector1μl回收基因1μlddh2o3μl反应条件：16℃，过夜连接。挑取单菌落，分别采用用菌液pcr和双酶切方法初步鉴定出阳性重组克隆菌株，选取阳性重组克隆菌株送去青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行基因测序，测序结果完全正确，证明重组克隆菌株构建成功。菌液pcr鉴定结果见图1，双酶切鉴定结果见图2。其中，所述双酶切鉴定方法中选用的两种限制性内切酶为ndei和xhoi。鉴定结构为阳性。上述基因连接和转化的具体方法和步骤具体参见peasytm-t1simple克隆试剂盒说明书。上述实验采用的peasytm-t1simplecloningvector的连接效率高，使用简单，基因序列上的限制性内切酶酶切位点较少，便于在目的基因(如本发明的dhfr基因)两端设计酶切位点。3、重组表达菌株的构建将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行ndei和xhoi双酶切，将得到带酶切位点的二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pet28a上，16℃条件下过夜连接，得到重组表达载体pet28a-dhfr，将重组表达载体pet28a-dhfr转化到大肠杆菌bl(de3)中，37℃进行培养。挑取单菌落用pcr方法(结果见图3)和双酶切方法分别进行鉴定(结果见图4)，将鉴定得到的阳性菌株进行测序鉴定，测序正确的阳性菌株即高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株。其中，上述连接体系为：4、重组二氢叶酸还原酶的诱导表达挑取重组表达菌株至含有30μgml-1的卡那霉素的培养液中，37℃，200rpm过夜后，将1ml过夜培养的菌液接种于100ml含卡那霉素30μgml-1的液体培养基中，培养至od值为0.5-0.8时，向培养液中加入0.5-1mmiptg(异丙基硫代半乳糖苷)，分别在28℃诱导3h～10h(蛋白电泳结果见图5和图6)和16℃诱导8h～16h(蛋白电泳结果见图7和图8)，4℃条件下对菌液进行离心，收集菌体沉淀。通过蛋白电泳结果可知，重组二氢叶酸还原酶都得到了大量表达。接着，用重悬缓冲液对菌体沉淀进行重悬。所述重悬缓冲液为由20mmtris-hcl、500mmnacl、5-15mm咪唑组成的水溶液。对重悬液进行超声破碎，对悬液进行离心并收集上清液。所述超声破碎的条件为：4℃，200w功率，冰浴超声，超声3s，停2s。直至悬液边澄清。上述超声破碎条件下，菌体的破碎充分，并且不破坏重组二氢叶酸还原酶的酶活。将获得的上清液进行sds-page电泳检测和活性检测，发现：20kd附近出现明显条带，与dhfr重组蛋白20kd大小相符，说明dhfr重组蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。优选地，所述od值为0.6时，向培养液中加入0.5mmiptg，16℃条件下诱导15h。上述诱导条件下，重组二氢叶酸还原酶表达量大，且活性最高。5、重组二氢叶酸还原酶的纯化对含有重组二氢叶酸还原酶的上清液进行镍离子亲和层析，先后采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱；采用的洗涤缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，15-25mm咪唑组成的水溶液，洗脱缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，450-550mm咪唑组成的水溶液。对纯化后的目的蛋白进行western-blotting检测，实验结果见图9，检测显示为阳性，证明目的蛋白为重组二氢叶酸还原酶。优选地，所述重悬缓冲液为由20mmtris-hcl、500mmnacl、10mm咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液由20mmtris-hcl，500mmnacl，20mm咪唑组成的水溶液，所述洗脱缓冲液为由20mmtris-hcl，500mmnacl，500mm咪唑组成的水溶液。上述条件保证最大程度的去除表达产物中的非目的蛋白，随后能最大程度的洗脱下层析柱上吸附的重组二氢叶酸还原酶，提高重组二氢叶酸还原酶纯度和产量。用nanodrop2000分光光度计对纯化产物进行检测，得到：上述条件下得到纯化的重组二氢叶酸还原酶的蛋白浓度为120ug/ml。本发明还提供一种高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株，所述重组表达菌株采用如上所述的制备方法得到。上述菌株繁殖快，培养和发酵周期短，生产成本低，适合大规模生产重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。实施例2本发明还提供一种如上所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶在检测磺胺增效剂类药物多残留方法中的应用。磺胺增效剂类是一类2，4-二氨基嘧啶类化合物，包含多个结构类似的药物，具有杀菌和杀虫功效，是当前畜牧养殖业应用最为广泛的兽药之一，但是，在动物源性食品中的磺胺增效剂类残留会危害消费者健康。传统的农药多残留检测方法主要是通过各种萃取方法，如超临界流体萃取、固相萃取和微波辅助萃取等物理方法对农药进行分离和化学鉴定，但是传统检测方法不仅步骤繁琐，样品需求量大，并且农药的鉴定不够准确。而基于抗原抗体特异结合的生物免疫鉴定技术对兽药种类的鉴定精细，检测敏感度高，对样品需求量小，但是目前还没有识别食品中残余磺胺增效剂类的有效特异抗原。二氢叶酸还原酶可作为抗原特异结合磺胺增效剂类兽药，但是采用传统化学合成方法制备成的二氢叶酸还原酶中由于残留难以除净的有机溶剂和表面活性剂，制备的二氢叶酸还原酶成品的生物活性低，与磺胺增效剂类兽药的特异结合力弱，不适合作为鉴定食品残留磺胺增效剂类兽药的抗原。而本发明上述采用大肠杆菌表达体系和亲和层析纯化方法制备得到的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶，不仅产量高，并且纯度高，产物中没有有机溶剂和表面活性剂，二氢叶酸还原酶活性高；并且经过大量实验发现，肺炎链球菌是对磺胺增效剂高度敏感的细菌，其体内表达的二氢叶酸还原酶对磺胺增效剂的识别敏感度高、结合能力强，因此，本发明制备的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶可作为高效抗原应用于磺胺增效剂的多残留定量分析，灵敏度高，鉴定结果准确，并且易于大规模生产。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。序列表<110>青岛农业大学<120>一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>525<212>dna<213>重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶基因(geneofdihydrofolatereductaseinstreptococcuspneumoniae)<400>1cgccatatgatgactaagaaaatcgtagctatttgggcccaggatgaagagggtttgatt60ggtaaggaaaatcgtctgccttggcatttgccagcagaattgcagcactttaaagaaaca120actctgaatcatgctatcttgatggggcgtgtgacctttgatgggatggggcgtcgcttg180cttccaaaacgggaaaccctgattttgacgcgtaatccggaagaaaagatagatggggtt240gctacttttcaggacgtccagtctgttcttgactggtatcaggatcaagaaaagaatctc300tacattatcggtgggaagcaaatttttcaggcttttgaaccttaccttgatgaagtgatt360gtcactcacattcatgctcgggtggaaggagatacctatttccctgaagagcttgacttg420tctctttttgagacagtttcaagcaaattttacgccaaagatgagaagaatccttatgat480tttaccatccaataccgcaagagaaaggaagtctaactcgagcgg525<210>2<211>32<212>dna<213>人工合成序列(syntheticsequence)<400>2cgccatatgatgactaagaaaatcgtagctat32<210>3<211>30<212>dna<213>人工合成序列(syntheticsequence)<400>3ccgctcgagttagacttcctttctcttgcg30当前第1页12