本发明属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域，特别涉及一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法。
背景技术：
藻蓝蛋白也称藻蓝素，是从螺旋藻中分离出的一种深蓝色粉末。藻蓝蛋白分为c-藻蓝素和r-藻蓝素，前者主要存在于蓝藻中，后者则主要存在于红藻中，而隐藻中两者都有。藻蓝蛋白既是一种良好的食用色素，又因其氨基酸种类齐全、必需氨基酸含量高等优势成为优质的保健食品，同时在试验中常作为荧光剂应用在实验中。
目前纯化蛋白质的方法主要有盐析沉淀、电泳、离子交换和吸附等集中，但存在成本较高、操作繁琐、难以扩大化处理等缺陷。传统的液液萃取是由有机溶剂和水组成，蛋白质在有机溶剂中引起变性或生物活性丧失，不适合于蛋白质的萃取分离；双水相萃取是近年来出现的应用前途较广的一种新型的萃取分离方法。cn105820236a、cn102993297a、cn104672325a、cn106008705a、cn105820238a、cn105820237a、cn104479009a、cn104387468a和cn104387469a均采用聚合物/盐双水相体系萃取螺旋藻藻蓝蛋白；cn103880950a公开了一种离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法，离子液体作为一种新型绿色溶剂和功能介质材料，其具有较低蒸气压、无挥发性、溶解性较强、化学稳定性好等特点，成为传统有机溶剂的替代品；但其合成复杂、成本较高，且咪唑和吡啶类离子液体本身存在难降解和有毒害的缺陷；而低共熔溶剂的出现，不仅较好的继承离子液体的优良特性，且克服了其弊端，具有合成简单、成本低、安全、生物相容性等特点，是一种具备了绿色化学理念的新型溶剂。低共熔溶剂/盐双水相萃取体系，是将一定量低共熔溶剂和盐溶液相互混合，达到一定浓度后，低共熔溶剂和盐聚集在两相中。若条件选择恰当，目标产物集中于一相，杂质集中于另一相，可达到分离纯化目的。然而目前关于利用低共熔溶剂双水相萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究尚未见报道。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，该方法采用可回收的低共熔溶剂作为提取溶剂，经济环保；低共熔溶剂与盐组成双水相体系进行分离纯化，能够显著提高藻蓝蛋白的得率和纯度。该技术为从天然产物中提取活性成分提供了新的研究思路。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向螺旋藻粉末中加入低共熔溶剂，经超声波处理后离心，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入磷酸盐和去离子水，混匀得到双水相体系，调ph并混匀，静置使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，静置使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥，得到藻蓝蛋白。
低共熔溶剂是指由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物，其凝固点显著低于各个组分纯物质的熔点，理化性质与离子液体非常相似，但又比离子液体廉价、容易制备且无毒性。低共熔溶剂合成过程中原子利用率达100％，无需纯化就可得到高纯度的产品，合成原料来源丰富、价格低廉，且具有蒸汽压低、无毒性、可生物降解性、溶解性良好等特点，是一种真正的绿色溶剂。
进一步地，所述低共熔溶剂由摩尔比为1:1～5的季铵盐和氢键供体组成，所述季铵盐为氯化胆碱、甜菜碱、四甲基氯化铵、四甲基溴化铵中的至少一种；所述氢键供体为葡萄糖、甘油、山梨糖醇、乙二醇、尿素、甲脲中的至少一种。
进一步地，所述步骤s1中，所述螺旋藻粉末与低共熔溶剂的质量比为1:50～70。
进一步地，超声处理的条件为75～150w、5～10分钟，离心的条件为4000～6000r/min、3～5分钟。
利用上述超声条件进行处理，可显著提高提取效率、降低提取时间；如果超声处理的功率过大或时间过长，会破坏螺旋藻中藻蓝蛋白分子的结构，影响得率；如果超声处理的功率过小或时间过短，则会导致提取不彻底，同样会影响得率。
进一步地，所述步骤s2中，所述双水相体系中磷酸盐的质量分数为25～40％，粗提液的质量分数为20～30％，去离子水的质量份数为30～55％。
严格控制双水相体系中磷酸盐和低共熔溶剂的质量分数，可有效提高螺旋藻中藻蓝蛋白的得率；如果磷酸盐含量过高或低共熔溶剂含量过低，会出现盐析现象，影响藻蓝蛋白的纯度和得率；如果磷酸盐含量过低或低共熔溶剂含量过高，则会出现不分相的现象，同样会影响藻蓝蛋白的纯度和得率。
进一步地，所述步骤s2中，所述磷酸盐为k2hpo4。
进一步地，所述步骤s2中，分相条件为室温、10～15min。
进一步地，所述步骤s2中，将所述双水相体系的ph值调节为6～8。
进一步地，所述步骤s3中，分相条件为室温、5～10min。
本发明的有益效果如下：本发明提供的一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，与传统方法相比，具有以下优势：
(1)低共熔溶剂具有无毒性、生物降解性、生物相容性好和熔点低等优点；合成的原料来源广泛，低成本，原子利用率为100％；
(2)该方法结合了低共熔溶剂和双水相的优点，是一种更为绿色的双水相萃取方法；
(3)应用该方法提取藻蓝蛋白的得率和纯度均较高，得率可达到178.9～189.8mg/g，显著优于现有技术，同时纯度也可达到3.81～3.90的较高水平；
(4)该方法操作简便、节约时间、条件温和，适合工业化大规模生产。
具体实施方式
实施例1
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:1的四甲基氯化铵和尿素制成的低共熔溶剂55g，经100w超声波处理5min后，在5000r/min条件下离心5min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为35％，粗提液的质量分数为25％，混匀得到双水相体系，调节ph为6.0并混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置5min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
实施例2
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1.5g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:2的甜菜碱和甘油制成的低共熔溶剂90g，经75w超声波处理10min后，在4000r/min条件下离心5min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为38％，粗提液的质量分数为27％，混匀得到双水相体系，调节ph为6.0并混匀，室温下静置12min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置6min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
实施例3
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:1:2的氯化胆碱、葡萄糖以及乙二醇制成的低共熔溶剂70g，经125w超声波处理8min后，在6000r/min条件下离心3min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为25％，粗提液的质量分数为25％，混匀得到双水相体系，调节ph为7.0并混匀，室温下静置15min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
实施例4
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1.5g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:2:2的四甲基溴化铵、山梨糖醇以及甲脲制成的低共熔溶剂75g，经150w超声波处理8min后，在5000r/min条件下离心3min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为40％，粗提液的质量分数为20％，混匀得到双水相体系，调节ph为8.0并混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置8min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
对照例1
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1.5g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:2:2的四甲基溴化铵、山梨糖醇以及甲脲制成的低共熔溶剂75g，经150w超声波处理8min后，在5000r/min条件下离心3min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为40％，粗提液的质量分数为20％，混匀得到双水相体系，调节ph为8.0并混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s3：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
对照例2
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:1的四甲基氯化铵和尿素制成的低共熔溶剂55g，经200w超声波处理5min后，在5000r/min条件下离心5min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为20％，粗提液的质量分数为40％，混匀得到双水相体系，调节ph为6.0并混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置5min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
对照例3
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1.5g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:2的甜菜碱和甘油制成的低共熔溶剂90g，经50w超声波处理10min后，在4000r/min条件下离心5min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为45％，粗提液的质量分数为15％，混匀得到双水相体系，调节ph为6.0并混匀，室温下静置12min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置6min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
对照例4
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:1:2的氯化胆碱、葡萄糖以及乙二醇制成的低共熔溶剂70g，经150w超声波处理15min后，在6000r/min条件下离心3min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为45％，粗提液的质量分数为25％，混匀得到双水相体系，调节ph为7.0并混匀，室温下静置15min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
对照例5
一种低共熔溶剂-盐双水相萃取螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
s1：超声波辅助低共熔溶剂提取：向1.5g螺旋藻粉末中加入由摩尔比为1:2:2的四甲基溴化铵、山梨糖醇以及甲脲制成的低共熔溶剂75g，经75w超声波处理3min后，在5000r/min条件下离心3min，得到含藻蓝蛋白的粗提液；
s2：低共熔溶剂-盐双水相萃取：向步骤s1得到的粗提液中加入k2hpo4和去离子水，使k2hpo4的质量分数为40％，粗提液的质量分数为20％，混匀得到双水相体系，调节ph为8.0并混匀，室温下静置10min使之分层，得到上相和下相；
s3：二次双水相萃取：取步骤s2分离得到的上相，加入与步骤s2中等量的磷酸盐和去离子水，充分混匀，室温下静置8min使之分层，得到上相和下相；
s4：回收低共熔溶剂和藻蓝蛋白：取步骤s3分离得到的上相，蒸发水分得到低共熔溶剂；取步骤s3分离得到的下相，经透析除盐、冷冻干燥。
实验例1
提取效果对比实验
以实施例1～4的方法作为实验组1～4，以对照例1～5的方法作为对照组1～5，分别采用上述方法对螺旋藻中的藻蓝蛋白进行提取，并对各组藻蓝蛋白的得率和纯度进行比较。藻蓝蛋白的得率和纯度的计算方法如下：
藻蓝蛋白得率(mg/g)＝回收的藻蓝蛋白粉末质量(mg)/螺旋藻样品质量(g)；
藻蓝蛋白纯度＝a620/a280。
结果如表1所示，在各组处理中，对照组1中藻蓝蛋白的得率最高、但纯度最低，表明二次双水相萃取的操作对藻蓝蛋白的纯度会产生明显影响，省略这一步骤时藻蓝蛋白的得率提高，是由于纯度降低、杂质较多所致。同时，实验组各组藻蓝蛋白的得率和纯度均明显高于对照组2～5各组，表明当方法中的各项参数低于或超过实验组中各项参数的范围时，会对藻蓝蛋白的得率和纯度产生明显影响，即实验组的提取方法是最优化的提取方法。
表1各组藻蓝蛋白的得率和纯度
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。