一种前列腺癌危险度和治疗效果评估的血清和组织分子指标的制作方法

本发明属于肿瘤诊断和治疗效果评估的技术领域，具体涉及用一种血清和组织中的分子指标pfn1蛋白(profilin1)中的表位肽制作特异抗体，然后利用这种抗体检测血清中pfn1的含量，从而评估前列腺癌危险分级和治疗效果。

背景技术：

在世界范围内，前列腺癌发生率是在男性肿瘤中排名第二，2012年就新增病例110万，在中国，前列腺癌是排名第二的男性恶性肿瘤。而且在过去的二十多年，致死率增加了10倍。如何及早发现前列腺癌，并对前列腺癌的治疗效果进行有效的评估是目前急需解决的问题。但目前的前列腺癌的危险分级是根据患者血清psa、gleason评分和临床分期将前列腺癌分为低、中、高危三类，这种分级方法涉及三种指标，其中的gleason评分和临床分期指标是根据肿瘤的形状和边界等多种形态来诊断，较难把握。更重要的目前还没有关于前列腺癌治疗效果评估的统一指标。

技术实现要素：

本发明目的是提供一个血清分子指标可以方便且精确地诊断前列腺癌的危险程度并可以用来评估前列腺癌的治疗效果。

技术方案：

(1)本研究首先通过itraq检测前列腺癌不同危险分期和治疗不同阶段的血清蛋白组表达变化，发现pfn1，在不同危险分期的前列腺癌中表达有重要差异(p＜0.001)，而且在重离子治疗的不同阶段，肿瘤症状好转(基于肿瘤体积大小和病理指标)的过程中，该分子指标的含量具有明显的不同(p＜0.001)(表1和附图1)。

表1四种片断在不同危险分期的前列腺癌治疗过程中的表达谱

(2)通过差异蛋白富集分析发现该分子通过肌动蛋白骨架调节网络(整合素信号通路的细胞膜内部分)影响重离子治疗的效果(附图2)。

(3)通过生物信息学和结构生物学的方法及b细胞表位分析方法，获得四种肽表位序列(seqno.3、no.4、no5、no6)，通过混合酸酐法人工合成所需的肽，免疫动物产生抗pfn1蛋白表位的高亲和性抗体。根据该抗体制作的诊断试剂，可以诊断前列腺癌的危险程度和治疗疗效(附图3)。

本发明提供的血清分子指标pfn1基因序列和氨基酸序列分别为seqno.1和seqno.2。

本发明提供的抗原表位肽是seqno.3、seqno.4、seqno5、seqno6(序列附件)，发现这四种肽能引起强烈免疫反应，产生特异性抗体，可用于检测pfn1的含量和存在。

本发明提供的是基于这四种表位肽序列及其所制备的特异性抗体生产诊断前列腺癌危险程度和治疗疗效的检测试剂盒，该试剂盒能分辨低危，中危和高危前列腺癌病人(p＜0.05)以及前列腺癌治疗效果(治疗前和治疗好转的具有明显的差异，p＜0.05)

附图说明

图1是四种蛋白片断在不同危险分级前列腺癌病例中治疗前中后的表达比较图。

图2是在kegg肌动蛋白骨架调节网络中差异表达基因(粉红色)图。试验方法是itraq蛋白组表达测序。

图3是通过四种表位肽制作的多克隆抗体监测重离子治疗前列腺癌疗效图。

具体实施方式

1.对外周血进行取样。抽血后2小时内马上进行处理。

2.室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)取上清液

3.按1∶1-1∶500在150μl小试管中梯度稀释待测

4.在96或48孔板上分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中测样品50μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；标准孔为分别加入一定浓度的各目标靶蛋白和表位肽(序列为seqidno.2、no.3、no.4、no5、no6)；

5.温育，配液，洗涤和加酶：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；将30倍(48t的20倍)浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

6.显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；(k)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

7.以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

8.前列腺癌诊断指标：以正常为对照，如果样本浓度为正常的1.2-2倍，为低危病人；2-3倍，为中危病人；3倍以上即为高危病人。治疗效果评估：中危和高危病人，如果治疗后，样本浓度回归2倍以下，即为治疗好转。如回归正常水平，即基本恢复。

序列表

seqno.1基因核苷酸序列，

cccgcagggtccacacgggtcgggccgggcgcgctcccgtgcagccggctccggccccgaccgccccatgcactcccggccccggcgcaggcgcaggcgcgggcacacgcgccgccgcccgccggtccttcccttcggcggaggtgggggaaggaggagtcatcccgtttaaccctgggctccccgaactctccttaatttgctaaatttgcagcttgctaatt

技术特征：

技术总结
本发明属于肿瘤诊断和治疗疗效和复发判断的分子指标技术领域，具体为应用血清中与肿瘤密切相关的PFN1蛋白的表位肽制作特异抗体来特异检测前列腺癌危险程度和治疗疗效的诊断试剂。本发明首先用iTRAQ大量检测前列腺癌治疗前后的血清蛋白地含量变化，发现PFN1蛋白与前列腺癌的危险分级和治疗疗效密切相关。然后筛选和人工合成PFN1中的功能表位肽，并以这些肽作为抗原免疫动物制作相应抗体，得到的抗体可以较灵敏地检测低危，中危和高危的前列腺癌病人，并对前列腺癌的疗效及复发有较好地评估作用；该分子标志物可用来作为检测标准对照和制备抗体用于生产相应肿瘤诊断和研究试剂盒。

技术研发人员：朱嗣博;朱乃硕;谢君
受保护的技术使用者：朱嗣博;朱乃硕;谢君
技术研发日：2017.03.31
技术公布日：2017.07.11