一种检测猫疱疹病毒的方法与流程

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测猫疱疹病毒的方法，即通过筛选获得的寡核苷酸引物，通过sybrgreeni荧光定量pcr方法检测猫疱疹病毒。

背景技术：

猫疱疹病毒(fhv，猫鼻气管炎)，该病毒主要侵害仔猫，能致发猫鼻气管炎病，感染猫症状严重时，出现体温升高，明显的上呼吸道感染，病毒在病猫的鼻、咽喉、气管和支气管以及舌、结膜等的部位增殖。该病最早从美国发现，随后在加拿大、英国、荷兰、瑞士、匈牙利、越南等地发现和流行，我国已多次发现可疑病例，并分离到病毒。但目前在实验动物国家标准及地方标准中，均没有对实验用猫的检测要求及相关规定。

对于猫疱疹病毒病的诊断可根据本病的流行病学特点、临诊表现及典型病理变化做出初步诊断，若要进一步确诊需要进行实验室诊断。猫疱疹病毒病的实验室诊断方法主要包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。然而在病原学诊断方面，由于分离培养工作量相对较大，且病毒自身对外界环境的抵抗力较低，因此分离的成功率并不是非常高。分离培养之后的最为快捷、简便的病毒电镜鉴定也仅仅能够观察到病毒的病态结构，无法完成同科病毒的区别；常用的血清学诊断方法主要有琼脂扩散试验、spa协同凝集试验等，此类试验只能粗略进行抗体的测定，而且灵敏度也不高。这就需要我国进一步加快研究步伐，加快推进猫疱疹病毒早期准确诊断的研究进程，努力开创猫疱疹病毒诊断的崭新局面。

技术实现要素：

本发明提供一种检测猫疱疹病毒的方法，即通过筛选获得的寡核苷酸引物，通过sybrgreeni荧光定量pcr方法检测猫疱疹病毒。

本发明首先提供一种用于检测猫疱疹病毒的引物对，其上下游引物的序列分别为seqidno:1和seqidno:2，其具体序列信息如下：

上游引物：acgctacaattatactcaagccagaa(seqidno:1)

下游引物：tcagctgttatcttcggatcca(seqidno:2)

本发明的引物可以用来制备检测猫疱疹病毒的生物制品，例如试剂盒；

本发明的引物对用于非疾病诊断和治疗目的的猫疱疹病毒的检测，其一种具体步骤如下：

1)提取待检测的样品的核酸备用；

2)使用上述的引物，进行sybrgreeni荧光定量pcr检测，其中反应体系由以下组分组成：

pcr反应条件：95℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃终延伸7min；

3)标准曲线的建立：

以猫疱疹病毒基因组为模板，使用上述的上游引物和下游引物进行扩增，将获得的目的片段克隆到pmd18-t载体，制备标准品，以标准品为模板进行荧光定量pcr的扩增，建立标准曲线；

4)按照步骤3)的扩增条件对待检测样品进行pcr扩增，确定是否存在猫疱疹病毒。

本发明筛选的引物既能保证鉴定病原的正确，又不能漏检同种不同株病原。另外，本发明的扩增片段长度适宜，既能在电泳中相互分开，又不太离散，避免多重pcr中优先扩增小片段后阻碍长片段扩增的情形，同时引物二聚体等非特异性扩增产物很少。另外，通过荧光定量反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的fhv的荧光定量pcr检测方法。经最终实验证实，本发明的荧光定量pcr方法由于引物设计和反应体系的选取，敏感性较高，且成本低廉，能够快速实现对fhv的特异性和敏感性检测。

附图说明

图1：fhv基因片段的pcr扩增图；

图2：重组质粒的pcr鉴定图；

图3：标准品的扩增曲线图；

图4：标准曲线图；

图5：标准品的溶解曲线图。

具体实施方式

本发明在建立特异、敏感、快速、定量准确的fhvsybrgreeni荧光定量pcr检测方法，通过分子生物学手段，开展对猫携带fhv核酸的检测。双链dna特异荧光染料sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr法，可以和一切双链dna特异性结合，可以选择各种dna模板，价格便宜，不需要对探针进行设计。对今后开展实验用猫的检测工作及实验猫标准化研究具有积极的促进作用，同时通过对fhv携带情况的检测，为猫质量控制标准的制定提供参考依据。

本发明所使用的毒株和临床样本信息如下：

猫疱疹病毒(fhv)购自美国attcc公司；猫细小病毒(fpv)、单纯疱疹病毒ⅰ型(hsv-1)、犬疱疹病毒(chv)、猪伪狂犬病毒(prv)由中国食品药品检定研究院实验动物质量检测室提供。

主要试剂和仪器信息如下：

sybrpremixextaq、taq聚合酶、dntps、pmd18-t载体、胶回收试剂盒等购自takara宝生物工程(大连)有限公司；凝胶回收试剂盒和质粒大量提取试剂盒均购于omega公司；depc购自sigma公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

超净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司、dl-cj-2fn)；荧光定量pcr仪lightⅱ(roche)；42℃可调恒温水浴锅(北京市长风仪器公司、hw.sy21-k)；高速离心机(长沙市湘仪离心机有限公司、h2050r-1)；电子天平(上海海康电子仪器厂、yb202n)；dyy-ⅲ-7型电泳仪(北京六一仪器厂)；紫外凝胶成像系统(美国genegeniusuvp型)；uv2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：引物的设计和筛选

通过dnastar软件中的meglign比对genbank中登录的fhv-1c-27株基因(序列fj478159)，利用primerpremier5.0软件，pcr引物和taqman探针序列，使用荧光基团作为探针的发光基团，以对应的荧光定量pcr仪的不同波长段用于检测。设计并合成一对fhv的特异性引物p1/p2。对所设计的引物进行以下分析：引物间的干扰，发卡结构和二聚体。并通过ncbi的blast功能对其特异性进行初步鉴定。经筛选，排除了引物自身及引物之间存在互补序列、扩增产物的单链能形成二级结构的引物，选留如下表1所示的引物及探针序列。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用depc水稀释到10pmol/μl，-20℃保存备用。

表1：特异性引物p1/p2

2.2临床样本处理

以棉花棒抹取咽喉、眼睛、鼻分泌物或溃疡伤口获取样品，加适量灭菌的pbs稀释后，充分反复冻融3次，5000rpm离心20min，取上清(病毒悬液)，-70℃保存备用。

2.3dna提取

采用takara公司的dnaisoreagent试剂提取样品中dna。主要步骤：

1.样品处理，若是含有液体采样管，则直接进行下一步；若无液体，需加1ml的pbs缓冲液，振荡混匀，进行下一步；

2.取上清500μl，再加500μl裂解液dnaisoreagent于1.5ml离心管中，颠倒混匀6～8次，静置10min；

3.离心10000g，10min；

4.取上清800μl，加到另一干净的1.5ml离心管中，再加入300μl无水乙醇，颠倒混匀5～6次，离心4000g，2min；

5.倒上清，留沉淀，加75％酒精1ml，颠倒混匀5～8次，离心12000g，5min；

6.倒上清，用吸水纸吸干，晾5min；

7.加ddh2o，20μl，加的过程中边转边吹打，获得dna并保存(-20℃)。

2.4标准阳性质控品的制备

2.4.1目的基因片pcr扩增

以fhv-1c-27基因组为模板、p1和p2为引物，应用常规pcr方法对fhv-1c-27株基因(序列fj478159)进行扩增。pcr扩增的反应体系及条件如下：

pcr反应体系

pcr反应条件

2.4.2目的片段胶回收

将扩增后的基因片段pcr产物经2％琼脂糖eb凝胶电泳分离后进行切取，操作步骤参照omega公司胶回收试剂盒的说明，如下：

在紫外凝胶成像仪下，切取片段置于灭菌的1.5mleppendorf管中，加入bindingbuffer，置于60℃水浴10min，使凝胶完全融化，将融化后的液体转移到吸附柱中，并把吸附柱放于2ml离心管中，12000×g离心1min；弃滤液，将吸附柱再放回离心管中，再加入300μlbindingbuffer到吸附柱中，12000×g离心1min；弃滤液，将吸附柱重新套回离心管中，加入700μlspwwashbuffer(使用前严格的按照要求加入无水乙醇并混匀)，12000×g离心1min；重复上步，弃滤液，将吸附柱重新套回离心管中，12000×g离心2min；最后把柱子置于1.5ml离心管内，并加入35μlelutionbuffer，12000×g离心1min。洗脱纯化的dna产物，-70℃冻存备用

2.4.3纯化产物与t载体连接

分别将上述胶回收纯化的产物与载体pmd18-t连接，放置于连接仪中，16℃过夜。连接体系如下：

solutionⅰ5μl

pmd18-t载体1μl

胶回收纯化的产物4μl

2.4.4连接产物的转化

⑴从-70℃冰箱中取出感受态细胞jm109，置37℃水浴中，细胞一经融化，立即把离心管转移到冰浴中，放置10min。

⑵用一预冷的无菌吸头，把感受态细胞转移到预冷的无菌微离心，管中，置冰浴中。

⑶将重组dna加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次，混匀内容物，在冰上放置30min。

⑷将管放到42℃的水浴内，热激90s，不要摇动。

⑸迅速将管转移到冰浴中，冷却1～2min。

⑹每管加200μl的lb培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min，以最大限度地提高转化率，复苏期间应温和地摇动细胞(转速≤225r/min)。

⑺将转化的感受态细胞转移到amp平板上，涂匀，每样60μl。

⑻将平板置于37℃温箱中，直至液体充分吸收后，倒置平皿培养16～18h。

⑼用灭菌牙签挑取可疑菌落接种于含amp(100μg/ml)液体lb培养基的试管中培养过夜。提取质粒进行酶切鉴定。取部分菌液加入终浓度30％的甘油保存菌种。

质粒的小量提取用minipreps小量质粒纯化试剂盒提取质粒具体操作按使用说明书进行。将提取纯化质粒用于荧光测序。测序由联合基因科技有限公司完成。

2.4.5pcr鉴定

在无菌条件下分别取200μl的菌液于1.5mlep管中，在沸水中水浴5min后冰浴2min，5000rpm离心5min。取上清作为模板，反应体系和条件如下：

pcr反应体系

pcr反应条件

将pcr鉴定为阳性的克隆送北京华大基因研究中心有限公司测序，测序为阳性的重组质粒进行保存，备用。

2.4.6质粒的大量提取纯化对测序鉴定为阳性克隆的重组质粒进行质粒的大量制备，按maxipreps试剂盒说明书进行大量质粒纯化。

2.5实时荧光定量pcr标准曲线的建立

2.5.1荧光定量pcr反应体系的优化

荧光定量pcr反应体系的优化主要针对引物的最佳浓度进行优化，荧光定量pcr反应体系为20μl，引物浓度分别按终浓度为0.8μm(引物各加1.6μl)、0.4μm(引物各加0.8μl)和0.2μm(引物各加0.4μl)的剂量进行优化。

2.5.2荧光定量pcr反应程序的优化

在荧光定量pcr反应中，根据premixextaqtmⅱ(perfectrealtime)试剂盒说明书中提供的仪器反应参数对荧光定量pcr反应程序进行优化，调整退火温度及退火时间，确定最佳反应条件。其中退火温度在58℃～62℃范围内进行优化，退火时间在20s～30s范围内进行优化。

2.5.3标准曲线的构建

将标准品质粒按10倍梯度稀释，得到1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴个拷贝/μl系列标准模板，采用优化后的反应体系和程序进行荧光定量pcr反应，得到相应的cq值，其中cq值作为纵坐标，把起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。

2.6fhv-1荧光定量pcr检测方法的建立

标准品稀释成倍数为10¹⁰～10⁴作为模板并设置3个平行重复，用荧光定量pcr仪器进行sybrgreenⅰ荧光pcr扩增。反应体系为20μl，2×sybrpremixextaq为10.0μl，上下游引物各为0.4μl(10μm)，ddh2o为7.2μl，混合均匀。反应程序为stage1:预变形95℃30s，1个循环；stage2：pcr反应95℃5s、60℃30s，40个循环；stage3：溶解曲线的分析95℃0、65℃15s、95℃0s。反应结束后处理获得的数据，并得到相应样品和标准品的数据，同时荧光定量pcr结束后，pcr产物与溴酚蓝缓冲液按比例混匀，用2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用生物电泳图像分析仪器进行拍照分析。

以空白对照不出现阳性为准来调节扩增曲线的基线，通常取3～15个循环的荧光信号平均值作为基线的调整。纵坐标是以基线可扩增曲线交点的循环次数cq值，横坐标是dna浓度的对数值，制作标准曲线。荧光定量pcr检测以cq值>31判定为阴性，其中cq值<31且扩增曲线良好可直接判定为阳性；cq值在30～31之间的需重复试验，两次试验均能得到良好的s型扩增曲线，可判定为阳性。

2.6特异性试验

选取部分重要的猫病毒性传染病病原，主要为dna病毒，包括fpv、hsv-1、chv、prv4种猫病病毒作为荧光定量pcr特异性试验的检测毒株，已鉴定的fhv-1做阳性对照，同时设定空白对照，特异性试验平行做3次重复。

2.7敏感性试验

将fhv作10^-1～10^-12倍稀释，震荡混合均匀后，将稀释好的病毒液接种到已铺满单层lmh细胞的96孔板中(每个稀释度做8个平行重复)，于37℃、co2细胞培养箱中吸附2h，弃掉含吸附液后，每孔加100μldmem细胞培养液(2％血清)，于37℃、co2细胞培养箱中继续培养5d。同时每天观察细胞病变且记录。按reedmuench方法计算病毒tcid50，结果为10⁸tcid50/ml。

取感染滴度为10⁸tcid50/mlfhv-1病毒液，用pbs做10倍梯度稀释，稀释范围为10^-1～10^-12。以上述样品的基因组作为模板，按照优化后的反应体系和反应条件进行荧光定量pcr反应，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。同理对上述样品进行常规pcr检测，并与荧光定量pcr敏感性进行比较。对反应产物进行电泳分析后与荧光定量pcr产物凝胶电泳结果进行比较，分析两种检测方法在敏感性上的差异。

2.8稳定性和重复性试验

组内重复性试验中对稀释的标准品浓度为10¹⁰拷贝/μl～10⁴拷贝/μl的基因组作为模板进行3个平行重复，在相同反应体系和反应条件下完成荧光定量pcr的检测。组间重复性试验将3次梯度稀释浓度为10¹⁰拷贝/μl～10⁴拷贝/μl的标准品的基因组作为模板在相同反应体系和反应条件下进行3次荧光定量pcr检测。分别计算出cq值的变异系数cv％来验证检测体系的重复性和稳定性。

3结果与分析

目的片段pcr扩增

fhvc-27株基因(序列fj478159)经pcr扩增得到的产物，经2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察，以dl2000maker为标准，在约200bp处出现一特异性条带，与预期大小206bp符合，初步判定为fhvc-27株基因片段，结果见图1。

重组质粒的鉴定

fhvc-27株基因片段克隆至pmd18-t载体，构建重组质粒，经pcr鉴定，在约200bp处分别出现一特异性条带，与预期片段大小206bp(如图2)。经测序鉴定，构建的重组质粒中正确插入目的基因片段。

3.1fhvqpcr检测方法的最终反应条件的确定

通过反复多次qpcr反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定了fhvpcr最佳反应体系(见表2)。最佳扩增条件：95℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。通过建立的体系以fhv毒株提取的dna作为模板，进行qpcr扩增，扩增出的基因片段大小与预期大小相符。pcr产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果与genbank发表的fhv基因序列的同源性在98.7～99.6％。

表2fhvqpcr反应体系

3.2标准阳性质控品的制备

阳性克隆经测序进行鉴定，测序结果与genbank中fhv-1标准株核苷酸序列进行比对，其同源性均为100％。说明成功制备了阳性质粒标准品，可作为荧光定量pcr检测的标准对照品。

3.3荧光定量pcr标准曲线的建立

以10倍梯度稀释的质粒浓度为1×10¹⁰拷贝/μl～1×10⁴拷贝/μl作为标准品进行扩增，可得到较整齐的扩增曲线(如图3)，扩增效率为1.904，斜率为-3.575，表明质粒浓度从10⁴～10¹⁰拷贝/μl具有良好的线性关系(如图4)。

对于溶解曲线的分析，温度在80℃时出现单一特异峰并且无引物二聚体及非特异性峰(如图5)。荧光定量pcr扩增完成后，pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，结果显示标准品均200bp处存在条带，与荧光定量pcr判定结果一致。

3.4sybrgreenipcr检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果

3.4.1荧光定量pcr检测方法特异性检测

荧光定量pcr对fhv-1基因组扩增的cq值均小于31，且扩增曲线明显，判定为阳性。阴性对照crfk细胞，为直线无扩增。荧光定量pcr对fpv、hsv-1、chv、prv的基因组作为模板进行扩增，均为直线无扩增，即判定为阴性。同时对上述荧光定量pcr扩增结果进行2％琼脂糖凝胶的电泳，结果表明，含有fhv-1基因组的样品均在约200bp处检测到特异性条带，其它4种猫病病毒基因组样品未检测到扩增片段，结果与荧光定量pcr判定结果一致。因此，说明本研究建立的fhv荧光定量pcr检测方法具有良好的特异性。

3.4.2荧光定量pcr检测方法敏感性检测

以稀释浓度范围分别为10^-1～10^-12的不同稀释度病毒基因组及其基因组的原液为模板进行fhv-1荧光定量pcr检测，并应用lightcycler480软件进行数据处理，得到的平均cq值。结果表明，fhv-1稀释度在10^-1～10^-6时能够得到有效扩增，平均cq值均小于31。对fhv的检测下限为10^-6稀释，相当于10²tcid50/ml。对上述荧光定量pcr扩增结果进行2％琼脂糖凝胶的电泳，浓度为10^-1～10^-6fhv-1基因组样品均检测到约206bp的条带。同理进行常规pcr检测及电泳分析，结果浓度为10^-1～10^-5的fhv-1种的基因组样品在大约200bp附近均存在一条特异性条带，与预期片段大小为206bp相符，因此其灵敏度到达稀释度为10³tcid50/ml。说明本研究建立的检测fhvsybrgreeni荧光定量pcr的方法具有较高的敏感性。

表不同稀释度fhv种的cq值

3.4.3荧光定量pcr检测方法重复性和稳定性检测

对10倍梯度稀释1×10¹⁰拷贝/μl～1×10⁴拷贝/μl的标准品进行荧光定量pcr的组内重复性试验级组间重复性试验，检测cq值的变异系数(cv％)均小于5％。证明本研究建立的荧光定量pcr检测方法重复性、稳定性良好。

本发明成功建立了一种fhvsybrgreeni荧光定量pcr检测方法，结果表明所建立的方法能快速准确地检测fhv。根据上述研究结果，本研究所建立的sybrgreeni荧光定量pcr检测方法具有很好的应用性。

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<110>青岛农业大学

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