一种用于检测霍乱弧菌的LAMP检测用引物组及检测方法与流程

技术领域：

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于检测霍乱弧菌的lamp检测用引物组及检测方法。

背景技术：
：

霍乱弧菌(vibriocholerae，vc)是引起霍乱的病原菌，在世界上曾引起多次大流行，给人们的生命财产造成巨大的损失。自然情况下，人类是vc的唯一易感者，主要通过被病原菌污染的水源或食物经口传染，临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率高，属于国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病。快速准确地诊断是及时发现疫情、迅速采取措施控制疫情的关键。目前，vc的检测方法主要有传统分离鉴定法、血清学方法、pcr方法、胶体金法等。传统的分离鉴定方法灵敏度和特异性虽然较高，但检测时间太长，至少需要3～5d，不适于快速检测要求；血清学方法主要用于vc细菌分型，以现有的血清检测，当新的血清型出现时，易发生漏检；pcr法虽然灵敏度高，但受设备、试剂盒、试剂等条件的限制，基层单位较难开展，不利于霍乱疫情的监测；免疫胶体金技术虽检测快速，没有特殊的实验室条件要求，但该技术阳性预测值低，最终确诊仍以细菌培养为准。因此，发展操作简便、快速准确、易推广的检测方法对霍乱疫情的监测与控制具有重要意义。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是notomi等人在2000年发明的一种新的恒温核酸扩增技术。传统的pcr技术离不开反复升降温这个耗时耗能的过程，且反应程序设定也较繁琐。相比之下，lamp技术克服了这些问题。根据lamp技术的原理，它可实现在恒温条件下(一般在60～65℃)快速连续扩增，实现了实验过程快速、简便，仪器设备简单、便携，检测结果特异性强、灵敏度高的优点。lamp扩增结果观察方式多，凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术，也可使用实时荧光法和实时浊度法，通过实时荧光pcr仪或实时浊度仪对扩增结果进行实时观察。

技术实现要素：
：

鉴于此，有必要设计一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉的检测霍乱弧菌的lamp检测用引物组，及利用该引物组检测霍乱弧菌的lamp检测方法。

一种用于检测霍乱弧菌的lamp检测用引物组，其特征在于，由内引物对fip/bip和外引物对f3/b3组成，fip、bip、f3、b3具体如下：

一种利用前述引物组检测霍乱弧菌的lamp检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品dna；

步骤2、配制lamp检测反应体系，反应体系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4；

步骤3、以步骤1中提取的dna为模版进行lamp扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。

优选的，lamp检测反应体系具体为：2×反应液rm12～13ul，fip、bip各3.7～4.3ul，f3、b3各0.4～0.6ul，bstdna聚合酶0.9～1.2ul，待测样品dna1.8～2.2ul，补超纯水至25ul。

优选的，fip、bip的浓度是40umol/l，f3、b3的浓度是5umol/l。

优选的，lamp扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，lamp扩增反应的反应温度为65.0℃且进行40min，lamp扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min。

上述的lamp检测方法中，检测结果通过实时浊度仪实时测量浊度值来判断核酸有无扩增。

本发明采用上述技术方案，根据霍乱弧菌基因rexa的序列，设计4条特异性lamp引物，用来建立霍乱弧菌lamp检测方法，结果表明，建立的lamp检测方法对霍乱弧菌的检测特异性良好，且方法的灵敏度高。本发明方法不受培养条件的限制，可在50min内完成核酸的检测。本发明对霍乱弧菌定性检测灵敏度可达到6.63×10⁴cfu/ml，优于一般pcr检测方法，其检测灵敏度是普通pcr的10倍。

附图说明：

附图1是lamp引物筛选试验图，no.1-7分别为空白对照、toxr引物组、vcc引物组、rexa引物组、reca引物组、nbpa-1引物组和nbpa-2引物组。

附图2是60℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图3是61℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图4是62℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图5是63℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图6是64℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图7是65℃时温度对lamp反应的影响试验图。

附图8是30min时时间对lamp反应的影响试验图。

附图9是40min时时间对lamp反应的影响试验图。

附图10是50min时时间对lamp反应的影响试验图。

附图11是60min时时间对lamp反应的影响试验图。

附图12是引物特异性鉴定试验图，no.2-8依次为霍乱弧菌、肠出血行大肠杆菌o157:h7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌扩增曲线图；left反应槽的no.1和right反应槽的no.9均为空白对照。

附图13是是引物特异性鉴定试验图，no.10-16依次为金黄色葡萄球菌、宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌扩增曲线图；left反应槽的no.1和right反应槽的no.9均为空白对照。

附图14是lamp反应灵敏度试验图，no.1为空白对照，no.2-8分别是菌液浓度为3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。

附图15是普通pcr反应灵敏度试验图，m为dl1000marker，n为空白对照，泳道1-7分别是菌液浓度为3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。

具体实施方式：

以下叙述中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、引物设计

按照lamp引物设计原则，根据genbank数据库中的霍乱弧菌特异基因组序列，进行多序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后通过分子生物学软件lampddesigner5设计6组引物，采用hplc纯化方式。合成后的引物用超纯水稀释成100pmol/pl溶液，-20℃保存备用。各引物序列见表1。

表1霍乱弧菌的lamp检测用引物

二、霍乱弧菌的lamp检测标准方法的建立

细菌基因组dna快速抽提试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，lamp扩增体系的2×反应液rm、bstdna聚合酶为荣研生物科技(中国)有限公司产品。

日本荣研lt-16alpha恒温扩增基因检测系统，abiveriti96wellthermalcycler核酸扩增仪、bioradgeldocxr凝胶成像系统。

霍乱弧菌实验用标准菌株购自中国工业微生物保存中心和北京路桥技术股份有限公司(见表2)。

表2实验用菌种名称及编号

1、样品dna的提取

样品为霍乱弧菌、eheco157:h7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌14株标准菌株的液体纯培养物。

dna的提取方法按照dna提取试剂盒说明书中关于细菌dna提取要求进行，具体步骤如下：

(1)吸取1ml过夜培养的细菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入400ulbufferdigestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。

(2)加入200ulbufferpb，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。

(3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。

(4)加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温静置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。

(5)加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10000rpm离心2min，弃上清。

(6)重复步骤5一次。

(7)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。

(8)得到的dna用50～100ultebuffer溶解。

获得的dna模板的260/280比值均在1.8-2.0之间,浓度在200-500ng/ul。提取的dna质量和浓度较高，适合后续的扩增反应。

2、lamp反应体系

反应体系为：2×反应液rm12.5ul，内引物fip、bip各4ul，外引物f3、b3各0.5ul，bstdna聚合酶1ul，dna模版2.0ul，补水至25ul。

内引物fip、bip的浓度是40umol/l，外引物f3、b3的浓度是5umol/l。

dna模版由各细菌的培养物提取而得。

3、最优引物的筛选

将表1的6组引物(nbpa-1、nbpa-2、reca、rexa、toxr、vcc)以霍乱弧菌dna为模板，在荣研lt-16alpha恒温扩增基因检测系统上同时进行lamp反应，并设空白对照，图1中no.1-7分别为空白对照、toxr引物组、vcc引物组、rexa引物组和reca引物组、nbpa-1引物组、nbpa-1引物组。

扩增反应的程序为：反应温度为65℃，反应时间为40min，反应结束后读取数值。结果显示，引物组rexa扩增开始时间(tt值)最早(见图1)，且曲线峰值高度(df)值最高，引物组rexa扩增开始时间(tt值)和曲线峰值高度(df值)具体数值见表3。

表3lamp引物筛选试验tt值和df值

4、lamp反应条件的优化

4.1、反应温度的优化:以上述筛选的最优引物组rexa作为扩增引物，以霍乱弧菌dna为模板，95℃酶失活2min，做6组对照，分别将反应混合物放在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反应条件下进行lamp反应，并设空白对照，附图2～7分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃扩增曲线图，left反应槽的no.1和right反应槽的no.9均为空白对照，反应时间为40min，反应结束后读取数值。结果显示，当反应温度为65℃时，扩增效果最好，各反应组扩增开始时间(tt值)和曲线峰值高度(df值)具体数值见表4。因此，引物组rexa扩增反应的最佳温度为65℃。

表4lamp反应温度优化试验tt值和df值

4.2、反应时间的优化：以上筛选的最优引物组rexa作为扩增引物，以霍乱弧菌dna为模板，以上述最优65℃为反应温度，95℃酶失活2min，做4组对照，分别将反应混合物放在30min、40min、50min、60min反应条件下进行lamp反应，并设空白对照，附图8～11分别为30min、40min、50min、60min扩增曲线图，left反应槽的no.1和right反应槽的no.9均为空白对照，反应结束后读取数值。结果显示，当反应时间为40℃时，扩增效果最好，用时最短，各反应组扩增开始时间(tt值)和曲线峰值高度(df值)具体数值见表5。因此，引物组rexa扩增反应的最佳温度为40min。

表5lamp反应时间优化试验tt值和df值

通过反复实验验证，对霍乱弧菌的lamp反应条件进行调整，调整优化后的lamp反应温度为65℃，反应时间为40min，95℃酶失活2min。

三、引物的特异性鉴定:

为了验证设计引物霍乱弧菌检测的特异性，用第二部分(检测标准方法的建立)所述反应体系和优化后条件，以13种霍乱弧菌细菌和一株阳性对照霍乱弧菌细菌培养物提取的dna为模板进行lamp扩增检测，并设置空白对照，no.2-8(a)依次为霍乱弧菌、肠出血行大肠杆菌o157:h7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌扩增曲线图，no.10-16(b)依次为金黄色葡萄球菌、宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌扩增曲线图，left反应槽的no.1和right反应槽的no.9均为空白对照，反应结束后读取数值。

检测结果见附图12～13，可以看出，只有以霍乱弧菌纯培养物提取的dna模板有扩增曲线出现，其他反应孔均无扩增曲线出现，其它样品为阴性。结果表明，引物组rexa对霍乱弧菌具有专一性，可用于对霍乱弧菌的特异性检测。

四、灵敏度实验：

1、原菌液浓度的定量

经37℃过夜培养的处于对数生长期的霍乱弧菌菌液，用生理盐水10倍系列稀释，平板菌落计数，推算原菌液浓度。通过平板菌落计数法测得霍乱弧菌原菌液浓度为6.63×10⁶cfu/ml，菌落计数结果见表6。

表6肠出血性大肠杆菌o157：h7平板计数

2、模板的稀释以及lamp反应：:将上一步骤中(原菌液浓度的定量)测得的原菌液依次做10倍梯度稀释，稀释度为10^-1-10^-7，分别标记为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号，然后每个稀释度取2ul作为模板,用第二部分(检测标准方法的建立)所述反应体系和条件进行lamp反应，反应结束后读取数值。同时，也使用传统的pcr方法进行扩增，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存反应产物，反应结束后，取反应产物进行凝胶电泳检测，pcr产物长度为211bp。

3、检测结果见附图14和附图15，图14中no.1为空白对照，no.2-8分别是菌液浓度为6.63×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml；图15中m为dl1000marker，n为空白对照，泳道1-7分别是菌液浓度为6.63×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。结果表明：传统的pcr扩增的敏感性测定结果1、2号泳道有特异性条带，其它泳道无特异性扩增，即pcr的扩增的最低灵敏度为6.63×10⁵cfu/ml。lamp扩增反应结果见附图14，no.1-3号反应孔有扩增曲线出线，及lamp扩增最低灵敏度为6.63×10⁴cfu/ml，与普通pcr相比，灵敏度提高了10倍。

通过以上实验最终确定了本发明的一种用于检测霍乱弧菌的lamp检测用引物组，由内引物对fip/bip和外引物对f3/b3组成，fip、bip、f3、b3具体如下：

一种利用前述引物组检测霍乱弧菌的lamp检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品dna；

步骤2、配制lamp检测反应体系，反应体系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4，2×反应液rm12.5ul，fip、bip的浓度是40umol/l且各4ul，f3、b3的浓度是5umol/l且各0.5ul，bstdna聚合酶1.0ul，待测样品dna2.0ul，补超纯水至25ul；

步骤3、以步骤1中提取的dna为模版进行lamp扩增反应，lamp扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，lamp扩增反应的反应温度为65.0℃且进行40min，lamp扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min，用实时浊度法鉴定扩增结果。

序列表

<110>宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心

<120>一种用于检测霍乱弧菌的lamp检测用引物组及检测方法

<170>patentinversion3.5

<160>4

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<212>dna

<213>人工序列

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