一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物及其鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物及其鉴定方法。

背景技术：

茶尺蠖和灰茶尺蠖是我国茶园中的重要害虫。他们同属于鳞翅目、尺蛾科、埃尺蛾属，亲缘关系极近。两者形态极为相似，发生区域和时间重叠，具有相同的寄主植物。生产上极容易混淆，干扰农田害虫预测预报的准确性。

据研究发现，茶尺蠖和灰茶尺蠖的卵、幼虫、蛹及成虫的相似性达到人类肉眼几乎无法辨别的程度。基于两者之间极近的亲缘关系，它们经常被科学家用于探究昆虫进化及物种形成的原因。然而如何去区分茶尺蠖和灰茶尺蠖是一直困扰昆虫学家的难题。因此，开发一种快速准确茶尺蠖和灰茶尺蠖的鉴定方法对生产和科研都有非常重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物及其鉴定方法的技术方案。

所述的一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物，其特征在于包括引物primer-f和primer-r，所述引物primer-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述引物primer-r的核苷酸序列如seqidno.2所示。

所述的一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以茶尺蠖与灰茶尺蠖组织为模板，采用引物primer-f和primer-r进行pcr扩增，所述引物primer-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述引物primer-r的核苷酸序列如seqidno.2所示；

2）对扩增产物采用限制性内切酶进行酶切；

3）对酶切产物进行电泳处理，通过琼脂糖电泳的条带数目来区分茶尺蠖与灰茶尺蠖，若电泳条带为一条则为茶尺蠖，两条为灰茶尺蠖。

所述的一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的方法，其特征在于所述限制性内切酶为fbai。

本发明根据茶尺蠖与灰茶尺蠖线粒体基因特定位点的差异性（fbai酶切位点“tgatca”的有无），通过琼脂糖电泳的条带数目来区分茶尺蠖与灰茶尺蠖：茶尺蠖没有fbai酶切位点，其酶切产物的电泳结果为一条带；灰茶尺蠖序列中存在fbai酶切位点，其酶切产物的电泳结果为两条带。

本发明具有以下有益效果：

1.操作简单。本发明使用的pcr及酶切技术均为传统的分子生物学技术，技术成熟，操作简单。

2.应用广泛。本发明可以用来鉴定任意时期和虫态的茶尺蠖和灰茶尺蠖。

3.准确性高。根据dna序列上的酶切位点突变来区分茶尺蠖和灰茶尺蠖，可以达到100%的准确率。

4.速度快且价格便宜。本发明采用昆虫组织作为pcr模板，并用酶切反应来区分茶尺蠖和灰茶尺蠖，可以在4个小时内得到结果。较以前的dna扩增并测序的方法，节省了dna提取和dna测序所需费用和时间。

附图说明

图1为本发明实施例1中室内饲养的茶尺蠖和灰茶尺蠖的鉴定；

图2为本发明实施例2中田间采集的茶尺蠖和灰茶尺蠖的鉴定。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1：室内人工饲养的茶尺蠖和灰茶尺蠖鉴定

1）合成以下引物：

primer-f：5’-aaatgttggtataaaattgggtctcc-3’（seqidno.1）

primer-r：5’-aatactattgtaaccgctcatgctt-3’（seqidno.2）。

2）分别取茶尺蠖和灰茶尺蠖成虫分别6头和4头。

3）取样品足部位的一小块组织，组织大小为：直径1mm、厚度0.7mm。

4）pcr扩增，反应体系如下：

反应程序为：98℃变性2min；进行35次循环扩增反应（98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸40s。）；12℃保持。

5）反应结束后取出pcr反应管，并进行酶切反应，反应体系为：

反应条件为：37℃反应1h。

6）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，电泳结束后在凝胶成像仪上成像。鉴定结果显示，茶尺蠖具有一条电泳条带，而灰茶尺蠖有两条（图1），且鉴定结果已知的结果一致，说明此方法准确率达到100%。

同时，对扩增产物测序后，茶尺蠖与灰茶尺蠖获得不同的dna序列，茶尺蠖的dna序列如seqidno.3所示，灰茶尺蠖的dna序列如seqidno.4所示。

实施例2：田间采集的茶尺蠖和灰茶尺蠖的鉴定

1）合成以下引物：

primer-f：5’-aaatgttggtataaaattgggtctcc-3’（seqidno.1）

primer-r：5’-aatactattgtaaccgctcatgctt-3’（seqidno.2）。

2）分别在杭州西湖区、绍兴和杭州余杭区茶园中采集昆虫幼虫（未知是茶尺蠖还是灰茶尺蠖）。

3）取样品臀足部位的一小块组织，组织大小为：直径1mm、厚度0.7mm。

4）pcr扩增，反应体系如下：

反应程序为：98℃变性2min；进行35次循环扩增反应（98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸40s。）；12℃保持。

5）反应结束后取出pcr反应管，并进行酶切反应，反应体系为：

反应条件为：37℃反应1h。

6）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，电泳结束后在凝胶成像仪上成像。从图2的鉴定结果显示，杭州西湖区（图2a）和余杭区（图2c）的样品中既有茶尺蠖也有灰茶尺蠖，而绍兴御茶村（图2b）的样品只有灰茶尺蠖。

sequencelisting

<110>中国农业科学院茶叶研究所

<120>一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物及其鉴定方法

<130>1

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

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<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

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<210>3

<211>539

<212>dna

<213>茶尺蠖

<400>3

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<213>灰茶尺蠖

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