一种新型恒温PCR‑反向斑点杂交基因检测方法与流程

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种新型恒温pcr-反向斑点杂交基因检测方法。

背景技术：

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸、皮肤或血液，只要能分离出dna，就能用pcr加以放大，进行比对。

现代分子生物学技术发展迅猛，以聚合酶链反应为代表的基于核酸的检测技术发展更为迅猛，然而pcr技术一直无法摆脱精密仪器设备的依赖、高洁净度要求的操作条件、反应时间过长等局限。此时以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到了迅猛的发展。等温扩增技术(isothermalamplificationtechnology)是一种核酸体外扩增技术，其特点是反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。与pcr相比，核酸等温扩增对仪器设备的要求大大降低，反应时间也大大缩短。目前技术较为成熟的等温pcr包括环介导等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增。

依赖核酸序列等温扩增是一种以rna为模板的基于rna序列的核酸扩增技术，该技术的基本原理是将基因的体外逆转录和转录过程偶联起来根据靶rna3端序列，带有t7启动子的特异引物，在该引物和逆转录酶的作用下生成rna-cdna杂交分子，接着t7rna聚合酶以带有t7启动子的cdna为模板，大量转录mrna，新生成的mrna在另一个特异引物的作用下，再次逆转录为cdna，此时新产生的cdna为第二特异引物和t7启动子间的序列片段。经过逆转录和转录之间不断往复的循环过程，最终能产生大量的单链dna。

反向斑点杂交是指将样品点在支持膜上进行分子杂交的技术。如将核酸点在能与核酸结合的膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等)上，经处理(如80℃烘烤、紫外光照等)使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交，用放射自显影或非放射性显色检测。可作定性或半定量分析。

目前在基因检测方面多采用测序或荧光pcr技术进行检测，但测序方法周期长，所需仪器成本高，操作环境要求严格，荧光pcr技术也有所需仪器成本高，操作环境要求严格等缺点，且pcr产物为dna，容易造成环境的污染，进而产生假阳性的结果。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种新型恒温pcr-反向斑点杂交基因检测方法。

本发明将恒温pcr与反向斑点杂交技术相结合，以rna为模板进行恒温pcr扩增，并对扩增产物进行反向斑点杂交检测。

根据本发明的实施例，本发明提供一种新型恒温pcr-反向斑点杂交基因检测方法，包括恒温pcr反应体系方法和反向斑点杂交体系方法。

所述的恒温pcr反应中，pcr反应液中上游和下游引物浓度均为200nm。

所述的pcr反应液中还包含有10×reactionbuffer、t7rna聚合酶、rntps、10×pcrbuffer、mmlv、rnasin。

所述的t7rna聚合酶反应终浓度为25-100u。

所述的rntps反应终浓度为15-25mm。

所述的mmlv反应终浓度为20-60u。

所述的rnasin反应终浓度为10-30u。

所述的10×pcrbuffer反应终浓度为1×pcrbuffer。

所述的pcr反应程序为37-50℃，35-55min。

所述的分子杂交体系方法包括以下步骤：

(1)含有不同特异性检测探针的尼龙杂交膜的制备。

(2)将固定有不同检测探针的尼龙膜置于杂交管中，加入1.5ml杂交液。

(3)向杂交液中加入10ul扩增产物，110rpm下，室温杂交100min。

(4)弃杂交液，用洗涤液洗膜15min，洗2次，每次8min。

(5)弃洗涤液，加入1100倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温反应25min。

(6)弃去酶液，用洗涤液洗膜15min，洗2次，每次8min。

(7)弃去底物，采用去离子水终止反应，待膜干燥后判定结果，出现蓝紫色斑点的为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。

所述的杂交液含有1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺。

所述的洗涤液含50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl。

所述的特异性检测探针采用生物素进行标记。

本发明的有益效果是：本试剂盒有效的将恒温pcr和反向斑点杂交相结合，操作简单、快速、灵敏度高且特异性强，对仪器设备和操作环境要求低、以rna为pcr扩增模板可有效避免核酸污染造成的假阳性检测结果，可有效缩短基因检测周期和成本，能够对各种基因的rna进行检测，可应用于多个领域，如基因分型，耐药性检测及致病菌检测等，具有广阔的应用前景。。

附图说明

图1为不同基因型bcr-abl融合基因恒温pcr扩增电泳图谱。其中a为b2a2基因型、b为b3a2基因型、c为e1a2基因型、d为e19a2基因型阴性对照扩增结果、e、f、g、h分别为b2a2基因型、b3a2基因型、e1a2基因型、e19a2基因型扩增结果，m为dl5000dnamarker。

图2为反向斑点杂交检测结果图。其中a为b2a2基因型、b为b3a2基因型、c为e1a2基因型、d为e19a2基因型检测结果。

具体实施方式

本发明将恒温pcr与分子杂交技术相结合，以rna为模板进行恒温pcr扩增，并对扩增产物进行分子杂交检测。

所述的恒温pcr反应中，pcr反应液中上游和下游引物浓度均为200nm。

所述的pcr反应液中还包含有10×reactionbuffer、t7rna聚合酶、rntps、10×pcrbuffer、mmlv、rnasin。

所述的t7rna聚合酶反应终浓度为25-100u。

所述的rntps反应终浓度为15-25mm。

所述的mmlv反应终浓度为20-60u。

所述的rnasin反应终浓度为10-30u。

所述的10×pcrbuffer反应终浓度为1×pcrbuffer。

所述的pcr反应程序为42℃，45min。

反向斑点杂交包括以下步骤：

(1)含有不同特异性检测探针的尼龙杂交膜的制备。

(2)将固定有不同检测探针的尼龙膜置于杂交管中，加入1.5ml杂交液(1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺)。

(3)向杂交液中加入10ul扩增产物，110rpm下，室温杂交100min。

(4)弃杂交液，用洗涤液洗膜2次，每次8min。

(5)弃洗涤液，加入1100倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温反应25min。

(6)弃去酶液，用洗涤液洗膜2次，每次8min。

(7)弃去底物，采用去离子水终止反应，待膜干燥后判定结果，出现蓝紫色斑点的为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。

所述的杂交液含有1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺。

所述的洗涤液含50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl。

所述的特异性检测探针采用生物素进行标记。

实施例1

本实施例以bcr-abl融合基因b2a2、b3a2、e1a2、e19a2四种基因型rna为模板进行检测，对照组在恒温pcr过程中不加入rna模板。

1.恒温pcr扩增：

其中恒温pcr反应中，pcr反应液中上游和下游引物浓度均为200nm、t7rna聚合酶反应终浓度为40u、rntps反应终浓度为120mm、mmlv反应终浓度为40u、rnasin反应终浓度为20u、10×pcrbuffer反应终浓度为1×pcrbuffer。

用于扩增b2a2融合基因的上游引物为5’-ggggctctatgggtttctga-3’(seqidno:1)。

用于扩增b2a2融合基因的下游引物为5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:2)。

用于扩增b3a2融合基因的上游引物为5’-ggattcctttgggtattttgtg-3’(seqidno:3)。

用于扩增b3a2融合基因的下游引物为5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:4)。

用于扩增e1a2融合基因的上游引物为5’-cggttgtcgtgtccgaggcca-3’(seqidno:5)。

用于扩增e1a2融合基因的下游引物为5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:6)。

用于扩增e19a2融合基因的上游引物为5’-ctgcccgagcccctcttcactg-3’(seqidno:7)。

用于扩增e19a2融合基因的下游引物为5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:8)。

pcr反应液总体积为50ul，pcr扩增程序为42℃，45min。

2.反向斑点杂交：

(1)含有不同特异性检测探针的尼龙杂交膜的制备，根据检测目的，将尼龙膜分为4行4列，以便每一行加相同的检测探针，检测探针均采用为生物素标记，每一列加相同的扩增产物。第一列检测b2a2融合基因的探针为5’-tggatttaagcagagttcaa-3’(seqidno:9)、第二列检测b3a2融合基因的探针为5’-acgcgcgtctacagggacacagct-3’(seqidno:10)、第三列检测e1a2融合基因的探针为5’-aacgatggcgagggcgccttccatgga-3’(seqidno:11)、第四列检测e19a2融合基因的探针为5’-ttctaccccaacttcgcagagggcat-3’(seqidno:12)。

(2)将固定有不同检测探针的尼龙膜置于杂交管中，加入1.5ml杂交液(1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺)。

(3)向杂交液中加入10ul扩增产物，110rpm下，室温杂交100min。

(4)弃杂交液，用洗涤液(50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl)洗膜2次，每次8min。

(5)弃洗涤液，加入1100倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温反应25min。

(6)弃去酶液，用洗涤液洗膜2次，每次8min。

(7)弃去底物，采用去离子水终止反应，待膜干燥后判定结果，出现蓝紫色斑点的为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。

3.实验结果：

在pcr扩增产物电泳结果中，b2a2(图1e)、b3a2(图1f)、e1a2(图1g)、e19a2(图1h)融合基因均有单一的电泳条带，而b2a2(图1a)、b3a2(图1b)、e1a2(图1c)、e19a2(图1d)融合基因扩增的阴性对照均无扩增产物电泳条带。对分子杂交结果进行观察，其中图2中a列为b2a2融合基因检测结果，b列为b3a2融合基因检测结果，c列为e1a2融合基因检测结果，d列为e19a2融合基因检测结果，均有相应杂交信号，说明可对目标基因进行分型检测。

本发明的目的在于提供一种新型恒温pcr-反向斑点杂交基因检测方法。将恒温pcr与反向斑点杂交技术相结合，以rna为模板进行恒温pcr扩增，并对扩增产物进行分子杂交检测。恒温pcr大大缩短了常规pcr的反应时间，以rna作为模板有效的避免了以dna为模板经常出现的实验环境污染进而产生的假阳性检测结果，采用反向斑点杂交作为检测方法有效的提高了检测的特异性，能够对各种基因的rna进行检测，可应用于多个领域，如基因分型，耐药性检测及致病菌检测等，具有广阔的应用前景。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

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<110>上海睿玻生物科技有限公司

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